16s_rdna菌種鑒定

1、16SrDNA方法鑒定細(xì)菌種屬一目的1. 掌握16SrDNA對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等實(shí)驗(yàn)操作。二、原理隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進(jìn)入到各種基因型分類水平，如(G+C)mol%、DNA雜交、rDNA指紋圖、質(zhì)粒圖譜和16SrDNA序列分析等。細(xì)菌中包括有三種核糖體RNA，分別為5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。16SrRNA對(duì)應(yīng)于基因組DNA上的一段基因序列稱為16SrDNA。5SrRNA雖易分析，但核苷酸太少，沒(méi)有足夠的遺傳信息用于分類研究；23Sr

2、RNA含有的核苷酸數(shù)幾乎是16SrRNA的兩倍，分析較困難。而16SrRNA相對(duì)分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，因此，現(xiàn)在一般普遍采用16SrRNA作為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序分析。在細(xì)菌的16SrDNA中有多個(gè)區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌通用物，可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段，并且這些引物僅對(duì)細(xì)菌是特異性的，也就是說(shuō)這些引物不會(huì)與非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來(lái)區(qū)分不同的菌。因此，16SrDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的

3、微生物的16SrDNA序列被測(cè)定并收入國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，這樣用16SrDNA作目的序列進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析更為快捷方便。1、16SrRNA普遍存在于原核生物中。rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)歷程中保持不變，可看作為生物演變的時(shí)間鐘。2、在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。3、16SrRNA的相對(duì)分子量大小適中，約1540個(gè)核苷酸，便于序列分析。4、可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,將16SrDNA片段

4、擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。利用16SrDNA鑒定細(xì)菌的技術(shù)路線:序列比對(duì)三、操作步驟(一)細(xì)菌基因組DNA提取1. 挑單菌落接種到10mLLB培養(yǎng)基中37C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。2. 取2mL培養(yǎng)液到2mLEppendorf管中，8000rpm離心2分鐘后倒掉上清液。3. 加140pLTE打散細(xì)菌，再加入60pL10mg/ml的溶菌酶。37C放置1

5、0分鐘。4. 加入400pLDigestionBuffer，混勻。再加入3pLProteinK,混勻，55C溫育5分鐘。5. 加入260pL乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱中。10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。6. 加入500pL70%乙醇(WashSolution)，10000rpm離心0.5分鐘。7. 重復(fù)第六步。8. 再10000rpm離心2分鐘徹底甩干乙醇。吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管。9. 加入50預(yù)熱(60C)的洗脫緩沖液，室溫放置3分鐘。12000rpm離心2分鐘，流下的液體即為基因組DNA。10. 電泳。取3溶液電泳檢測(cè)質(zhì)量。(二)PCR擴(kuò)增1. 根

6、據(jù)已發(fā)表的16SrDNA序列設(shè)計(jì)保守的擴(kuò)增引物。16S(F)5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316S(R)5-GGTTACCTTGTTACGACTT-32. PCR擴(kuò)增體系：在0.2mLEppendorf管中加入1LDNA，再加入以下反應(yīng)混合液:16S(R)10xPCRBuffer1L(10M)5LdNTP4LTaq酶0.5L加ddH2O使反應(yīng)體系調(diào)至50L,簡(jiǎn)單離心混勻。3. PCR反應(yīng)將Eppendorf管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴(kuò)增條件。擴(kuò)增條件為:94C3min94C30sec50C45sec72C100sec72C7min35cycles4. PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)拿

7、出Eppendorf管，從中取出5L反應(yīng)產(chǎn)物，加入1L上樣緩沖液，再加入4ul的ddO混勻。點(diǎn)入預(yù)先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中。電泳1hr。在紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。（三）擴(kuò)增片段的回收根據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為唯一條帶，可直接回收產(chǎn)物。否則從瓊脂糖凝膠中切割核酸條帶，并回收目的片段。1）稱量一2mL.的Eppendorf管質(zhì)量，記錄。2）在紫外燈下切割含目的條帶的凝膠，放入2mL的Eppendorf管內(nèi)，稱量。計(jì)算凝膠質(zhì)量。3）每100mg凝膠加入100BindingBuffer，混勻。60C溫育至凝膠融化。4）全部轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10柱中。10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。5）加入500BindingBuffer，10000rpm離心1分鐘，倒去收集管內(nèi)的液體。6）加入70%乙醇（WashSolution），10000rpm離心0.5分鐘。7）再10000rpm離心2分鐘徹底甩