制備感受態(tài)細(xì)胞的實驗報告

1、制備感受態(tài)細(xì)胞的實驗報告一、 實驗?zāi)康恼莆罩苽浠瘜W(xué)感受態(tài)細(xì)胞和電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法和步驟。二、 實驗原理1.感受態(tài)細(xì)胞的概念重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。    在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。    所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀

2、態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。    制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70保存（有效期6個月）。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。     受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊

3、方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。化學(xué)制備法：   大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法），該法最先是由Cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選

4、擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5×1062×107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒DNA，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價金屬離子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。物理制備法：   電轉(zhuǎn)法  （原理待續(xù)除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌

5、，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到1091010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。效價的計算公式：三、 實驗步驟1. 菌種活化菌種保存在70度的超低溫冰箱2. 前培養(yǎng)將單菌落接種到10ml的培養(yǎng)液中，在恒溫振蕩器37°下過夜培養(yǎng)3. 培養(yǎng)基的制備200ml液體培養(yǎng)基：加水150ml于燒杯中，加2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNacl定容200ml在磁力攪拌器中攪拌 200ml固體培養(yǎng)基：在液體的基礎(chǔ)上，加瓊脂3g在把液體與固體放到高壓滅菌鍋里 121 20minutes第二天接種菌液4ml到培養(yǎng)基中在恒溫振蕩箱中培養(yǎng)一夜 化學(xué)方法：（以大腸桿菌感受態(tài)制備為例） 1) &#

6、160;   測培養(yǎng)液（振蕩了一夜的）OD600 若<0.6A(在0.40.5之間即可)2)      每人取50ml 菌液到離心管 4000rpm 4 10 minutes，去上清液 3)     在菌體中加20ml中加0.1mol氯化鈣水溶液（目的：將細(xì)菌徹底懸浮分散開來）然后冰浴30min 離心4）倒上清液，加10ml 0.1 mol 氯化鈣(10%的甘油)懸浮后離心5）在收集菌體 加150ml 0.1mol氯化鈣懸浮6）分裝（40ml每管）液

7、態(tài)冷凍電 轉(zhuǎn)化1)    接種：在200ml的LB液體培養(yǎng)基加入1ml的前培養(yǎng)  2)培養(yǎng)：OD值在 0.40.5之間即可 離心后 將已培養(yǎng)好的放到冰里搖晃    3) 水洗1 加水3040ml 懸浮 離心 水倒掉 水洗2 加20ml水     離心 水倒掉 水洗3 加10ml水 離心 水倒掉4)     甘油10%洗2次（每次加5ml）中間離心兩次 在第二次加甘油懸浮后離心后加120u

8、LGYT懸浮液5)       一個人準(zhǔn)備4個小管子（每個40uL 扔到液氮速凍 放到-70保存）效價檢測：根據(jù)加入2uL的菌體液體培養(yǎng)出的菌落數(shù)若為N個，則計算效價X的公式推導(dǎo)為N/X=1000/1010則x=N*107效價：指能用1ug的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)化出的菌落數(shù)。具體步驟化學(xué)效價檢測A.把感受細(xì)胞從超低溫冰箱中拿出(冰水先準(zhǔn)備好再拿出感受態(tài)細(xì)胞在冰水中慢慢溶化)B.加1uL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒于40uL的感受細(xì)胞中（用手指輕彈）C.在42的干式恒溫器90秒 (熱休克)D再放到冰上2分中 不超過2分E之后迅速加入已預(yù)熱好的37LB160uL

9、復(fù)蘇45分F.播盤:2uL （200uL能長105個，所以2uL103 到達(dá)106即可用 (50Ul100Ul 若這里不能長到106則不可用)電轉(zhuǎn)化效價1. 取Pug19uL加入感受態(tài)細(xì)胞再將此移到電擊杯2. 下電擊杯，讓液體到底部3. 在將電擊杯放入電擊轉(zhuǎn)化儀電擊下，再加入160uL預(yù)熱好的LB4. 再用移液槍200多uL從電擊杯總吸出放出10mL管中 (封住)5. 再放到恒溫振蕩箱60min 四實驗結(jié)果化學(xué)檢測結(jié)果 菌數(shù) 4*107電轉(zhuǎn)化檢測結(jié)果 菌數(shù)109五實驗分析步驟至關(guān)重要，在播盤的過程中，注意一些操作，不然會導(dǎo)致實驗結(jié)果的偏差。懸浮細(xì)胞時要小心，用槍頭輕輕吹起細(xì)胞即可，否則會影響細(xì)

10、菌活性涂布前玻璃棒要充分冷卻，不然會因為溫度過高而燙死細(xì)菌涂布時，盡量每個角落都要涂到，在一個角落涂布后，要順時針90度再涂布，連續(xù)轉(zhuǎn)兩次*注意無菌操作操作過程中要盡量迅速以確保細(xì)菌細(xì)胞的活性六討論為了提高轉(zhuǎn)化效率，試驗中要考慮一下幾個重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度3. 試劑的質(zhì)量4. 防止雜菌和雜DNA的污染 可修改 歡迎下載 精品 Word親愛的用戶：煙雨江南，畫屏如展。在那桃花盛開的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽光，心情像桃花一樣美麗，感謝你的閱讀。1、最困難的事就是認(rèn)識自己。22.2.142.14.202222:5122:51:162月-2222:512、自知之明是最難得的知識。二二二二二二年二月十四日2022年2月14日星期一3、越是無能的人，越喜歡挑剔別人。22:512.14.202222:512.14.202222:5122:51:162.14.202222:512.14.20224、與肝膽人共事，無字句處讀書。2.14.20222.14.202222:5122:5122:51:1622:51:165、三軍可奪帥也。星期一, 二月 14, 2022二月 22星期一, 二月 14, 20222/14/20