苦參總黃酮體內(nèi)外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究

1、苦參總黃酮體內(nèi)外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究 Objective: To explore the antitumor activities of kushen (Sophora flavescens) flavonoids (KS-Fs) in vivo and in vitro. Methods: Cell proliferation was assayed by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. H22 hepatocellular carcinoma and S180 sarcoma were induced in ICR mice.

2、 Lewis lung carcinoma was induced in C57BL/6 mice. H460 and Eca-109 tumor were induced in Balb/c nude mice by injecting 5105 or 5106 tumor cells in the right flank, respectively. Results: KS-Fs could inhibit the growth of a variety of human tumor cell lines (A549, SPC-A-1, NCI-H460, etc.) in vitro.

3、The antitumor efficacies were confirmed in the mice models of H22, S180 and Lewis lung tumors and the nude mice models of human H460 and Eca-109 xenografted tumors. The oral or intravenous maximum tolerated dose of KS-Fs was more than 2.8 g/kg or 750 mg/kg respectively, far more than the oral medial

4、 lethal dose of kushen alkaloids (1.18 g/kg). No adverse reactions were observed. Conclusion: These results suggest that KS-Fs or kurarinone may be developed as a novel antitumor agent. Keywords: Sophora flavescens; flavones; antineoplastic agents; mice 苦參（Sophora flavescens Aiton）為豆科槐屬植物，是 中國 傳統(tǒng)常用中

5、藥之一，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列為中品，常用于 治療 急、慢性炎癥和癌癥等疾病?？鄥⒅饕猩飰A和黃酮兩大類化學(xué)成分1。1992年以苦參堿和氧化苦參堿為主的苦參總堿注射液嗎特靈（92）衛(wèi)藥試字X-10（2）號已作為抗腫瘤藥批準(zhǔn)上市。相對于苦參堿，苦參黃酮的研究較遲。現(xiàn)已從苦參根中分離出56種黃酮類化合物，其中大部分化合物的A環(huán)上存在異戊烯基側(cè)鏈2-14。研究表明異戊烯基側(cè)鏈黃酮有抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤（體外）等生物活性2-14。 一系列從苦參中分離出的含異戊烯基側(cè)鏈的苦參黃酮在體外對一些人腫瘤細(xì)胞株有細(xì)胞毒活性，例如人白血病HL-602、K562，小鼠白血病L121010，人乳腺癌MCF-7

6、11，非小細(xì)胞肺腺癌A549，卵巢癌SKOV-312、1A99，皮膚黑素瘤SK-MEL-2，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤XF498，腸癌HCT12，子宮頸癌HeLa10，鼻咽上皮癌KB，KB-Vin（drug-resistant variant KB）等細(xì)胞株10。這些黃酮還可以抑制一些酶的活性，例如phospholipase C17，diacylglycerol acyltransferase9，13，tyrosinase5，14，testosterone 5-reductase6，cGMP phosphodiesterase 58。但苦參黃酮在體內(nèi)是否有抑制腫瘤作用，目前國內(nèi)外均沒有相關(guān)報(bào)道。 本研究

7、提取分離苦參總黃酮（kushen flavonoids, KS-Fs）和苦參酮（kurarinone, Kur），檢測KS-Fs和Kur對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并比較KS-Fs與市售苦參堿（kushen alkaloids, KS-As）制劑（主要成分為苦參生物堿或氧化苦參堿）的細(xì)胞毒作用。考察KS-Fs和Kur對小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌及裸小鼠人移植腫瘤非小細(xì)胞肺癌H460和食管癌Eca-109的影響。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 藥物 苦參飲片，雷允上醫(yī)藥有限公司，經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦參的根，苦參堿含量大于2%，符合中華人民共和國藥典1995年版規(guī)定?？鄥?/p>

8、素（kushenin），寧夏制藥廠；苦參堿注射液，廣州明興制藥廠。體外實(shí)驗(yàn)：將KS-Fs和Kur用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配制成20 mg/ml儲備液，20 貯存，臨用時(shí)用相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到所需終濃度。體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)：將KS-Fs和Kur用5% DMSO和9% Cremophor EL助溶后，加85%蒸餾水配成溶液。急性毒性實(shí)驗(yàn)注射配方：用10% DMSO和18% Cremophor EL溶解到最大濃度，加蒸餾水配成終濃度為50 mg/ml溶液。急性毒性實(shí)驗(yàn)口服配方：20%聚乙二醇（PEG 400），18% Cremophor溶解到最大濃度，加蒸餾水配制成混

9、懸液，終濃度為70 mg/ml。注射用環(huán)磷酰胺（cytoxan, CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為04061821；注射用順鉑（cisplatin），齊魯制藥有限公司，批號為04051241；臨用時(shí)用生理鹽水稀釋。 1.1.2 細(xì)胞株 肺癌A549、SPC-A-1、NCI-H460（H460）、H446，人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7，子宮頸癌HeLa，腸癌HCT-116、HT-29、SW-620和CaCo-2細(xì)胞株，均購自美國菌種細(xì)胞保藏?cái)?shù)據(jù)庫（American Type Culture Collection, ATCC）；白血病HL-60、食管癌Eca-109、胃癌BG

10、C-823和肝癌SMMC-7721細(xì)胞株以及小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌細(xì)胞，均購自中國 科學(xué) 院細(xì)胞生物研究所。 1.1.3 動物 Balb/c-nu/nu裸小鼠，雄性，68周齡，1822 g，上海市腫瘤研究所，合格證號：2002-0001。雌性ICR、C57BL/6小鼠，2022 g；昆明鼠，雌雄各半，2022 g。均購自斯萊克動物中心，合格證號：2003-0003。 1.1.4 試劑 伊思考夫改良杜爾貝可培養(yǎng)基（Iscoves modified Dulbeccos medium, IMDM）、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbeccos modified Eagles m

11、edium, DMEM）、1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.05%胰酶-乙二胺四乙酸，來自GIBCO公司；青霉素、鏈霉素、DMSO、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）和Cremophor EL，為Sigma公司產(chǎn)品。 1.2 方法 1.2.1 KS-Fs和Kur的分離提取 由和記黃埔醫(yī)藥有限公司提取鑒定。將苦參飲片粉碎成粗粉，10倍量95%乙醇滲漉，滲漉液經(jīng)減壓濃縮，加水以石油醚萃取，回收后得到KS-Fs粗提物。乙醇重溶解，過大孔樹脂得到KS-Fs，紫外分光光度計(jì)檢測（ultraviolet rays, UV）方法檢測黃酮含量和純度。KS-Fs經(jīng)過

12、聚酰胺和硅膠柱聯(lián)用層析分離提取得到Kur。 5 kg苦參用乙醇滲漉、溶劑萃取得到KS-Fs粗提物126 g，得率為2.52%，黃酮含量超過55%。乙醇重溶解，過大孔樹脂得到KS-Fs，UV方法檢測黃酮含量，純度超過80%。KS-Fs經(jīng)過聚酰胺和硅膠柱聯(lián)用層析分離提取得到Kur。KS-Fs主要含有Kur，降苦參酮（norkurarinone, NKur）和二甲氧基苦參酮（2-methoxy-kurarinone, MKur）及其他黃酮，其中Kur、NKur和MKur的含量分別是29.5%、4.6%和1.4%。見圖1。 圖1 KS-Fs的高效液相圖譜和主要化合物結(jié)構(gòu) Figure 1 High-p

13、erformance liquid chromatograms and chemical structures of compounds in KS-Fs 1.2.2 KS-Fs和Kur在體外對腫瘤細(xì)胞株的抑制作用 將（0.51）105個(gè)生長至對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞在37 ，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換成含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，其中KS-Fs、Kur和其他待測藥物按梯度濃度加入，共設(shè)8個(gè)濃度，每孔中藥物溶劑（DMSO或水）的體積不超過1%總體積。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法檢測15。以溶劑孔為對照，數(shù)據(jù)用XLfit Wizard 軟件 分析， 計(jì)算

14、各藥物對細(xì)胞生長抑制的半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration, IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 1.2.3 KS-Fs和Kur體內(nèi)抗腫瘤作用 1.2.3.1 小鼠腫瘤模型的建立 小鼠S180肉瘤、H22肝癌和Lewis肺癌細(xì)胞，采用中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所推薦的培養(yǎng)基和血清濃度培養(yǎng)在2575 ml培養(yǎng)瓶中，置于37 ，5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。 分別收集對數(shù)生長期S180和H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5106/ml。ICR小鼠腹腔注射細(xì)胞懸液，每只0.2 ml。體內(nèi)腹水傳兩代后，無菌條件下抽取生長良好的S180肉瘤或肝癌H22小鼠腹水，用生理鹽水稀釋至5106

15、/ml，充分混勻種植于小鼠右前腋下，每只0.2 ml。 收集對數(shù)生長期Lewis肺癌細(xì)胞，以5106/ml種植于C57BL/6小鼠右前腋下，每只0.2 ml。動物種植腫瘤細(xì)胞后，每天觀察小鼠情況，待腫瘤長出后，每隔23 d測量腫瘤直徑，并估計(jì)腫瘤質(zhì)量。體內(nèi)傳兩代后，待Lewis肺癌瘤塊長到直徑大約1 cm左右時(shí)，選取腫瘤生長旺盛，無潰破的腫瘤，在無菌條件下剝離腫瘤，去除壞死部分，剪成約1.52.0 mm3大小 組織 塊，皮下接種于68周齡健康的雌性C57BL/6小鼠右側(cè)腋下。 1.2.3.2 裸鼠腫瘤模型的建立 收集對數(shù)生長期的H460和Eca-109細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5105/ml或5106

16、/ml，無菌注射于Balb/c-nu/nu裸鼠右側(cè)背部近腋窩處，每只0.2 ml。裸鼠在標(biāo)準(zhǔn)無菌 環(huán)境 下飼養(yǎng)，每天觀察并測量腫瘤直徑，待腫瘤直徑大約為1cm左右時(shí)，保種傳代。腫瘤體積計(jì)算公式：V=（W2L）/2，W代表腫瘤的寬度，L代表腫瘤的長度16。在無菌條件下自保種傳代的H460或Eca-109裸鼠中剝離腫瘤，剪成約1.52.0 mm3大小組織塊，分別皮下接種于Balb/c-nu/nu裸鼠右側(cè)腋下，腫瘤塊體積大致相等。 1.2.3.3 分組、給藥、測量和取材 小鼠接種H22肝癌第2天，將小鼠隨機(jī)分組，設(shè)KS-Fs溶劑對照組，KS-Fs高（500 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（20 mg/kg）劑量組，CTX（30 mg/kg）陽性對照組。小鼠接種S180肉瘤第2天，Lewis肺癌小鼠腫瘤長至150 mm3左右時(shí)（接種后第8天），