兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系

1、壁剖堂盟窒堅(jiān)至筮塹鲞箜！塑叢煎墜：咝：巡塹：！論著兔實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系李國營劉靖田素民于連發(fā)郭志坤（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，新鄉(xiāng)）【摘要】目的探討實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞是否凋亡及凋亡率的大小。方法阻斷左冠狀動(dòng)脈的左室支建立家兔心肌缺血模型，達(dá)到預(yù)定的缺血時(shí)間后，使血管再通，建立心肌的缺血再灌注模型。采用透射電鏡、原位末端探針標(biāo)記，圖像分析，對(duì)缺血再灌注損傷區(qū)心肌細(xì)胞的損傷情況進(jìn)行研究。結(jié)果電鏡觀察顯示缺血再灌注損傷區(qū)呈現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞凋亡征象，檢測結(jié)果顯示缺血再灌注損傷區(qū)出現(xiàn)心肌凋亡陽性細(xì)胞，平均凋亡率為。結(jié)論心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生與凋亡機(jī)制有關(guān)，并可能是

2、其發(fā)生的重要原因?！娟P(guān)鍵詞】缺血再灌注損傷；超微結(jié)構(gòu)；凋亡；原位末端標(biāo)記；兔蚴，勱疏酰伽刪，瓜凡婦胱出劃，西厶叫昭，厶皿，【】，】仃（，【】；近年來，臨床上對(duì)心肌缺血性疾病的治療取得亡機(jī)制發(fā)生的關(guān)系。了重要進(jìn)展。如冠狀動(dòng)脈的搭橋術(shù)、溶栓療法、心臟體循環(huán)方法的建立等，這些方法的應(yīng)用使對(duì)心臟缺材料與方法血性疾病的治療，提高到一個(gè)新的水平。所有這些家兔心肌缺血再灌注損傷模型的制備療法使心臟經(jīng)歷了一個(gè)同樣性質(zhì)的過程，即缺血后選擇雄性家兔只（雄性心臟表面沉積脂肪較恢復(fù)血流灌注。但是，理論研究和臨床實(shí)踐都證實(shí)，少動(dòng)脈血管清晰易辨），體重，的氨基有時(shí)在成功恢復(fù)心臟血流，即心肌得到血液再灌注甲酸乙酯按耳緣靜脈

3、麻醉。開胸暴露心后，不僅功能未得到恢復(fù)，反而使心肌損傷加重，出臟，保持胸膜腔完好，動(dòng)物行自主呼吸（如傷胸膜腔現(xiàn)心率失常，梗塞面積擴(kuò)大等，這就是心肌的缺血再行呼吸機(jī)替代）。找出左冠狀動(dòng)脈的左室支。眼科灌注損傷【，。這種損傷很難區(qū)別于缺血性損傷，或的針線縫扎左室支，內(nèi)徑為人們對(duì)持續(xù)的、嚴(yán)重的缺血導(dǎo)致心肌壞死沒有疑義，的硅膠管套線，束緊后在貼緊硅膠管的上端用止血但在再灌注本身是否引起這種不可逆的致死性損害鉗夾緊線，造成心肌缺血。心電圖出現(xiàn)明顯的段存有較大的爭議【，。本研究旨在利用實(shí)驗(yàn)性心肌抬高（、導(dǎo)聯(lián)）。缺血后，夾線鉗松缺血再灌注損傷模型研究缺血再灌注損傷與心肌凋開，去掉硅膠管，抽出結(jié)扎線，原結(jié)扎血

4、管恢復(fù)再通，基金項(xiàng)目：河南省衛(wèi)生廳資助課題（）缺血再灌注模型建立。再灌注后，剪取心臟，河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室在心肌缺轎再灌注損傷區(qū)取材，作為光鏡、電腦和原生理教研室位末端標(biāo)記材料。萬方數(shù)據(jù)光鏡標(biāo)本處理多聚甲醛緩沖液固定，流水沖洗，蒸溜水浸洗。上行酒精脫水至，二甲苯透明、浸蠟包埋、常規(guī)切片、伊紅染色、光鏡觀察。原位末端標(biāo)記染色方法本實(shí)驗(yàn)所用凋亡檢測試劑盒由德國公司提供。方法如下：（）常規(guī)石蠟組織切片（玻片須經(jīng)防脫處理），脫蠟入水，洗×次。（）加的蛋白酶溶液于組織切片上，約片，孵育，洗次。（）用新鮮配制的覆蓋切片，室溫孵育，洗×次。（）加一枸緣酸鈉混合液，孵育，洗

5、5;次。（）加反應(yīng)液，片，濕盒孵育，洗×。（）用新鮮配制的覆蓋切片，室溫卵育，洗×次。（）加新鮮配制的顯色液覆蓋切片，室溫下孵育。（）常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢，細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色顆粒者，為染色陽性的凋亡細(xì)胞。陽性反應(yīng)定量測定將反應(yīng)切片經(jīng)高清晰自動(dòng)圖像分析儀處理。取例樣本中染色切片各張，每張隨機(jī)選取兩個(gè)視野，總計(jì)個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞總數(shù)。用同一部位染色組織切片在同一放大倍數(shù)下隨機(jī)選取個(gè)視野計(jì)算出細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞平均凋亡率（心肌凋亡細(xì)胞總數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)的比）。超微結(jié)構(gòu)觀察（）瑚的組織塊在的戊二醛磷酸緩沖液內(nèi)固定，保存，沖洗。（）的鋨酸緩沖液后固定，沖洗。（）酒精上行脫水至

6、，然后無水丙酮脫水×。（）樹脂包埋，常規(guī)方法制備超薄切片，載膜銅網(wǎng)撈片，醋酸雙氧鈾和檸蒙酸鉛雙重染，日本一透射電鏡觀察拍照。結(jié)果染色光鏡及電鏡觀察結(jié)果正常供血區(qū)心肌細(xì)胞染色及電鏡觀察顯示正常心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。缺血再灌注損傷區(qū)可見核濃度、核變小。核膜皺縮、異形，有偽足樣突起。染色質(zhì)凝集成塊，邊集等典型的凋亡細(xì)胞特征（圖萬方數(shù)據(jù)堡型堂盟筮堅(jiān)堡箜塹鲞筮！塑叢煎墜：螋：型塹：）。也可見染色質(zhì)凝集不完全，核固縮，核異形等較輕型早期細(xì)胞凋亡的特征（圖）。原位末端標(biāo)記及定量結(jié)果缺血再灌注損傷區(qū)心肌可見染色陽性細(xì)胞，棕褐色的染色質(zhì)凝聚明顯，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。有的整個(gè)細(xì)胞核都呈現(xiàn)棕褐色，有的沿核膜呈新

7、月形凝集，有的呈梭形或啞鈴形凝集，有的顯現(xiàn)不軌現(xiàn)凝集，體現(xiàn)了處于不同階段的凋亡細(xì)胞的多形性（圖、）。對(duì)染色切片的定量結(jié)果為：樣本各取一張切片，每張隨機(jī)選取個(gè)視野，總計(jì)個(gè)視野中凋亡細(xì)胞總數(shù)個(gè)，細(xì)胞總數(shù)個(gè)，平均凋亡率為。正常供血區(qū)及本實(shí)驗(yàn)所做的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示為陰性。討論持續(xù)性的心肌缺血可導(dǎo)致心肌壞死，并可進(jìn)一步導(dǎo)致心力衰竭和死亡。限制和解除心肌缺血性疾病最有效方法是恢復(fù)血流灌注，但再灌注本身也會(huì)引起心肌的損害。目前理論研究和臨床實(shí)踐都證實(shí)了缺血再灌注損傷的存在，但在再灌注本身是否會(huì)引起這種致死性損害，以及再灌注損傷的機(jī)制等方面存有較大的爭議【。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌缺血再灌注模型，利用透射電鏡、原位末端

8、標(biāo)記技術(shù)、自動(dòng)圖像分析儀及統(tǒng)計(jì)處理對(duì)缺血再灌注損傷區(qū)心肌進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷區(qū)心肌細(xì)胞有核濃縮、核變小、核膜皺縮、染色質(zhì)凝集成快的典型凋亡細(xì)胞的特征。也有核膜輕度異形，細(xì)胞染色質(zhì)凝聚不完全，部分已凝聚的染色質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，核固縮不明顯等心肌細(xì)胞凋亡早期的征象。原位末端標(biāo)記顯示該區(qū)有較多的染色陽性細(xì)胞，凋亡率為。這說明在心肌缺血一定的時(shí)間后，給予血流再灌注，誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這可能是由于再灌注后雖然心肌得到了氧的供應(yīng)，但增加了氧自由基的形成，也加重了鈣離子的超載，從而觸發(fā)了心肌細(xì)胞凋亡的始發(fā)環(huán)節(jié)及核酸內(nèi)切酶激活途徑。內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶將核小體間降解，使之?dāng)嗔褳楣押诵◇w產(chǎn)生了不

9、同倍數(shù)的堿基對(duì)核酸片段，并表現(xiàn)為斷裂的染色質(zhì)凝聚，邊集帕娟。因而在缺血再灌注損傷的病理損害表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞的特征，這與單純的心肌缺轎性損傷機(jī)制不同舊。這說明心肌的缺血再灌注損傷是在心肌缺血性損傷的基礎(chǔ)上又誘發(fā)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，產(chǎn)生了心肌凋亡細(xì)胞。并可能是心肌缺血后再灌注產(chǎn)生繼發(fā)堡麴堂煎塞！絲生筮塹鲞箜！塑叢墮墮：避：壩塹：！性損傷也即缺血再灌注損傷的主要原因。正常供血區(qū)心肌組織的光、電鏡結(jié)構(gòu)正常，原位末端標(biāo)記檢測未見陽性細(xì)胞。這說明在缺血再灌注血管所支配區(qū)域以外的心肌組織由于存在正常的血液循環(huán)而未受模型制備的影響，這說明了模型制備及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和可靠性。本實(shí)驗(yàn)研究利用缺血再灌注損傷模

10、型，應(yīng)用透射電鏡、原位末端標(biāo)記、圖像分析和統(tǒng)計(jì)處理對(duì)缺血，：，：，：，：，再灌注損傷區(qū)的心肌凋亡情況進(jìn)行了定性和定量研、究，從超微結(jié)構(gòu)和原位末端標(biāo)記兩方面證實(shí)了缺血再灌注損傷時(shí)存在心肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，這也證明心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了缺血再灌注損傷。這對(duì)進(jìn)，：一步研究缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制和治療心肌缺血性損傷時(shí)預(yù)防再灌注損傷的發(fā)生具有重要的理論和實(shí)踐意義。（本文圖見圖版）參考文獻(xiàn)馮新為主編病理生理學(xué)北京：人民衛(wèi)生出版社，：，：，：肛，：（收稿日期：）圖版說明圖缺血再灌注再灌注中心區(qū)心肌組織超微結(jié)構(gòu)圖缺血再灌注再灌注交界區(qū)心肌組織超微結(jié)構(gòu)××圖缺血再灌注再灌注中心區(qū)心肌組織，染色圖缺血再灌注再灌注交界區(qū)心肌組織，染色×（上接頁）在數(shù)量還是在神經(jīng)元總面積上都比參考文獻(xiàn)出），的表達(dá)更多，說明背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元含有較為豐富的通道，可能是其對(duì)保持神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外濃度的差異有重要的作用。在正常狀態(tài)下通道的開放，使神經(jīng)元細(xì)胞膜主要對(duì)有通透性，所以，通道可能是產(chǎn)生和維持背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元靜息電位的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。背根神經(jīng)節(jié)是通過怎樣的途徑使和型鉀通道開放？鉀通道開放以后又通過什么具體途徑導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生和外周傳人相關(guān)的物質(zhì)？這些工作的完成，將全面揭示和型鉀通道在外周傳人過程中的作用。我們的實(shí)驗(yàn)為外周傳人機(jī)制的