神奇的熒光納米材料量子點(diǎn)在生物體系中的應(yīng)用

1、神奇的熒光納米材料量子點(diǎn)在生物體系中的應(yīng)用關(guān)鍵字：染料，熒光團(tuán)，F(xiàn)RET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，納米顆粒，熒光量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是運(yùn)用熒光蛋白、傳統(tǒng)有機(jī)染料和其它染料作為熒光探針來研究蛋白構(gòu)象、蛋白相互作用的一種實(shí)用技術(shù)，它能檢測(cè)到小于納米級(jí)的距離變化。以往的熒光蛋白、有機(jī)染料和鑭系金屬染料分子由于其窄的吸收光譜、帶長尾的寬發(fā)射光譜和非常低的光淬滅域限，且在吸收峰和發(fā)射峰之間不存在大的斯托克斯偏移1, 2，因此，還不是FRET體系最佳的供體和受體。只有選擇合適、理想的供體、受體分子才能保證高的能量轉(zhuǎn)移效率和精確的測(cè)量數(shù)據(jù)。半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)由于其可調(diào)諧的狹窄的激發(fā)波長和遠(yuǎn)離

2、激發(fā)峰的發(fā)射以及抗漂白性的優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，并可以同時(shí)連接多個(gè)染料分子，使其比有機(jī)熒光分子更好地適用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的研究體系。量子點(diǎn)既可以作為FRET供體，也可以作為它的受體3。但最近有文獻(xiàn)報(bào)道量子點(diǎn)作為FRET受體幾乎看不到能量的轉(zhuǎn)移，他們認(rèn)為主要是因?yàn)榱孔狱c(diǎn)長的激活壽命和受體染料分子短暫的激發(fā)時(shí)間。在近幾年，基于量子點(diǎn)的FRET研究得到了廣泛的證實(shí)和應(yīng)用4-6，在這里我們將為大家簡(jiǎn)單地介紹量子點(diǎn)的特性、化學(xué)合成以及基于量子點(diǎn)的FRET在研究核酸檢測(cè)，免疫分析，生物分子相互作用，分子構(gòu)象的變化，生物傳感器和癌癥研究等方面的應(yīng)用。1. 量子點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)太空恒星之間并不是一無所有，1980年宇航員

3、注意到從顆粒狀的塵云或者星云上反射到我們銀河系的恒星光譜都充滿寬寬的紅色帶。很長一段時(shí)間里，這種來自星云和銀河系其他地方的塵埃發(fā)射的熒光對(duì)人們一直保持著神秘色彩，很長一段時(shí)間世界上任何一個(gè)天文實(shí)驗(yàn)室的研究人員無法揭示這種具有奇異光學(xué)性質(zhì)的顆粒組成?？墒呛髞恚瑏碜詺W洲和美國的兩個(gè)研究小組，出乎意料地分別提出了下面這個(gè)很相近的觀點(diǎn)這種發(fā)射紅色光譜的塵埃可能就是量子點(diǎn)。什么才是量子點(diǎn)？這個(gè)術(shù)語首先被上個(gè)世紀(jì)80年代在美國Bell實(shí)驗(yàn)室一起工作的物理學(xué)家Daniel Chemla和David Miller所提出。這個(gè)術(shù)語指的是直徑非常小近似球形的半導(dǎo)體晶粒（宇宙塵埃就是硅顆粒的一個(gè)例子）。量子點(diǎn)常常被

4、看作是納米晶粒（他們至少有其他10個(gè)化名，比如人造原子，量子晶體和納米點(diǎn)等等），也被當(dāng)作是膠體顆粒。圖1.1 量子點(diǎn)的限域效應(yīng)量子點(diǎn)有一個(gè)非常奇特的最基本特征：它的光學(xué)行為依賴于它的尺寸（圖1.1A）。比如，在紫外燈照射下，2.3nm的CdSe量子點(diǎn)發(fā)射青綠色光，而5.5nm的相同材料組成的量子點(diǎn)卻發(fā)射桔紅色的光。1967年，紐約Eastman Kodak公司的Chester Berry第一次報(bào)道了這種奇異的現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)他是在觀察銀鹵化物沉淀時(shí)發(fā)現(xiàn)的，可是當(dāng)時(shí)一直沒人注意到這點(diǎn)，就連Berry本人也沒在意他的發(fā)現(xiàn)。直到十年之后，也就是在20世紀(jì)80年代早期，許多研究小組再次觀察到了這種效應(yīng)，首先

5、是在氯化銅鑲嵌玻璃中發(fā)現(xiàn)的。后來在硫化鎘的膠體顆粒制備中（硫化鎘膠體在一段時(shí)間內(nèi)一直用來制造有色玻璃）也發(fā)現(xiàn)了這種效應(yīng)，供職于Bell實(shí)驗(yàn)室的LouisBrus也是觀察到硫化鎘顆粒具有的這種效應(yīng)的科學(xué)家之一（當(dāng)時(shí)僅僅是為了表征該顆粒而作了一次光化學(xué)實(shí)驗(yàn)而已）?？墒沁@次，所有的科學(xué)家已經(jīng)意識(shí)到了該特異效應(yīng)的價(jià)值所在?？茖W(xué)家之所以如此重視該現(xiàn)象，量子點(diǎn)出色的發(fā)射特性在未來發(fā)光材料中可能具有很大的用途。在此之前，首先需要解決的問題是如何合成特定尺寸和特定發(fā)光特性（圖1.1B）的量子點(diǎn)。一旦量子點(diǎn)的合成路線確定下來，科學(xué)家們就可以思考如何將之投入到現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中去。 2. 量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和尺寸量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)一

6、般包括兩個(gè)部分：核（core）和殼（shell）。核一般使用CdSe，CdTe 或者InAs 等作為材料，其尺寸的大小決定了其光學(xué)性質(zhì)；第二層殼不僅可以保護(hù)核，還可以為進(jìn)一步的修飾提供條件。核一般選用半導(dǎo)體材料，而材料的選擇能初步控制發(fā)射波長的范圍，如圖2.1所示，CdSe 一般提供可見光譜，而CdTe 提供紅色和接近紅外范圍的波譜，而InAs9則提供近紅外的波譜。通過調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的尺寸可以獲得想要的波長，例如3nm的CdSe提供520nm的熒光發(fā)射，而5.5nm的CdSe則發(fā)射630nm的熒光， 圖2.1 單個(gè)量子點(diǎn)探針放大示意圖中間尺寸產(chǎn)生中間顏色的波譜。發(fā)射峰的寬度由量子點(diǎn)的尺寸分布決定，

7、用最新的合成方法可以合成單分散性很好的樣品，其最大半峰寬（FWHM）在20-35nm 范圍內(nèi)。量子點(diǎn)的核還被另一層由無機(jī)材料組成的殼所包被，這些材料可以保護(hù)核免受外界環(huán)境的影響，并放大修飾核的光學(xué)性質(zhì)。一種單分散的殼能放大量子產(chǎn)率以及增加數(shù)十倍的光穩(wěn)定性。殼的另一個(gè)作用就是增加化學(xué)穩(wěn)定性。然而，也有許多沒有包被殼的量子點(diǎn)可以直接借助水溶性修飾層與生物分子偶聯(lián)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。量子點(diǎn)之所以能用于生物標(biāo)記，其尺寸也是一個(gè)有利因素。圖2.2顯示了量子點(diǎn)與其他生物試劑或標(biāo)本的比較。如圖，量子點(diǎn)的尺寸隨顏色由藍(lán)變紅而逐漸增大，比綠色熒光蛋白（GFP）稍微大點(diǎn)而遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于藻紅蛋白（PE）、金顆粒，細(xì)菌或動(dòng)

8、物細(xì)胞等。圖2.2 量子點(diǎn)的尺寸范圍3. 量子點(diǎn)的性質(zhì)與合成3. 1 量子點(diǎn)的物理及化學(xué)特性量子點(diǎn)是一種直徑在1-100nm，能夠接受光的激發(fā)而產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米晶粒。這種納米顆?；旧鲜怯芍芷诒碇械?或者-V族的原子所形成。當(dāng)半導(dǎo)體納米晶粒的尺寸與其激子的玻爾半徑(約5-10nm)相接近時(shí)，由于存在量子尺寸效應(yīng)，半導(dǎo)體納米粒子能帶的帶隙隨粒子半徑的減少而增加，導(dǎo)致其吸收光譜和熒光光譜的藍(lán)移。與傳統(tǒng)的有機(jī)染色分子相比，量子點(diǎn)有如下優(yōu)點(diǎn)：(1) 量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長可以通過改變量子點(diǎn)粒徑的大小和其化學(xué)組成來“調(diào)諧”(圖3.1.1,圖3.1.2)。半導(dǎo)體納米晶?？梢圆捎脙稍爻煞趾铣苫蛉爻煞?/p>

9、合成的方法，其熒光發(fā)射光譜覆蓋了從近紫外光(400nm)到近紅外光(2000nm) 7-9的光譜范圍。因此，可以制備在這一光譜范圍內(nèi)的熒光光譜各異的量子點(diǎn)。圖3.1.1 由不同核材料合成的具有代表性的量子點(diǎn)發(fā)射峰對(duì)應(yīng)的譜峰位置圖3.1.2 溶于三氯甲烷中不同尺寸的量子點(diǎn)受同一藍(lán)色激光照射的熒光光譜示意圖(2) 傳統(tǒng)有機(jī)染料的熒光譜峰寬且不對(duì)稱，并且吸收光譜譜帶窄，若要觀察到多種染料的熒光，必須同時(shí)用多種不同波長的激光來激發(fā)（圖3.1.3)。而量子點(diǎn)的熒光光譜狹窄且對(duì)稱，而其吸收光譜很寬，可以被任何波長小于其熒光波長的光所激發(fā)，激發(fā)波長幾乎涵蓋從紫外到遠(yuǎn)紅外區(qū)的整個(gè)光譜范圍(圖3.1.4)。因此

10、，可以選擇一種使生物體自身熒光盡可能小的激發(fā)光圖3.1.3 CdSe量子點(diǎn)（綠色）和羅丹明6G（紅色）激發(fā)譜比較圖3.1.4 CdSe量子點(diǎn)（綠色）和羅丹明6G（紅色）發(fā)射譜比較來同時(shí)激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)，使其發(fā)出多種顏色的熒光，以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)分子的同時(shí)成像和跟蹤。(3) 由于量子點(diǎn)的摩爾消光系數(shù)(0.5-5×l0 M-1cm)10大約是有機(jī)染料(5-10×l0 M-1 cm )的10-50倍，在激發(fā)光強(qiáng)度相同的情況下，量子點(diǎn)的吸收速率將比有機(jī)染料快l0-50倍，由此增加了熒光發(fā)射速率，使量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度是有機(jī)熒光染料的10-20倍11, 12。此外，量子點(diǎn)的光漂白作

11、用很小，光化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定，不易因化學(xué)作用和生物代謝降解，熒光可持續(xù)數(shù)周或更長時(shí)間，能動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞或蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程，不會(huì)對(duì)組織細(xì)胞造成傷害。而且它可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，不容易發(fā)生熒光淬滅。(4) 較長的激發(fā)態(tài)壽命使量子點(diǎn)的熒光能夠從背景熒光中分離出來13, 14。較大的斯托克斯位移及狹窄對(duì)稱的熒光譜峰又進(jìn)一步提高了量子點(diǎn)的探測(cè)靈敏度(圖3.1.5)。因此，光譜特征各異的量子點(diǎn)在標(biāo)記生物分子時(shí)，可以將其熒光光譜移到生物體自身熒光少的區(qū)域，易于識(shí)別、分析。圖3.1.5 量子點(diǎn)和傳統(tǒng)染料斯托克斯位移比較3.2 量子點(diǎn)的化學(xué)合成以及它與生物大分子的結(jié)合欲實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)在生物體系中的實(shí)際應(yīng)用須解決以下問

12、題：(1) 提高熒光量子產(chǎn)率。單獨(dú)的量子點(diǎn)顆粒容易受到雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，熒光量子產(chǎn)率很低。但是，當(dāng)以一種半導(dǎo)體材料為核(如CdS，其粒徑?jīng)Q定其熒光光譜的波長)，用另一種能隙比較高(相對(duì)核來說)的半導(dǎo)體材料(如ZnS)包覆，形成核-殼結(jié)構(gòu)后，可以有效地使表面鈍化，可將量子產(chǎn)率提高到約50，甚至更高，因而可以產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光發(fā)射；另一方面這種核-殼結(jié)構(gòu)降低了半導(dǎo)體納米晶粒的重組，增強(qiáng)了量子點(diǎn)的穩(wěn)定性15, 16。文獻(xiàn)17利用高溫?zé)峤夥ㄖ瞥闪烁哔|(zhì)量的量子點(diǎn)。這一過程主要包括在高溫下使某種合適的金屬或有機(jī)金屬(鋅、鎘或汞)的先導(dǎo)物與對(duì)應(yīng)的硫族元素的先導(dǎo)物(硫、硒或碲)在對(duì)應(yīng)的有機(jī)溶劑(如氧化三正辛基

13、膦，TOPO)中化合，該有機(jī)溶劑必須具備在高溫下穩(wěn)定的特性，并可作為使量子點(diǎn)穩(wěn)定的表面活性劑，以防止納米晶粒的團(tuán)聚。此后各種合成高質(zhì)量量子點(diǎn)的過程在此基礎(chǔ)上不斷發(fā)展完善。(2) 設(shè)計(jì)合成親水性的量子點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)它與生物大分子的連接。適用于活細(xì)胞體系的量子點(diǎn)，必須具備水溶性的特點(diǎn)，而上述方法制備的量子點(diǎn)不能溶于水，也不能與生物分子結(jié)合。為使量子點(diǎn)溶于水并能與生物分子連接，必須將量子點(diǎn)表面層的TOPO分子進(jìn)行替換或包裹另一層帶有電荷或具有親水性的聚合物。如采用相轉(zhuǎn)移方法將兩性分子的聚合體(含有一個(gè)疏水片段或側(cè)鏈及一個(gè)親水片段或基團(tuán))作為去污劑，增加量子點(diǎn)水溶性18，同時(shí)提供可與生物分子結(jié)合的功能基團(tuán)(

14、羧基酸、胺等)，并且該方法增加了量子點(diǎn)的穩(wěn)定性和發(fā)光效率，使其在生物環(huán)境中具有長期的穩(wěn)定性。量子點(diǎn)的生物結(jié)合通?？梢酝ㄟ^兩種途徑來實(shí)現(xiàn)。一種方法是連有特定化學(xué)基團(tuán)的生物分子與半導(dǎo)體納米晶粒表面的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接。巰基(-SH)是最多用于綁定到半導(dǎo)體材料(CdSe，CdS，CdTe，ZnS)表面的基團(tuán)，量子點(diǎn)通過巰基(-SH)與生物分子結(jié)合19。這種方法的結(jié)果是親水性外殼上的部分配體被生物分子所替換。另一種方法是使生物分子非共價(jià)地結(jié)合到量子點(diǎn)外層的親水性外殼上。最簡(jiǎn)單的方法是生物分子通過非特異性方式吸附到親水性外殼上20，也可以通過靜電作用使生物分子吸附到量子點(diǎn)親水性殼上。大多數(shù)膠體量子點(diǎn)

15、帶負(fù)電，因此，帶正電的生物分子可以結(jié)合到量子點(diǎn)的表面。此外，生物分子還可以通過共價(jià)交聯(lián)的方式結(jié)合到量子點(diǎn)上21，這種方法要求量子點(diǎn)表面的親水性外殼上帶有某些反應(yīng)基團(tuán)(-COOH，-NH2，或-SH)。為了特異性地標(biāo)記生物結(jié)構(gòu)，量子點(diǎn)需要與特定的生物分子(如抗體)結(jié)合，以便特異性地與相應(yīng)的受體偶聯(lián)(圖3.2.1)。綁在量子點(diǎn)上的配體(抗體)既可以直接識(shí)別特異性的受體分子，也可以通過初級(jí)配體(初級(jí)抗體)來識(shí)別受體分子22。圖3.2.1 量子點(diǎn)與生物分子的連接方式：a) EDAC參與的傳統(tǒng)化學(xué)共價(jià)連接方式；b) 通過SMCC參與的巰基與氨基還原偶聯(lián)將抗體與量子點(diǎn)相連；c) 通過受體蛋白將抗體與量子點(diǎn)

16、相連；d) 含有六組氨酸標(biāo)簽的多肽和蛋白與Ni-NTA修飾的量子點(diǎn)連接，定量定點(diǎn)。4. 熒光量子點(diǎn)在生物標(biāo)記和生物成像中的應(yīng)用4.1 標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)和受體分子吸附了配體(抗體)的量子點(diǎn)可以高特異性地與靶受體結(jié)合，進(jìn)而該受體由于被熒光標(biāo)記而被觀測(cè)到。當(dāng)量子點(diǎn)吸附不同抗體時(shí)，可以特異性地標(biāo)記不同的受體。第一次標(biāo)記試驗(yàn)是由Alivisatos小組11完成的，該小組用兩種粒徑的CdSe-CdS量子點(diǎn)分別標(biāo)記老鼠的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核和F-肌動(dòng)蛋白纖維，一種發(fā)綠色熒光，另一種發(fā)紅色熒光，并且將發(fā)紅光的量子點(diǎn)特異性地標(biāo)記在F-肌動(dòng)蛋白絲上，而發(fā)綠光的量子點(diǎn)與尿素和乙酸結(jié)合，使量子點(diǎn)與細(xì)胞核具有高親和力，這樣就

17、可以同時(shí)在細(xì)胞中觀察到紅色和綠色的熒光。4.2 活細(xì)胞成像與示蹤量子點(diǎn)激發(fā)態(tài)的壽命較長，并且其光穩(wěn)特性好，能夠長時(shí)間地追蹤細(xì)胞的生物過程。Nie小組首先報(bào)導(dǎo)了鐵傳遞蛋白-量子點(diǎn)結(jié)合物被活HeLa細(xì)胞吞噬的過程12。隨后出現(xiàn)許多關(guān)于量子點(diǎn)被細(xì)胞通過非特異性吞噬而攝入細(xì)胞的報(bào)道。量子點(diǎn)被細(xì)胞吞噬的過程是生物研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，它關(guān)系到細(xì)胞與外界的聯(lián)系過程。此外，細(xì)胞的攝取機(jī)制對(duì)許多領(lǐng)域的應(yīng)用研究很重要，其中包括藥物、核酸、基因的傳導(dǎo)。Dahan，Jovin小組實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)分子運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)再現(xiàn)50，這對(duì)于有機(jī)染料來說是極端困難的。Dubertret等51將ZnS涂層的CdSe量子點(diǎn)用聚合

18、磷脂酞乙醇胺(PEG)和卵磷脂混合物包裹成膠囊，注人Xenopus(非洲蟾蜍)的胚胎細(xì)胞內(nèi)觀察胚胎的發(fā)育過程（圖 4.1），通過幾天的觀察發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)已經(jīng)被分配到注射細(xì)胞的傳代細(xì)胞內(nèi)，由此實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的移動(dòng)和分化的實(shí)時(shí)成像，這對(duì)于胚胎形成、癌癥轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞療法等領(lǐng)域的研究非常重要。圖 4.1 通過量子點(diǎn)觀測(cè)Xenopus胚胎的發(fā)育過程4.3 生物活體成像作為另一個(gè)重要的應(yīng)用領(lǐng)域，量子點(diǎn)被用作核磁共振(MRI)、X射線掃描、放射性成像等成像技術(shù)的對(duì)比劑，用于生物活體成像。傳統(tǒng)的有機(jī)染料注射到生物體內(nèi)幾分鐘后其熒光就消失了，與之相比，PEG包裹的量子點(diǎn)在生物體血液循環(huán)中的半衰期超過3 h52。其

19、原因可歸因于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)性。一方面PEG包裹的量子點(diǎn)體積足夠小，水溶性好，可以減緩調(diào)理作用和網(wǎng)狀內(nèi)皮的吞噬作用；另一方面，PEG包裹的量子點(diǎn)體積又足夠大，可以避免腎的過濾作用。要想最終實(shí)現(xiàn)利用量子點(diǎn)對(duì)組織器官的成像，則要求激發(fā)和探測(cè)波長能夠穿透生物組織。可見光最多只能穿透毫米級(jí)厚度的組織，而紅外光(650-2000nm)由于其波長較長，被生物體散射和吸收少，可穿透厘米級(jí)厚度的組織。將某些在紅外區(qū)發(fā)光的量子點(diǎn)標(biāo)記到組織或細(xì)胞內(nèi)的特異組分上，并用紅外光激發(fā)就可以通過成像檢測(cè)的方法來分析研究組織內(nèi)部的情況。傳統(tǒng)的量子點(diǎn)(CdSe-ZnS)發(fā)出的熒光波長通常在可見光區(qū)域。為了提高量子點(diǎn)熒光在生物組織內(nèi)

20、的穿透性，Kim等53制備出一種新的核-殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)(發(fā)射峰位在850nm，量子產(chǎn)率約13)，并成功地用于組織穿透（深度為1cm）的鼠冠狀動(dòng)脈血管及豬的前哨淋巴結(jié)的成像。5. 量子點(diǎn)結(jié)合FRET技術(shù)應(yīng)用于生物體系5.1 量子點(diǎn)在FRET中應(yīng)用的可行性自1993年Bawendi等合成高質(zhì)量的硒化鎘(CdSe)量子點(diǎn)以來，量子點(diǎn)已逐漸被用作發(fā)光生物探針。量子點(diǎn)相對(duì)于有機(jī)染料有很多優(yōu)點(diǎn)，自2001年起被應(yīng)用于FRET中。基于量子點(diǎn)的FRET應(yīng)用一般是量子點(diǎn)作為供體，但也可以作為受體，其原理示意圖5.1.1所示23 。生物連接的量子點(diǎn)用一層多聚物和蛋白包被來鈍化，以保持穩(wěn)定性和熒光的高量子產(chǎn)率。但隨

21、著穩(wěn)定性的增強(qiáng)、量子產(chǎn)率的增大，粒子的直徑也增大了，而FRET的能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在偶極-偶極相互作用之中(對(duì)距離的變化非常敏感)，距離的增加就減少了FRET的產(chǎn)生。為了減小偶極-偶極中心之間的距離，研究者采用把蛋白直接連接在量子點(diǎn)上，使能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在量子點(diǎn)和蛋白質(zhì)色氨酸殘基之間24，或者使量子點(diǎn)連接到一個(gè)基因控制的髓磷脂基本蛋白圖5.1.1 基于量子點(diǎn)的多個(gè)供體-受體對(duì)FRET的應(yīng)用原理上，使能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在外層髓磷脂基本蛋白和量子點(diǎn)之間。當(dāng)供體-受體距離在幾個(gè)波長之內(nèi)時(shí)，外層受體分子吸收由量子點(diǎn)發(fā)出的非輻射性能量發(fā)出一定波長的熒光，而作為供體的量子點(diǎn)能級(jí)回落到基態(tài)。在FRET中，選擇合適的供體-受

22、體對(duì)能夠保證高效的能量轉(zhuǎn)移率和提供可測(cè)量的參數(shù)：淬滅的供體光子發(fā)射和增強(qiáng)的受體熒光。在研究生物受體-配體之間特定的相互作用，或者是蛋白分子受到目標(biāo)分子的作用而發(fā)生構(gòu)象改變時(shí)，合適的光譜交錯(cuò)對(duì)于得到高效的能量轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。而且，激發(fā)線必須與最小的受體吸收光譜相一致，才能減輕由于直接激發(fā)受體而產(chǎn)生的影響。量子點(diǎn)具有優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，無疑在某些程度上具備了這些優(yōu)點(diǎn):首先，激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)波長范圍很寬，可以從紫外到遠(yuǎn)紅外區(qū)，因此可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)，并且可以通過選擇合適的激發(fā)波長來避免對(duì)受體分子的直接激發(fā)。其次，量子點(diǎn)的大小不同，所發(fā)射的熒光顏色不同，可以通過改變量子點(diǎn)的大小來調(diào)節(jié)量子

23、點(diǎn)的發(fā)射光譜與受體分子吸收光譜的重疊程度，從而可以調(diào)節(jié)FRET的效率。再次，量子點(diǎn)的熒光譜峰狹窄而對(duì)稱，半高峰寬通常為25-45nm。兩個(gè)相距r的獨(dú)立分子D-A之間的能量轉(zhuǎn)移可以表示為：E = KD-A/(KD-A+D-1) = R06/(R06+r6) (1)其中KD-A表示獨(dú)立的兩個(gè)單分子對(duì)之間的能量轉(zhuǎn)移速率；D表示供體分子激發(fā)狀態(tài)的時(shí)間壽命；R0表示能量轉(zhuǎn)移為50%時(shí)供體、受體之間的距離；r表示量子點(diǎn)和無機(jī)染料中心的距離。當(dāng)多個(gè)受體同時(shí)靠近量子點(diǎn)供體時(shí)，公式(1)可以修改為公式(2)來說明它們之間的相互作用。E = nR06/(nR06+r6) (2)其中，n表示與供體分子相互作用的受體

24、分子的平均個(gè)數(shù)。從以上兩個(gè)公式可以看出，供體、受體之間的能量轉(zhuǎn)移與R0和r之間存在六次方的關(guān)系。Wang等25通過設(shè)計(jì)麥芽糖粘附蛋白(MBP)連接到量子點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｋ鼙容^了量子點(diǎn)作為FRET能量供體具有比傳統(tǒng)染料更好的能量轉(zhuǎn)移效率。通過改變n值和光譜重疊的程度，證明了量子點(diǎn)的優(yōu)越性。Wargnier等26利用納米尺度的自組裝合成水溶性的CdSe-ZnS量子點(diǎn)，并用合成的量子點(diǎn)作為FRET的供體、受體和納米金膠體作為受體分子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)與長程能量轉(zhuǎn)移的理論計(jì)算值完全一致。5.2 量子點(diǎn)組成的FRET分析體系在生物研究中的應(yīng)用由于量子點(diǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，近來對(duì)其應(yīng)用于FRET的研究更為深入，范圍不斷擴(kuò)

25、展，目前，以量子點(diǎn)為基礎(chǔ)的FRET主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面。5.2.1 核酸檢測(cè)核酸是生命體的遺傳物質(zhì)，是生物物種延續(xù)和發(fā)展的基礎(chǔ)。FRET技術(shù)在研究核酸結(jié)構(gòu)，DNA測(cè)序和核酸雜交等方面被廣泛應(yīng)用。對(duì)于核酸結(jié)構(gòu)的分析，主要是應(yīng)用方程式（1），由值測(cè)定值，給出標(biāo)記基團(tuán)的空間距離。該方法可作為NMR的補(bǔ)充，使測(cè)定的核酸結(jié)構(gòu)更為精密。該方法在檢測(cè)核酸構(gòu)象的變化中也有較高的靈敏度。分子信標(biāo)(MB)是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理而設(shè)計(jì)的發(fā)夾型熒光探針。它包括一個(gè)環(huán)(loop)和一個(gè)干(stem)，其中環(huán)是由與靶分子互補(bǔ)的核酸堿基序列組成，干為兩列互補(bǔ)的堿基序列，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別標(biāo)記在其

26、干的兩端。通過熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間是否發(fā)生FRET來區(qū)分匹配錯(cuò)誤的靶分子。但由于有機(jī)染料光漂白速率較快、壽命較短以及其熒光色彩的有限性，限制了MBs在活體檢測(cè)中的應(yīng)用27。Ozkan等將熒光量子點(diǎn)作為熒光給體，設(shè)計(jì)了新型的分子信標(biāo)探針。熒光量子點(diǎn)的發(fā)射峰較尖銳且峰形對(duì)稱，光褪色的作用也較小，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料對(duì)相比，當(dāng)發(fā)夾閉合時(shí)，雖然FRET發(fā)生效率較低，但與靶分子結(jié)合后，由于量子點(diǎn)熒光較強(qiáng)，熒光增強(qiáng)的倍數(shù)高，檢測(cè)靈敏度顯著提高。Kim等設(shè)計(jì)了一種新的分子信標(biāo)，用巰基乙酸包覆的量子點(diǎn)作為熒光基團(tuán)，與MBs的5端的-NH2相連，4-(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)作為猝滅基團(tuán)，連

27、接到MBs的3端。此分子信標(biāo)的環(huán)由25個(gè)堿基構(gòu)成，干含有4對(duì)堿基，圖5.2.1所示：當(dāng)無靶DNA分子存在時(shí)，分子信標(biāo)呈環(huán)-干結(jié)構(gòu)，干部的QD與DABCYL之間由于距離較近，可發(fā)生FRET，QD的熒光被猝滅；當(dāng)互補(bǔ)靶DNA分子存在時(shí)，由于環(huán)DNA分子序列與靶DNA分子序列特異性結(jié)合，干打開，QD與DABCYL分開，無FRET發(fā)生，QD的熒光強(qiáng)度增加。同時(shí)作者用3D分子模型對(duì)比了QD/DABCYL與6-fluorescene(6-FAM)/DABCYL之間的FRET效率，發(fā)現(xiàn)雖然QD/DABCYL的能量轉(zhuǎn)移效率比6-FAM/DABCYL低，但是QD/DABCYL分子信標(biāo)對(duì)光漂白的穩(wěn)定性比6-FAM

28、/DABCYL分子信標(biāo)強(qiáng)。用QDs代替有機(jī)熒光團(tuán)使得同時(shí)進(jìn)行多個(gè)DNA或RNA分析成為可能。圖5.2.1 量子點(diǎn)修飾的分子信標(biāo)5.2.2 免疫分析免疫分析法包括傳統(tǒng)免疫分析法和標(biāo)記免疫分析法；標(biāo)記免疫分析法又可分為均相免疫分析法和非均相免疫分析法28。FRET屬于一種比較簡(jiǎn)便的均相免疫分析法，由于其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度較快，越來越引起人們的關(guān)注。以FRET為基礎(chǔ)的均相免疫分析法可分為夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。夾心法就是能量轉(zhuǎn)移的供體和受體分別標(biāo)記與同一個(gè)抗原相結(jié)合的兩種抗體，形成D-Ab1:Ag:Ab2-A形式的抗原抗體復(fù)合物，使供體和受體之間的距離減小，發(fā)生FRET，從而可以判斷免疫反應(yīng)的發(fā)生。競(jìng)爭(zhēng)法就

29、是能量轉(zhuǎn)移的供體和受體分別標(biāo)記抗原和抗體中的一種。由于抗原、抗體之間的特異性結(jié)合，使供體和受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)加入未標(biāo)記的抗原或抗體時(shí)，由于與標(biāo)記的抗原或抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)生無FRET現(xiàn)象的抗原抗體復(fù)合物，從而可以檢測(cè)抗原或抗體。Wang等29將兩種分別發(fā)出綠色熒光(G-NPs)和紅色熒光(R-NPs)的CdTe納米粒子用于免疫分析法。他們用R-NPs標(biāo)記牛血清白蛋白(BSA)，用G-NPs標(biāo)記抗BSA的IgG。當(dāng)形成BSA-IgG抗原抗體復(fù)合物時(shí)，G-NPs和R-NPs之間就發(fā)生了FRET，G-NPs的發(fā)光被猝滅，而R-NPs的發(fā)光增強(qiáng)。他們還使用了競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法，在(R-NPs-BSA)

30、-(G-NPs-IgG)抗原抗體復(fù)合物中加入未標(biāo)記的BSA，由于BSA逐漸取代標(biāo)記的BSA，使得G-NPs的發(fā)光逐漸增強(qiáng)，而R-NPs的發(fā)光逐漸減弱，從而可以檢測(cè)出BSA的濃度。利用這種基于競(jìng)爭(zhēng)免疫分析的FRET可以制成蛋白質(zhì)傳感器和雜交光電裝置。5.2.3 以FRET為基礎(chǔ)的傳感器在生物傳感器的設(shè)計(jì)中，信號(hào)的調(diào)制主要依賴于粘附于生物分子的供體和受體之間的電子傳導(dǎo)或能量傳導(dǎo)效率。Mattoussi等30提出了麥芽糖粘附蛋白(MBP)的麥芽糖生物傳感器的設(shè)計(jì)方案。通過重組技術(shù)，使MBP的C-端帶上5-HIS，與QDs進(jìn)行配位，形成QDs-MBP。他們將-環(huán)糊精-QSY9暗猝滅劑偶聯(lián)到MBP的糖受

31、體位置，可以觀察到由于QDs-QSY9圖5.2.2 基于560QD-MBP-CD-QSY-9間FRET的麥牙糖傳感器之間的FRET，QDs的熒光被猝滅。添加麥芽糖取代環(huán)糊精-QsY9后，QDs的熒光恢復(fù)(圖5.2.2)。此外，他們還將QDs與Cy3標(biāo)記的MBP配位后，形成QDs-MBP-Cy3，再將-環(huán)糊精-Cy3. 5鍵合到MBP的糖受體位置，由于QDs-Cy3-Cy3.5之間發(fā)生了二步FRET，克服了QDs與受體之間距離的限制，QDs和Cy3的熒光被猝滅；當(dāng)添加麥芽糖取代-環(huán)糊精-Cy3.5后，Cy3的熒光恢復(fù)（如圖5.2.3）。這樣就形成了兩種麥芽糖傳感器，有可能用于麥芽糖的定量檢測(cè)。他

32、們還將MBP用Cy3標(biāo)記后，通過非共價(jià)自組裝，分別結(jié)合到3種不同的QDs上，形成QDs-MBP-Cy3偶聯(lián)物。保持總的MBP與QDs的比例不變，而改變MBP-Cy3與QDs的比例，發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)QDs的光發(fā)射或者調(diào)節(jié)固定到QDs中心的MBP-Cy3的數(shù)量控制FRET效率。在這樣的體系中量子點(diǎn)不僅作為有效的能量供體，還相當(dāng)于生物傳感器納米組裝的“支架”。最近，Mattoussi等提供了QD-蛋白生物連接納米組裝的FRET分析，證明了通過對(duì)這種精確控制來得到高效和精確的分析31,32。還利用多個(gè)麥芽糖粘附蛋白(MBP)標(biāo)記光敏性的BIPS來反向調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的發(fā)射光譜，調(diào)節(jié)的效率可以通過改變BIPS

33、的數(shù)量來進(jìn)行控制33。因此，光敏性開關(guān)或生物傳感器有望通過這樣的裝置來實(shí)現(xiàn)。圖5.2.3 基于530QD-MBP-Cy3-CD-Cy3.5間FRET的麥牙糖傳感器QDs-MBP偶聯(lián)物顯示了兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：(1)可以調(diào)節(jié)供體與受體之間的光譜重疊程度；(2)提供了一種單個(gè)供體可以和幾個(gè)受體同時(shí)作用的模型。說明QDs能夠同時(shí)與幾個(gè)受體作用，從而可以增強(qiáng)FRET信號(hào)、提高檢測(cè)的靈敏度，預(yù)示著使用單一QDs供體同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)分析物將成為可能。Medintz等利用熒光量子點(diǎn)連接抗體片段發(fā)展了溶液相納米尺度傳感器的組裝34，將抗-TNT特定抗體片段通過金屬吸附作用連接到親水的量子點(diǎn)上，基于FRET對(duì)液相環(huán)境的2，4

34、，6-三硝基甲苯(TNT)進(jìn)行了特定的檢測(cè)。CdSe-ZnS核-殼型量子點(diǎn)可以被制備成帶正電荷或負(fù)電荷的水溶性粒子，直徑為3-6nm；量子產(chǎn)率(QYs)超過70。Wargnier等以FRET為基礎(chǔ)研究了帶相反電荷的QDs之間以及帶相反電荷的QDs與納米金之間在水相中的組裝。Wargnier等將最大發(fā)射波長在563nm的紅色量子點(diǎn)(R-QDs)用巰基琥珀酸和巰基磺酸的混合液處理，使其表面帶負(fù)電荷；將最大發(fā)射波長分別在515nm和558nm的綠色量子點(diǎn)(G-QDs)和黃色量子點(diǎn)(Y-QDs)用巰基乙胺處理，使其表面帶正電荷；納米金粒子(NGs)帶負(fù)電荷，每一個(gè)NG的表面大約有l(wèi)8個(gè)羧基。由于帶相反

35、的電荷，G-QDs和R-QDs、Y-QDs和NGs之間由于庫侖引力而相互吸引，發(fā)生FRET。帶正電荷的供體G-QDs和Y-QDs熒光被猝滅，說明G-QDs和R-QDs之間、Y-QDs和NGs之間發(fā)生了組裝。保持受體的濃度不變，改變供體的濃度，發(fā)現(xiàn)R-QDs表面的平均電荷量是G-QDs的4倍，而Y-QDs和NGs表面所帶的電荷量比較接近。在R-QDs和G-QDs中可以形成一個(gè)受體幾個(gè)供體的組裝，預(yù)示可以發(fā)展以FRET為基礎(chǔ)的傳感器。圖5.2.4 (a)MBP-BIPS對(duì)QD發(fā)光的調(diào)制; (b)sulfo-NHS-BIPS的sP(左)和MC(右)形式由于光的波長、強(qiáng)度、曝光程度很容易控制。光驅(qū)動(dòng)裝

36、置引起了人們很大的興趣。Medintz等34使用一個(gè)與蛋白質(zhì)結(jié)合的光致色變的FRET受體，可逆地調(diào)制量子點(diǎn)的發(fā)光，從而制成一個(gè)光驅(qū)動(dòng)調(diào)制器。1-3-2H-1-(2-羧基乙基)-3, 3-二甲基-6-硝基螺2H 1-苯并吡喃-2,2- (2H)-吲哚啉(BIPS)具有光致色變的性質(zhì)，在UV光/白光照射下可逆地從無色的螺苯并吡喃(SP)變?yōu)橛猩幕ㄝ?MC)，MC可以作為FRET的受體。將BIPS用硫代-N-羥基-丁二酰亞胺(sulfo-NHS)活化后，標(biāo)記到MBP上，再將其結(jié)合到QD的表面，這樣就形成了一個(gè)MBP-QD-BIPS融合物，圖5.2.4所示。當(dāng)用UV光照射時(shí)，BIPS轉(zhuǎn)化為MC，由于

37、QD-MC之間的FRET，QD的熒光被猝滅；當(dāng)用白光照射時(shí)，MC轉(zhuǎn)化為SP，QD的熒光顯著增加。通過改變?nèi)玖?蛋白質(zhì)的比率發(fā)現(xiàn)，可以通過改變結(jié)合到每個(gè)蛋白質(zhì)上的BIPS的數(shù)目來調(diào)節(jié)QD的發(fā)光，使得使用這類納米材料制成光致色變裝置或傳感器成為可能。5.2.4 生物大分子相互作用生物大分子間的相互作用是生命活動(dòng)中最基本的過程。對(duì)其進(jìn)行深入的研究在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域都具有重要的意義，目前在國內(nèi)外都是較熱門的課題。Willard等5以量子點(diǎn)作為能量轉(zhuǎn)移的供體，研究了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合。他們將BSA生物素化(bBSA)后，結(jié)合到量子點(diǎn)的表面，形成QD-bBSA；用四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記鏈

38、霉親和素(SAv)，形成SAv-TMR。將QD-bBSA和SAv-TMR在PBS緩沖液中進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)，通過改變SAv-TMR的濃度發(fā)現(xiàn)，隨著SAv-TMR的濃度增加，QD-bBSA所產(chǎn)生熒光強(qiáng)度逐漸減弱，SAv-TMR的熒光強(qiáng)度逐漸增加。這是由于QD-bBSA和SAv-TMR發(fā)生了特異性結(jié)合，QD-TMR之間產(chǎn)生了FRET，使得QD的熒光被猝滅，TMR的熒光增強(qiáng)(圖5.2.5)。為了做進(jìn)一步證實(shí)，他們將未生物素化的BSA與QD相連，并檢測(cè)了QD-BSA和SAv-TMR混合液的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)SAv-TMR的熒光并未增強(qiáng)，說明QD-TMR之間的FRET主要是由于生物素-SAv之間的特異性結(jié)合所產(chǎn)生

39、的。這預(yù)示著將QD作為供體標(biāo)記一種蛋白質(zhì)，用有機(jī)染料標(biāo)記另一種蛋白質(zhì)，通過QD和染料之間的FRET可以觀察不同蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合，并可應(yīng)用于均相免疫檢測(cè)、DNA雜交、酶-底物相互作用的設(shè)計(jì)中。Oh等35基于量子點(diǎn)與金納米粒子之間的FRET，研究了生物分子相互作用的抑制性分析。利用鏈霉親和素連接的量子點(diǎn)作為能量的供體，生物素連接的金納米粒子作為能量的受體，構(gòu)成了一個(gè)FRET體系。當(dāng)外源性圖5.2.5 FRET粘附分析示意圖地加入抗生物素時(shí)，由于抗生物素與生物素之間特定的相互作用，減少了鏈霉親和素連接量子點(diǎn)的熒光淬滅?？股锼氐臋z測(cè)域限達(dá)到10nmol·L-1。隨著不同濃度的外源性抗

40、生物素的加入，熒光淬滅的強(qiáng)度也存在著一定的定量關(guān)系，說明其設(shè)計(jì)可以作為生物分子特定性相互作用的高分辨定量分析?？紤]到量子點(diǎn)在水溶液中的分散穩(wěn)定性，Nagasaki等36在水溶液中利用CHO-PEG/PAMA共沉淀方法制備得到CdS量子點(diǎn)，即便是在濃度大的鹽溶液中，這種方法制備的量子點(diǎn)也保持了很好的穩(wěn)定性。他們利用量子點(diǎn)與熒光染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)之間的FRET研究了一種新的分子識(shí)別體系：將粘附量子點(diǎn)的PEG末梢連接生物素作為配體分子，連有薔薇花紅染料分子的鏈霉親和素作為受體，通過配體和受體之間的特定的相互作用來識(shí)別鏈霉親和素。結(jié)果證明，熒光共振能量轉(zhuǎn)移確實(shí)來自連接在CdS量子點(diǎn)上的生物素與連有薔薇花

41、紅染料分子的鏈霉親和素之間特定的相互作用。5.2.5 生物大分子構(gòu)象的變化生物大分子的結(jié)構(gòu)是分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)之一。分子特定的功能依賴于它所特有的結(jié)構(gòu)。為了全面深入地了解生物大分子的功能，需要全面地了解生物大分子的結(jié)構(gòu)，這對(duì)于研究和分析生物大分子的功能至關(guān)重要，一直以來都是廣大科研工作者研究的熱點(diǎn)。Medintz等32將6種不同的MBP突變體用羅丹明紅(RR)標(biāo)記后，配位到QDs上。通過研究QDs-MBP-RR之間的FRET來確定這6種不同的MBP,RR受體和QDs供體之間的距離以及MBP-RR在QDs表面的位置和取向。這提供了一種可以確定蛋白質(zhì)在QDs或其它球形納米粒子上位置的方法，這種方

42、法可能適用于觀察蛋白質(zhì)連接到QDs表面時(shí)的折疊過程或構(gòu)象的變化。圖5.2.6 量子點(diǎn)和染料Cy5FRET對(duì)的交叉連接動(dòng)力學(xué)探針由于對(duì)距離變化的靈敏性，F(xiàn)RET在揭開生物分子內(nèi)部活動(dòng)的研究中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Hohng等37觀察了量子點(diǎn)和有機(jī)熒光團(tuán)之間的單分子FRET，進(jìn)一步利用單分子之間的FRET，獲得了兩對(duì)雙鏈DNA交叉連接模型的單分子構(gòu)象變化信息(圖5.2.6)。在這里鏈霉親和素包裹的量子點(diǎn)不僅作為能量轉(zhuǎn)移的供體，還充當(dāng)了連接基底的支架作用。雖然量子點(diǎn)和Cy5之間的能量轉(zhuǎn)移效率較低，但從高，低能量轉(zhuǎn)移的兩種狀態(tài)看來，證實(shí)了交叉連接構(gòu)象的改變。5.2.6 癌癥治療的光敏劑在光動(dòng)力學(xué)治療（PD

43、T）中，光，氧氣和光敏劑共同作用以選擇性地破壞目標(biāo)組織。目標(biāo)性也就在于光敏劑在癌細(xì)胞有選擇地滯留，濃縮從而達(dá)到激光或紫外光在癌變組織的直接照射。在氧氣的存在下，癌變組織同時(shí)暴露在光和光敏劑中能殺死癌細(xì)胞(圖5.2.7)。相對(duì)傳統(tǒng)的治療，光動(dòng)力學(xué)治療侵害性更少，目標(biāo)性更強(qiáng)，沒有聲波治療的劑量限制，因而治療幾乎沒有傷疤。量子點(diǎn)表面的多樣性功能化修飾，使之具有良好的水溶性和生物相容性，有利于PDT能量在機(jī)體中的傳送。自從Derfus等38證明量子點(diǎn)毒性受UV照射調(diào)節(jié)以來，量子點(diǎn)有望于殺死癌細(xì)胞。圖5.2.7 量子點(diǎn)誘發(fā)的光動(dòng)力學(xué)治療的可能機(jī)理示意圖在PDT中，光敏劑受到光的激活，但并不是光敏劑直接與

44、組織細(xì)胞反應(yīng)來殺死癌變細(xì)胞，而是通過臨近氧分子從三線態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘c細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)的單線態(tài)氧來殺死癌變細(xì)胞。Samia等39通過FRET機(jī)理證明了CdSe量子點(diǎn)作為PDT光敏劑的可能性，為PDT光敏劑的發(fā)展開辟了新的思路。同時(shí)，量子點(diǎn)具有可調(diào)節(jié)的光學(xué)性質(zhì)，有助于淺層和深層次的癌癥治療。Bakalova等40還研究了在更少毒性量子點(diǎn)存在下單線態(tài)氧的產(chǎn)生，并評(píng)價(jià)了不同表面包裹技術(shù)對(duì)單線態(tài)氧量子產(chǎn)率的影響。Lou等41研究了量子點(diǎn)生物連接癌細(xì)胞作為PDT傳統(tǒng)光敏劑具有的潛在優(yōu)勢(shì)。水溶性的CdSe量子點(diǎn)連接于與白血病有特別作用的抗-CD抗體上，量子點(diǎn)標(biāo)記的細(xì)胞與正常的淋巴細(xì)胞混合同時(shí)受到有經(jīng)典光敏劑存在

45、的紫外光的照射。結(jié)果表明，量子點(diǎn)抗-CD連接的白血病細(xì)胞對(duì)紫外光刺激敏感，同時(shí)增強(qiáng)了經(jīng)典光敏劑的效果。量子點(diǎn)生物連接體作為PDT光敏劑或只是增強(qiáng)光敏藥物的效果都具有很好的應(yīng)用前景，但量子點(diǎn)易聚集，釋放重金屬離子和光學(xué)穩(wěn)定性也是待解決的問題。因此，人們應(yīng)更清楚地認(rèn)識(shí)到量子點(diǎn)獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和實(shí)際應(yīng)用之間存在的差距，更好地了解量子點(diǎn)在機(jī)體中吸收，代謝和毒性等機(jī)理。5.2.7 其他Patolsky等3利用FRET研究了在QDs表面進(jìn)行的調(diào)節(jié)聚合反應(yīng)和DNA復(fù)制動(dòng)力學(xué)過程。Patolsky等將薔薇紅染料插入到新合成的調(diào)聚物或DNA復(fù)制物中，通過觀察QDs-薔薇紅染料之間FRET信號(hào)隨時(shí)間的變化，來研究調(diào)

46、節(jié)聚合反應(yīng)和DNA復(fù)制的動(dòng)力學(xué)。這個(gè)體系除了可以應(yīng)用于探測(cè)酶作用于DNA的過程，也有望應(yīng)用于癌細(xì)胞的快速、靈敏的檢測(cè)。掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微術(shù)(SNOM) 42, 43由于其分辨率突破了Abbe衍射極限，自1980年代中期由Phol在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)以來，在10多年的時(shí)間內(nèi)獲得了迅速的發(fā)展，為生物亞顯微形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的生物學(xué)研究提供了一種有力的工具，在很多領(lǐng)域有很廣闊的應(yīng)用前景。Sekatskii等提出將FRET原理應(yīng)用于SNOM中以提高其分辨率，但其中存在著幾個(gè)問題：如探針在掃描樣品時(shí)，其距離上不能超過Förster半徑，這就要求探針的機(jī)械性能比較穩(wěn)定；以及含有供體的探針光漂白速率比較快等。

47、Müller等采用了一個(gè)新的供體-受體對(duì)可以很好地解決以上問題。他們將CdTe納米粒子連接到聚苯乙烯微球的表面，再將微球連接到SNOM的探針上；用Alexafluor標(biāo)記樣品分子，形成一個(gè)FRET-SNOM體系，并報(bào)道了第一例用這個(gè)探針進(jìn)行FRET-SNOM成像。結(jié)果表明，這種體系很有希望用于FRET-SNOM或者研究納米晶與單分子之間的受控相互作用。在FRET中，量子點(diǎn)不但可以作為供體，還可以作為受體。BSA是目前研究得最多的蛋白質(zhì)之一，可以作為研究蛋白質(zhì)-量子點(diǎn)偶聯(lián)的一個(gè)比較簡(jiǎn)便的模型。Mamedova等44用戊二醛(G)作偶聯(lián)劑，研究了BSA與CdTe納米粒子之間的生物偶聯(lián)。C

48、dTe納米粒子表面用L-半胱氨酸修飾，G的一個(gè)醛基形成Schiff堿與量子點(diǎn)表面的L-半胱氨酸的氨基結(jié)合，另一個(gè)醛基與BSA中的賴氨酸以相同的鍵結(jié)合，這樣就形成了BSA-G-CdTe偶聯(lián)物。為了證實(shí)BSA-G-CdTe的形成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：(1)BSA與CdTe主要形成1:1的偶聯(lián)物，其中含有少量的2:1的偶聯(lián)物；(2)偶聯(lián)后，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)大部分保持完整。用290nm的紫外光激發(fā)BSA-G-CdTe偶聯(lián)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)BSA中色氨酸在340nm處所發(fā)射的熒光完全被猝滅，而CdTe的熒光強(qiáng)度增加了一倍，說明發(fā)生了類似于經(jīng)典Förster能量轉(zhuǎn)移的過程，量子點(diǎn)通過共振能量轉(zhuǎn)移從蛋白質(zhì)的色

49、氨酸基團(tuán)中吸收能量。水溶性量子點(diǎn)由于表面覆有聚合物或蛋白質(zhì)，造成粒子尺寸的增加，可能使FRET減弱或消失。而疏水性量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率比水溶性量子點(diǎn)高，穩(wěn)定性好，并且許多生物過程發(fā)生在脂膜內(nèi)，所以近來有科學(xué)家直接將疏水性量子點(diǎn)用于FRET研究。Kloepfer等45將疏水性CdSe量子點(diǎn)埋入脂膜中，研究了量子點(diǎn)作為供體分別與水溶性的染料Cy3.5和脂溶性的染料DiD之間的FRET，以及量子點(diǎn)作為受體與脂溶性的染料3-4-(2-(6-(二丁胺基)-2-萘)-反式-乙烯基)吡啶)丙磺酸酯(di-4-ANEPPS)之間的FRET。第一次在模擬膜體系中探索了疏水性量子點(diǎn)的能量轉(zhuǎn)移過程。熒光量子點(diǎn)在其他FR

50、ET體系中的應(yīng)用包括：通過DNA的互補(bǔ)作用將光淬滅劑金與熒光量子點(diǎn)相連46，并用這些熒光量子點(diǎn)來研究抗生物素和生物素之間的相互作用47。將熒光量子點(diǎn)與DNA引物相連作為供體與熒光核苷受體聯(lián)用來分析DNA復(fù)制和調(diào)聚作用的動(dòng)力學(xué)問題3。熒光量子點(diǎn)也被作為FRET體系供體在分子燈中應(yīng)用49。定位于脂質(zhì)囊中的熒光量子點(diǎn)作為供體與脂溶性或水溶性染料的相互作用也得到了研究50。6 小結(jié)與展望與有機(jī)熒光分子相比較而言，量子點(diǎn)作為熒光能量共振轉(zhuǎn)移的供體或受體，具有許多特別的光學(xué)性質(zhì)。首先，激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)波長范圍很寬，因此不同大小的量子點(diǎn)可以由同一個(gè)波長的光激發(fā)。另外，量子點(diǎn)具有較大的斯托克斯位移和狹窄對(duì)稱的

51、熒光譜峰，這樣就允許同時(shí)使用不同光譜特征的量子點(diǎn)，而發(fā)射光譜不交疊(Overlap)，或只有很少交疊。由于大小不同、材料不同的量子點(diǎn)受到光激發(fā)后發(fā)出一系列不同光譜的光，且發(fā)射的熒光強(qiáng)度足以使光學(xué)設(shè)備檢測(cè)到單個(gè)的量子點(diǎn)，當(dāng)標(biāo)記有不同量子點(diǎn)的兩個(gè)生物分子互相靠近，在這一區(qū)域的光譜就會(huì)發(fā)生變化，甚至發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，就可以及時(shí)地觀察到整個(gè)過程的動(dòng)態(tài)變化。盡管基于量子點(diǎn)的FRET得到了廣泛的應(yīng)用，也取得了很大的成就，但還有許多有待改善的地方。如QDs的核比較大，在使用發(fā)射波長較長的QDs(例如，最大發(fā)射波長大于600nm)作為FRET的供體，或者使用比較大的蛋白質(zhì)(如抗體)時(shí)，供-受體之間的距離有可能超過

52、10nm，使FRET的信號(hào)減弱或者無FRET發(fā)生。所以發(fā)展以QDs為基礎(chǔ)的FRET，可以從以下幾個(gè)方面展開探索和研究。(1)優(yōu)化能量傳遞的供體和受體，以增加能量轉(zhuǎn)移的效率：根據(jù)所要識(shí)別的物質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的供體和受體，并且供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜要能夠有效的重疊，在供體的有效激發(fā)波長下能夠避免對(duì)受體的直接激發(fā)；此外供體和受體在供體的量子率、受體的消光系數(shù)、生物兼容性和抗干擾能力等方面均有要求。(2)為了在發(fā)生FRET時(shí)有足夠的信號(hào)改變，在使用QDs生物偶聯(lián)物時(shí)，可以根據(jù)受體配體的選擇性來選擇合適的中間體生物分子。(3)由于QDs的表面性質(zhì)會(huì)影響它們?cè)诩?xì)胞環(huán)境下的穩(wěn)定性，因此在應(yīng)用于細(xì)胞分

53、析領(lǐng)域時(shí)，對(duì)此須做進(jìn)一步的改進(jìn)。(4)將疏水性QDs直接用于FRET。與新技術(shù)、新材料的結(jié)合，使FRET對(duì)生物檢測(cè)的發(fā)展起到了更大的推動(dòng)作用，在均相免疫檢測(cè)、生物大分子相互作用和構(gòu)象變化的研究方面，以及發(fā)展以FRET為基礎(chǔ)的傳感器、生物芯片以及納米分析器件等方面將會(huì)有很好的前景，并將在環(huán)境檢測(cè)、生物防御等一系列領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1. a) Lakowicz, J. RPrinciples of Fluorescence Spectroscopy(2nd ed). New York: Kluwer academic, 1999. b) Stryer, L.; Haugland, R. P

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