神奇的熒光納米材料量子點在生物體系中的應用

1、神奇的熒光納米材料量子點在生物體系中的應用關鍵字：染料，熒光團，F(xiàn)RET (熒光共振能量轉移)，納米顆粒，熒光量子點熒光共振能量轉移(FRET)是運用熒光蛋白、傳統(tǒng)有機染料和其它染料作為熒光探針來研究蛋白構象、蛋白相互作用的一種實用技術，它能檢測到小于納米級的距離變化。以往的熒光蛋白、有機染料和鑭系金屬染料分子由于其窄的吸收光譜、帶長尾的寬發(fā)射光譜和非常低的光淬滅域限，且在吸收峰和發(fā)射峰之間不存在大的斯托克斯偏移1, 2，因此，還不是FRET體系最佳的供體和受體。只有選擇合適、理想的供體、受體分子才能保證高的能量轉移效率和精確的測量數據。半導體量子點(QDs)由于其可調諧的狹窄的激發(fā)波長和遠離

2、激發(fā)峰的發(fā)射以及抗漂白性的優(yōu)良的光學性質，并可以同時連接多個染料分子，使其比有機熒光分子更好地適用于熒光共振能量轉移的研究體系。量子點既可以作為FRET供體，也可以作為它的受體3。但最近有文獻報道量子點作為FRET受體幾乎看不到能量的轉移，他們認為主要是因為量子點長的激活壽命和受體染料分子短暫的激發(fā)時間。在近幾年，基于量子點的FRET研究得到了廣泛的證實和應用4-6，在這里我們將為大家簡單地介紹量子點的特性、化學合成以及基于量子點的FRET在研究核酸檢測，免疫分析，生物分子相互作用，分子構象的變化，生物傳感器和癌癥研究等方面的應用。1. 量子點的發(fā)現(xiàn)太空恒星之間并不是一無所有，1980年宇航員

3、注意到從顆粒狀的塵云或者星云上反射到我們銀河系的恒星光譜都充滿寬寬的紅色帶。很長一段時間里，這種來自星云和銀河系其他地方的塵埃發(fā)射的熒光對人們一直保持著神秘色彩，很長一段時間世界上任何一個天文實驗室的研究人員無法揭示這種具有奇異光學性質的顆粒組成?？墒呛髞?，來自歐洲和美國的兩個研究小組，出乎意料地分別提出了下面這個很相近的觀點這種發(fā)射紅色光譜的塵?？赡芫褪橇孔狱c。什么才是量子點？這個術語首先被上個世紀80年代在美國Bell實驗室一起工作的物理學家Daniel Chemla和David Miller所提出。這個術語指的是直徑非常小近似球形的半導體晶粒（宇宙塵埃就是硅顆粒的一個例子）。量子點常常被

4、看作是納米晶粒（他們至少有其他10個化名，比如人造原子，量子晶體和納米點等等），也被當作是膠體顆粒。圖1.1 量子點的限域效應量子點有一個非常奇特的最基本特征：它的光學行為依賴于它的尺寸（圖1.1A）。比如，在紫外燈照射下，2.3nm的CdSe量子點發(fā)射青綠色光，而5.5nm的相同材料組成的量子點卻發(fā)射桔紅色的光。1967年，紐約Eastman Kodak公司的Chester Berry第一次報道了這種奇異的現(xiàn)象，當時他是在觀察銀鹵化物沉淀時發(fā)現(xiàn)的，可是當時一直沒人注意到這點，就連Berry本人也沒在意他的發(fā)現(xiàn)。直到十年之后，也就是在20世紀80年代早期，許多研究小組再次觀察到了這種效應，首先

5、是在氯化銅鑲嵌玻璃中發(fā)現(xiàn)的。后來在硫化鎘的膠體顆粒制備中（硫化鎘膠體在一段時間內一直用來制造有色玻璃）也發(fā)現(xiàn)了這種效應，供職于Bell實驗室的LouisBrus也是觀察到硫化鎘顆粒具有的這種效應的科學家之一（當時僅僅是為了表征該顆粒而作了一次光化學實驗而已）。可是這次，所有的科學家已經意識到了該特異效應的價值所在?？茖W家之所以如此重視該現(xiàn)象，量子點出色的發(fā)射特性在未來發(fā)光材料中可能具有很大的用途。在此之前，首先需要解決的問題是如何合成特定尺寸和特定發(fā)光特性（圖1.1B）的量子點。一旦量子點的合成路線確定下來，科學家們就可以思考如何將之投入到現(xiàn)實應用中去。 2. 量子點的結構和尺寸量子點的結構一

6、般包括兩個部分：核（core）和殼（shell）。核一般使用CdSe，CdTe 或者InAs 等作為材料，其尺寸的大小決定了其光學性質；第二層殼不僅可以保護核，還可以為進一步的修飾提供條件。核一般選用半導體材料，而材料的選擇能初步控制發(fā)射波長的范圍，如圖2.1所示，CdSe 一般提供可見光譜，而CdTe 提供紅色和接近紅外范圍的波譜，而InAs9則提供近紅外的波譜。通過調節(jié)量子點的尺寸可以獲得想要的波長，例如3nm的CdSe提供520nm的熒光發(fā)射，而5.5nm的CdSe則發(fā)射630nm的熒光， 圖2.1 單個量子點探針放大示意圖中間尺寸產生中間顏色的波譜。發(fā)射峰的寬度由量子點的尺寸分布決定，

7、用最新的合成方法可以合成單分散性很好的樣品，其最大半峰寬（FWHM）在20-35nm 范圍內。量子點的核還被另一層由無機材料組成的殼所包被，這些材料可以保護核免受外界環(huán)境的影響，并放大修飾核的光學性質。一種單分散的殼能放大量子產率以及增加數十倍的光穩(wěn)定性。殼的另一個作用就是增加化學穩(wěn)定性。然而，也有許多沒有包被殼的量子點可以直接借助水溶性修飾層與生物分子偶聯(lián)而發(fā)揮其生物學作用。量子點之所以能用于生物標記，其尺寸也是一個有利因素。圖2.2顯示了量子點與其他生物試劑或標本的比較。如圖，量子點的尺寸隨顏色由藍變紅而逐漸增大，比綠色熒光蛋白（GFP）稍微大點而遠遠小于藻紅蛋白（PE）、金顆粒，細菌或動

8、物細胞等。圖2.2 量子點的尺寸范圍3. 量子點的性質與合成3. 1 量子點的物理及化學特性量子點是一種直徑在1-100nm，能夠接受光的激發(fā)而產生熒光的半導體納米晶粒。這種納米顆?；旧鲜怯芍芷诒碇械?或者-V族的原子所形成。當半導體納米晶粒的尺寸與其激子的玻爾半徑(約5-10nm)相接近時，由于存在量子尺寸效應，半導體納米粒子能帶的帶隙隨粒子半徑的減少而增加，導致其吸收光譜和熒光光譜的藍移。與傳統(tǒng)的有機染色分子相比，量子點有如下優(yōu)點：(1) 量子點的熒光發(fā)射波長可以通過改變量子點粒徑的大小和其化學組成來“調諧”(圖3.1.1,圖3.1.2)。半導體納米晶粒可以采用兩元素成分合成或三元素成分

9、合成的方法，其熒光發(fā)射光譜覆蓋了從近紫外光(400nm)到近紅外光(2000nm) 7-9的光譜范圍。因此，可以制備在這一光譜范圍內的熒光光譜各異的量子點。圖3.1.1 由不同核材料合成的具有代表性的量子點發(fā)射峰對應的譜峰位置圖3.1.2 溶于三氯甲烷中不同尺寸的量子點受同一藍色激光照射的熒光光譜示意圖(2) 傳統(tǒng)有機染料的熒光譜峰寬且不對稱，并且吸收光譜譜帶窄，若要觀察到多種染料的熒光，必須同時用多種不同波長的激光來激發(fā)（圖3.1.3)。而量子點的熒光光譜狹窄且對稱，而其吸收光譜很寬，可以被任何波長小于其熒光波長的光所激發(fā)，激發(fā)波長幾乎涵蓋從紫外到遠紅外區(qū)的整個光譜范圍(圖3.1.4)。因此

10、，可以選擇一種使生物體自身熒光盡可能小的激發(fā)光圖3.1.3 CdSe量子點（綠色）和羅丹明6G（紅色）激發(fā)譜比較圖3.1.4 CdSe量子點（綠色）和羅丹明6G（紅色）發(fā)射譜比較來同時激發(fā)不同大小的量子點，使其發(fā)出多種顏色的熒光，以實現(xiàn)對多種目標分子的同時成像和跟蹤。(3) 由于量子點的摩爾消光系數(0.5-5×l0 M-1cm)10大約是有機染料(5-10×l0 M-1 cm )的10-50倍，在激發(fā)光強度相同的情況下，量子點的吸收速率將比有機染料快l0-50倍，由此增加了熒光發(fā)射速率，使量子點的熒光發(fā)射強度是有機熒光染料的10-20倍11, 12。此外，量子點的光漂白作

11、用很小，光化學性質十分穩(wěn)定，不易因化學作用和生物代謝降解，熒光可持續(xù)數周或更長時間，能動態(tài)觀察細胞或蛋白質的動力學過程，不會對組織細胞造成傷害。而且它可以經受反復多次激發(fā)，不容易發(fā)生熒光淬滅。(4) 較長的激發(fā)態(tài)壽命使量子點的熒光能夠從背景熒光中分離出來13, 14。較大的斯托克斯位移及狹窄對稱的熒光譜峰又進一步提高了量子點的探測靈敏度(圖3.1.5)。因此，光譜特征各異的量子點在標記生物分子時，可以將其熒光光譜移到生物體自身熒光少的區(qū)域，易于識別、分析。圖3.1.5 量子點和傳統(tǒng)染料斯托克斯位移比較3.2 量子點的化學合成以及它與生物大分子的結合欲實現(xiàn)量子點在生物體系中的實際應用須解決以下問

12、題：(1) 提高熒光量子產率。單獨的量子點顆粒容易受到雜質和晶格缺陷的影響，熒光量子產率很低。但是，當以一種半導體材料為核(如CdS，其粒徑決定其熒光光譜的波長)，用另一種能隙比較高(相對核來說)的半導體材料(如ZnS)包覆，形成核-殼結構后，可以有效地使表面鈍化，可將量子產率提高到約50，甚至更高，因而可以產生很強的熒光發(fā)射；另一方面這種核-殼結構降低了半導體納米晶粒的重組，增強了量子點的穩(wěn)定性15, 16。文獻17利用高溫熱解法制成了高質量的量子點。這一過程主要包括在高溫下使某種合適的金屬或有機金屬(鋅、鎘或汞)的先導物與對應的硫族元素的先導物(硫、硒或碲)在對應的有機溶劑(如氧化三正辛基

13、膦，TOPO)中化合，該有機溶劑必須具備在高溫下穩(wěn)定的特性，并可作為使量子點穩(wěn)定的表面活性劑，以防止納米晶粒的團聚。此后各種合成高質量量子點的過程在此基礎上不斷發(fā)展完善。(2) 設計合成親水性的量子點并實現(xiàn)它與生物大分子的連接。適用于活細胞體系的量子點，必須具備水溶性的特點，而上述方法制備的量子點不能溶于水，也不能與生物分子結合。為使量子點溶于水并能與生物分子連接，必須將量子點表面層的TOPO分子進行替換或包裹另一層帶有電荷或具有親水性的聚合物。如采用相轉移方法將兩性分子的聚合體(含有一個疏水片段或側鏈及一個親水片段或基團)作為去污劑，增加量子點水溶性18，同時提供可與生物分子結合的功能基團(

14、羧基酸、胺等)，并且該方法增加了量子點的穩(wěn)定性和發(fā)光效率，使其在生物環(huán)境中具有長期的穩(wěn)定性。量子點的生物結合通?？梢酝ㄟ^兩種途徑來實現(xiàn)。一種方法是連有特定化學基團的生物分子與半導體納米晶粒表面的官能團發(fā)生反應實現(xiàn)連接。巰基(-SH)是最多用于綁定到半導體材料(CdSe，CdS，CdTe，ZnS)表面的基團，量子點通過巰基(-SH)與生物分子結合19。這種方法的結果是親水性外殼上的部分配體被生物分子所替換。另一種方法是使生物分子非共價地結合到量子點外層的親水性外殼上。最簡單的方法是生物分子通過非特異性方式吸附到親水性外殼上20，也可以通過靜電作用使生物分子吸附到量子點親水性殼上。大多數膠體量子點

15、帶負電，因此，帶正電的生物分子可以結合到量子點的表面。此外，生物分子還可以通過共價交聯(lián)的方式結合到量子點上21，這種方法要求量子點表面的親水性外殼上帶有某些反應基團(-COOH，-NH2，或-SH)。為了特異性地標記生物結構，量子點需要與特定的生物分子(如抗體)結合，以便特異性地與相應的受體偶聯(lián)(圖3.2.1)。綁在量子點上的配體(抗體)既可以直接識別特異性的受體分子，也可以通過初級配體(初級抗體)來識別受體分子22。圖3.2.1 量子點與生物分子的連接方式：a) EDAC參與的傳統(tǒng)化學共價連接方式；b) 通過SMCC參與的巰基與氨基還原偶聯(lián)將抗體與量子點相連；c) 通過受體蛋白將抗體與量子點

16、相連；d) 含有六組氨酸標簽的多肽和蛋白與Ni-NTA修飾的量子點連接，定量定點。4. 熒光量子點在生物標記和生物成像中的應用4.1 標記細胞結構和受體分子吸附了配體(抗體)的量子點可以高特異性地與靶受體結合，進而該受體由于被熒光標記而被觀測到。當量子點吸附不同抗體時，可以特異性地標記不同的受體。第一次標記試驗是由Alivisatos小組11完成的，該小組用兩種粒徑的CdSe-CdS量子點分別標記老鼠的成纖維細胞的細胞核和F-肌動蛋白纖維，一種發(fā)綠色熒光，另一種發(fā)紅色熒光，并且將發(fā)紅光的量子點特異性地標記在F-肌動蛋白絲上，而發(fā)綠光的量子點與尿素和乙酸結合，使量子點與細胞核具有高親和力，這樣就

17、可以同時在細胞中觀察到紅色和綠色的熒光。4.2 活細胞成像與示蹤量子點激發(fā)態(tài)的壽命較長，并且其光穩(wěn)特性好，能夠長時間地追蹤細胞的生物過程。Nie小組首先報導了鐵傳遞蛋白-量子點結合物被活HeLa細胞吞噬的過程12。隨后出現(xiàn)許多關于量子點被細胞通過非特異性吞噬而攝入細胞的報道。量子點被細胞吞噬的過程是生物研究的一個重要領域，它關系到細胞與外界的聯(lián)系過程。此外，細胞的攝取機制對許多領域的應用研究很重要，其中包括藥物、核酸、基因的傳導。Dahan，Jovin小組實現(xiàn)了對單個活細胞內的單個分子運動的實時再現(xiàn)50，這對于有機染料來說是極端困難的。Dubertret等51將ZnS涂層的CdSe量子點用聚合

18、磷脂酞乙醇胺(PEG)和卵磷脂混合物包裹成膠囊，注人Xenopus(非洲蟾蜍)的胚胎細胞內觀察胚胎的發(fā)育過程（圖 4.1），通過幾天的觀察發(fā)現(xiàn)量子點已經被分配到注射細胞的傳代細胞內，由此實現(xiàn)了對單個細胞的移動和分化的實時成像，這對于胚胎形成、癌癥轉移、干細胞療法等領域的研究非常重要。圖 4.1 通過量子點觀測Xenopus胚胎的發(fā)育過程4.3 生物活體成像作為另一個重要的應用領域，量子點被用作核磁共振(MRI)、X射線掃描、放射性成像等成像技術的對比劑，用于生物活體成像。傳統(tǒng)的有機染料注射到生物體內幾分鐘后其熒光就消失了，與之相比，PEG包裹的量子點在生物體血液循環(huán)中的半衰期超過3 h52。其

19、原因可歸因于其獨特的結構性。一方面PEG包裹的量子點體積足夠小，水溶性好，可以減緩調理作用和網狀內皮的吞噬作用；另一方面，PEG包裹的量子點體積又足夠大，可以避免腎的過濾作用。要想最終實現(xiàn)利用量子點對組織器官的成像，則要求激發(fā)和探測波長能夠穿透生物組織?？梢姽庾疃嘀荒艽┩负撩准壓穸鹊慕M織，而紅外光(650-2000nm)由于其波長較長，被生物體散射和吸收少，可穿透厘米級厚度的組織。將某些在紅外區(qū)發(fā)光的量子點標記到組織或細胞內的特異組分上，并用紅外光激發(fā)就可以通過成像檢測的方法來分析研究組織內部的情況。傳統(tǒng)的量子點(CdSe-ZnS)發(fā)出的熒光波長通常在可見光區(qū)域。為了提高量子點熒光在生物組織內

20、的穿透性，Kim等53制備出一種新的核-殼結構的量子點(發(fā)射峰位在850nm，量子產率約13)，并成功地用于組織穿透（深度為1cm）的鼠冠狀動脈血管及豬的前哨淋巴結的成像。5. 量子點結合FRET技術應用于生物體系5.1 量子點在FRET中應用的可行性自1993年Bawendi等合成高質量的硒化鎘(CdSe)量子點以來，量子點已逐漸被用作發(fā)光生物探針。量子點相對于有機染料有很多優(yōu)點，自2001年起被應用于FRET中?；诹孔狱c的FRET應用一般是量子點作為供體，但也可以作為受體，其原理示意圖5.1.1所示23 。生物連接的量子點用一層多聚物和蛋白包被來鈍化，以保持穩(wěn)定性和熒光的高量子產率。但隨

21、著穩(wěn)定性的增強、量子產率的增大，粒子的直徑也增大了，而FRET的能量轉移發(fā)生在偶極-偶極相互作用之中(對距離的變化非常敏感)，距離的增加就減少了FRET的產生。為了減小偶極-偶極中心之間的距離，研究者采用把蛋白直接連接在量子點上，使能量轉移發(fā)生在量子點和蛋白質色氨酸殘基之間24，或者使量子點連接到一個基因控制的髓磷脂基本蛋白圖5.1.1 基于量子點的多個供體-受體對FRET的應用原理上，使能量轉移發(fā)生在外層髓磷脂基本蛋白和量子點之間。當供體-受體距離在幾個波長之內時，外層受體分子吸收由量子點發(fā)出的非輻射性能量發(fā)出一定波長的熒光，而作為供體的量子點能級回落到基態(tài)。在FRET中，選擇合適的供體-受

22、體對能夠保證高效的能量轉移率和提供可測量的參數：淬滅的供體光子發(fā)射和增強的受體熒光。在研究生物受體-配體之間特定的相互作用，或者是蛋白分子受到目標分子的作用而發(fā)生構象改變時，合適的光譜交錯對于得到高效的能量轉移至關重要。而且，激發(fā)線必須與最小的受體吸收光譜相一致，才能減輕由于直接激發(fā)受體而產生的影響。量子點具有優(yōu)越的光學性質，無疑在某些程度上具備了這些優(yōu)點:首先，激發(fā)量子點的激發(fā)波長范圍很寬，可以從紫外到遠紅外區(qū)，因此可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點，并且可以通過選擇合適的激發(fā)波長來避免對受體分子的直接激發(fā)。其次，量子點的大小不同，所發(fā)射的熒光顏色不同，可以通過改變量子點的大小來調節(jié)量子

23、點的發(fā)射光譜與受體分子吸收光譜的重疊程度，從而可以調節(jié)FRET的效率。再次，量子點的熒光譜峰狹窄而對稱，半高峰寬通常為25-45nm。兩個相距r的獨立分子D-A之間的能量轉移可以表示為：E = KD-A/(KD-A+D-1) = R06/(R06+r6) (1)其中KD-A表示獨立的兩個單分子對之間的能量轉移速率；D表示供體分子激發(fā)狀態(tài)的時間壽命；R0表示能量轉移為50%時供體、受體之間的距離；r表示量子點和無機染料中心的距離。當多個受體同時靠近量子點供體時，公式(1)可以修改為公式(2)來說明它們之間的相互作用。E = nR06/(nR06+r6) (2)其中，n表示與供體分子相互作用的受體

24、分子的平均個數。從以上兩個公式可以看出，供體、受體之間的能量轉移與R0和r之間存在六次方的關系。Wang等25通過設計麥芽糖粘附蛋白(MBP)連接到量子點的實驗模塑比較了量子點作為FRET能量供體具有比傳統(tǒng)染料更好的能量轉移效率。通過改變n值和光譜重疊的程度，證明了量子點的優(yōu)越性。Wargnier等26利用納米尺度的自組裝合成水溶性的CdSe-ZnS量子點，并用合成的量子點作為FRET的供體、受體和納米金膠體作為受體分子進行了實驗，數據與長程能量轉移的理論計算值完全一致。5.2 量子點組成的FRET分析體系在生物研究中的應用由于量子點的獨特優(yōu)勢，近來對其應用于FRET的研究更為深入，范圍不斷擴

25、展，目前，以量子點為基礎的FRET主要應用于以下幾個方面。5.2.1 核酸檢測核酸是生命體的遺傳物質，是生物物種延續(xù)和發(fā)展的基礎。FRET技術在研究核酸結構，DNA測序和核酸雜交等方面被廣泛應用。對于核酸結構的分析，主要是應用方程式（1），由值測定值，給出標記基團的空間距離。該方法可作為NMR的補充，使測定的核酸結構更為精密。該方法在檢測核酸構象的變化中也有較高的靈敏度。分子信標(MB)是根據核酸堿基配對原則和熒光共振能量轉移原理而設計的發(fā)夾型熒光探針。它包括一個環(huán)(loop)和一個干(stem)，其中環(huán)是由與靶分子互補的核酸堿基序列組成，干為兩列互補的堿基序列，熒光基團和猝滅基團分別標記在其

26、干的兩端。通過熒光基團和猝滅基團之間是否發(fā)生FRET來區(qū)分匹配錯誤的靶分子。但由于有機染料光漂白速率較快、壽命較短以及其熒光色彩的有限性，限制了MBs在活體檢測中的應用27。Ozkan等將熒光量子點作為熒光給體，設計了新型的分子信標探針。熒光量子點的發(fā)射峰較尖銳且峰形對稱，光褪色的作用也較小，與傳統(tǒng)的有機染料對相比，當發(fā)夾閉合時，雖然FRET發(fā)生效率較低，但與靶分子結合后，由于量子點熒光較強，熒光增強的倍數高，檢測靈敏度顯著提高。Kim等設計了一種新的分子信標，用巰基乙酸包覆的量子點作為熒光基團，與MBs的5端的-NH2相連，4-(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)作為猝滅基團，連

27、接到MBs的3端。此分子信標的環(huán)由25個堿基構成，干含有4對堿基，圖5.2.1所示：當無靶DNA分子存在時，分子信標呈環(huán)-干結構，干部的QD與DABCYL之間由于距離較近，可發(fā)生FRET，QD的熒光被猝滅；當互補靶DNA分子存在時，由于環(huán)DNA分子序列與靶DNA分子序列特異性結合，干打開，QD與DABCYL分開，無FRET發(fā)生，QD的熒光強度增加。同時作者用3D分子模型對比了QD/DABCYL與6-fluorescene(6-FAM)/DABCYL之間的FRET效率，發(fā)現(xiàn)雖然QD/DABCYL的能量轉移效率比6-FAM/DABCYL低，但是QD/DABCYL分子信標對光漂白的穩(wěn)定性比6-FAM

28、/DABCYL分子信標強。用QDs代替有機熒光團使得同時進行多個DNA或RNA分析成為可能。圖5.2.1 量子點修飾的分子信標5.2.2 免疫分析免疫分析法包括傳統(tǒng)免疫分析法和標記免疫分析法；標記免疫分析法又可分為均相免疫分析法和非均相免疫分析法28。FRET屬于一種比較簡便的均相免疫分析法，由于其操作簡單，反應速度較快，越來越引起人們的關注。以FRET為基礎的均相免疫分析法可分為夾心法和競爭法。夾心法就是能量轉移的供體和受體分別標記與同一個抗原相結合的兩種抗體，形成D-Ab1:Ag:Ab2-A形式的抗原抗體復合物，使供體和受體之間的距離減小，發(fā)生FRET，從而可以判斷免疫反應的發(fā)生。競爭法就

29、是能量轉移的供體和受體分別標記抗原和抗體中的一種。由于抗原、抗體之間的特異性結合，使供體和受體之間發(fā)生能量轉移，當加入未標記的抗原或抗體時，由于與標記的抗原或抗體發(fā)生競爭，產生無FRET現(xiàn)象的抗原抗體復合物，從而可以檢測抗原或抗體。Wang等29將兩種分別發(fā)出綠色熒光(G-NPs)和紅色熒光(R-NPs)的CdTe納米粒子用于免疫分析法。他們用R-NPs標記牛血清白蛋白(BSA)，用G-NPs標記抗BSA的IgG。當形成BSA-IgG抗原抗體復合物時，G-NPs和R-NPs之間就發(fā)生了FRET，G-NPs的發(fā)光被猝滅，而R-NPs的發(fā)光增強。他們還使用了競爭免疫分析法，在(R-NPs-BSA)

30、-(G-NPs-IgG)抗原抗體復合物中加入未標記的BSA，由于BSA逐漸取代標記的BSA，使得G-NPs的發(fā)光逐漸增強，而R-NPs的發(fā)光逐漸減弱，從而可以檢測出BSA的濃度。利用這種基于競爭免疫分析的FRET可以制成蛋白質傳感器和雜交光電裝置。5.2.3 以FRET為基礎的傳感器在生物傳感器的設計中，信號的調制主要依賴于粘附于生物分子的供體和受體之間的電子傳導或能量傳導效率。Mattoussi等30提出了麥芽糖粘附蛋白(MBP)的麥芽糖生物傳感器的設計方案。通過重組技術，使MBP的C-端帶上5-HIS，與QDs進行配位，形成QDs-MBP。他們將-環(huán)糊精-QSY9暗猝滅劑偶聯(lián)到MBP的糖受

31、體位置，可以觀察到由于QDs-QSY9圖5.2.2 基于560QD-MBP-CD-QSY-9間FRET的麥牙糖傳感器之間的FRET，QDs的熒光被猝滅。添加麥芽糖取代環(huán)糊精-QsY9后，QDs的熒光恢復(圖5.2.2)。此外，他們還將QDs與Cy3標記的MBP配位后，形成QDs-MBP-Cy3，再將-環(huán)糊精-Cy3. 5鍵合到MBP的糖受體位置，由于QDs-Cy3-Cy3.5之間發(fā)生了二步FRET，克服了QDs與受體之間距離的限制，QDs和Cy3的熒光被猝滅；當添加麥芽糖取代-環(huán)糊精-Cy3.5后，Cy3的熒光恢復（如圖5.2.3）。這樣就形成了兩種麥芽糖傳感器，有可能用于麥芽糖的定量檢測。他

32、們還將MBP用Cy3標記后，通過非共價自組裝，分別結合到3種不同的QDs上，形成QDs-MBP-Cy3偶聯(lián)物。保持總的MBP與QDs的比例不變，而改變MBP-Cy3與QDs的比例，發(fā)現(xiàn)可以通過調節(jié)QDs的光發(fā)射或者調節(jié)固定到QDs中心的MBP-Cy3的數量控制FRET效率。在這樣的體系中量子點不僅作為有效的能量供體，還相當于生物傳感器納米組裝的“支架”。最近，Mattoussi等提供了QD-蛋白生物連接納米組裝的FRET分析，證明了通過對這種精確控制來得到高效和精確的分析31,32。還利用多個麥芽糖粘附蛋白(MBP)標記光敏性的BIPS來反向調節(jié)量子點的發(fā)射光譜，調節(jié)的效率可以通過改變BIPS

33、的數量來進行控制33。因此，光敏性開關或生物傳感器有望通過這樣的裝置來實現(xiàn)。圖5.2.3 基于530QD-MBP-Cy3-CD-Cy3.5間FRET的麥牙糖傳感器QDs-MBP偶聯(lián)物顯示了兩個優(yōu)點：(1)可以調節(jié)供體與受體之間的光譜重疊程度；(2)提供了一種單個供體可以和幾個受體同時作用的模型。說明QDs能夠同時與幾個受體作用，從而可以增強FRET信號、提高檢測的靈敏度，預示著使用單一QDs供體同時檢測幾個分析物將成為可能。Medintz等利用熒光量子點連接抗體片段發(fā)展了溶液相納米尺度傳感器的組裝34，將抗-TNT特定抗體片段通過金屬吸附作用連接到親水的量子點上，基于FRET對液相環(huán)境的2，4

34、，6-三硝基甲苯(TNT)進行了特定的檢測。CdSe-ZnS核-殼型量子點可以被制備成帶正電荷或負電荷的水溶性粒子，直徑為3-6nm；量子產率(QYs)超過70。Wargnier等以FRET為基礎研究了帶相反電荷的QDs之間以及帶相反電荷的QDs與納米金之間在水相中的組裝。Wargnier等將最大發(fā)射波長在563nm的紅色量子點(R-QDs)用巰基琥珀酸和巰基磺酸的混合液處理，使其表面帶負電荷；將最大發(fā)射波長分別在515nm和558nm的綠色量子點(G-QDs)和黃色量子點(Y-QDs)用巰基乙胺處理，使其表面帶正電荷；納米金粒子(NGs)帶負電荷，每一個NG的表面大約有l(wèi)8個羧基。由于帶相反

35、的電荷，G-QDs和R-QDs、Y-QDs和NGs之間由于庫侖引力而相互吸引，發(fā)生FRET。帶正電荷的供體G-QDs和Y-QDs熒光被猝滅，說明G-QDs和R-QDs之間、Y-QDs和NGs之間發(fā)生了組裝。保持受體的濃度不變，改變供體的濃度，發(fā)現(xiàn)R-QDs表面的平均電荷量是G-QDs的4倍，而Y-QDs和NGs表面所帶的電荷量比較接近。在R-QDs和G-QDs中可以形成一個受體幾個供體的組裝，預示可以發(fā)展以FRET為基礎的傳感器。圖5.2.4 (a)MBP-BIPS對QD發(fā)光的調制; (b)sulfo-NHS-BIPS的sP(左)和MC(右)形式由于光的波長、強度、曝光程度很容易控制。光驅動裝

36、置引起了人們很大的興趣。Medintz等34使用一個與蛋白質結合的光致色變的FRET受體，可逆地調制量子點的發(fā)光，從而制成一個光驅動調制器。1-3-2H-1-(2-羧基乙基)-3, 3-二甲基-6-硝基螺2H 1-苯并吡喃-2,2- (2H)-吲哚啉(BIPS)具有光致色變的性質，在UV光/白光照射下可逆地從無色的螺苯并吡喃(SP)變?yōu)橛猩幕ㄝ?MC)，MC可以作為FRET的受體。將BIPS用硫代-N-羥基-丁二酰亞胺(sulfo-NHS)活化后，標記到MBP上，再將其結合到QD的表面，這樣就形成了一個MBP-QD-BIPS融合物，圖5.2.4所示。當用UV光照射時，BIPS轉化為MC，由于

37、QD-MC之間的FRET，QD的熒光被猝滅；當用白光照射時，MC轉化為SP，QD的熒光顯著增加。通過改變染料/蛋白質的比率發(fā)現(xiàn)，可以通過改變結合到每個蛋白質上的BIPS的數目來調節(jié)QD的發(fā)光，使得使用這類納米材料制成光致色變裝置或傳感器成為可能。5.2.4 生物大分子相互作用生物大分子間的相互作用是生命活動中最基本的過程。對其進行深入的研究在醫(yī)學及生物學等領域都具有重要的意義，目前在國內外都是較熱門的課題。Willard等5以量子點作為能量轉移的供體，研究了蛋白質-蛋白質之間的特異性結合。他們將BSA生物素化(bBSA)后，結合到量子點的表面，形成QD-bBSA；用四甲基羅丹明(TMR)標記鏈

38、霉親和素(SAv)，形成SAv-TMR。將QD-bBSA和SAv-TMR在PBS緩沖液中進行結合檢測，通過改變SAv-TMR的濃度發(fā)現(xiàn)，隨著SAv-TMR的濃度增加，QD-bBSA所產生熒光強度逐漸減弱，SAv-TMR的熒光強度逐漸增加。這是由于QD-bBSA和SAv-TMR發(fā)生了特異性結合，QD-TMR之間產生了FRET，使得QD的熒光被猝滅，TMR的熒光增強(圖5.2.5)。為了做進一步證實，他們將未生物素化的BSA與QD相連，并檢測了QD-BSA和SAv-TMR混合液的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)SAv-TMR的熒光并未增強，說明QD-TMR之間的FRET主要是由于生物素-SAv之間的特異性結合所產生

39、的。這預示著將QD作為供體標記一種蛋白質，用有機染料標記另一種蛋白質，通過QD和染料之間的FRET可以觀察不同蛋白質之間的特異性結合，并可應用于均相免疫檢測、DNA雜交、酶-底物相互作用的設計中。Oh等35基于量子點與金納米粒子之間的FRET，研究了生物分子相互作用的抑制性分析。利用鏈霉親和素連接的量子點作為能量的供體，生物素連接的金納米粒子作為能量的受體，構成了一個FRET體系。當外源性圖5.2.5 FRET粘附分析示意圖地加入抗生物素時，由于抗生物素與生物素之間特定的相互作用，減少了鏈霉親和素連接量子點的熒光淬滅?？股锼氐臋z測域限達到10nmol·L-1。隨著不同濃度的外源性抗

40、生物素的加入，熒光淬滅的強度也存在著一定的定量關系，說明其設計可以作為生物分子特定性相互作用的高分辨定量分析?？紤]到量子點在水溶液中的分散穩(wěn)定性，Nagasaki等36在水溶液中利用CHO-PEG/PAMA共沉淀方法制備得到CdS量子點，即便是在濃度大的鹽溶液中，這種方法制備的量子點也保持了很好的穩(wěn)定性。他們利用量子點與熒光染料標記的蛋白質之間的FRET研究了一種新的分子識別體系：將粘附量子點的PEG末梢連接生物素作為配體分子，連有薔薇花紅染料分子的鏈霉親和素作為受體，通過配體和受體之間的特定的相互作用來識別鏈霉親和素。結果證明，熒光共振能量轉移確實來自連接在CdS量子點上的生物素與連有薔薇花

41、紅染料分子的鏈霉親和素之間特定的相互作用。5.2.5 生物大分子構象的變化生物大分子的結構是分子生物學研究的重點之一。分子特定的功能依賴于它所特有的結構。為了全面深入地了解生物大分子的功能，需要全面地了解生物大分子的結構，這對于研究和分析生物大分子的功能至關重要，一直以來都是廣大科研工作者研究的熱點。Medintz等32將6種不同的MBP突變體用羅丹明紅(RR)標記后，配位到QDs上。通過研究QDs-MBP-RR之間的FRET來確定這6種不同的MBP,RR受體和QDs供體之間的距離以及MBP-RR在QDs表面的位置和取向。這提供了一種可以確定蛋白質在QDs或其它球形納米粒子上位置的方法，這種方

42、法可能適用于觀察蛋白質連接到QDs表面時的折疊過程或構象的變化。圖5.2.6 量子點和染料Cy5FRET對的交叉連接動力學探針由于對距離變化的靈敏性，F(xiàn)RET在揭開生物分子內部活動的研究中顯示出獨特的優(yōu)勢。Hohng等37觀察了量子點和有機熒光團之間的單分子FRET，進一步利用單分子之間的FRET，獲得了兩對雙鏈DNA交叉連接模型的單分子構象變化信息(圖5.2.6)。在這里鏈霉親和素包裹的量子點不僅作為能量轉移的供體，還充當了連接基底的支架作用。雖然量子點和Cy5之間的能量轉移效率較低，但從高，低能量轉移的兩種狀態(tài)看來，證實了交叉連接構象的改變。5.2.6 癌癥治療的光敏劑在光動力學治療（PD

43、T）中，光，氧氣和光敏劑共同作用以選擇性地破壞目標組織。目標性也就在于光敏劑在癌細胞有選擇地滯留，濃縮從而達到激光或紫外光在癌變組織的直接照射。在氧氣的存在下，癌變組織同時暴露在光和光敏劑中能殺死癌細胞(圖5.2.7)。相對傳統(tǒng)的治療，光動力學治療侵害性更少，目標性更強，沒有聲波治療的劑量限制，因而治療幾乎沒有傷疤。量子點表面的多樣性功能化修飾，使之具有良好的水溶性和生物相容性，有利于PDT能量在機體中的傳送。自從Derfus等38證明量子點毒性受UV照射調節(jié)以來，量子點有望于殺死癌細胞。圖5.2.7 量子點誘發(fā)的光動力學治療的可能機理示意圖在PDT中，光敏劑受到光的激活，但并不是光敏劑直接與

44、組織細胞反應來殺死癌變細胞，而是通過臨近氧分子從三線態(tài)轉變?yōu)槟芘c細胞產生毒性反應的單線態(tài)氧來殺死癌變細胞。Samia等39通過FRET機理證明了CdSe量子點作為PDT光敏劑的可能性，為PDT光敏劑的發(fā)展開辟了新的思路。同時，量子點具有可調節(jié)的光學性質，有助于淺層和深層次的癌癥治療。Bakalova等40還研究了在更少毒性量子點存在下單線態(tài)氧的產生，并評價了不同表面包裹技術對單線態(tài)氧量子產率的影響。Lou等41研究了量子點生物連接癌細胞作為PDT傳統(tǒng)光敏劑具有的潛在優(yōu)勢。水溶性的CdSe量子點連接于與白血病有特別作用的抗-CD抗體上，量子點標記的細胞與正常的淋巴細胞混合同時受到有經典光敏劑存在

45、的紫外光的照射。結果表明，量子點抗-CD連接的白血病細胞對紫外光刺激敏感，同時增強了經典光敏劑的效果。量子點生物連接體作為PDT光敏劑或只是增強光敏藥物的效果都具有很好的應用前景，但量子點易聚集，釋放重金屬離子和光學穩(wěn)定性也是待解決的問題。因此，人們應更清楚地認識到量子點獨特的光學性質和實際應用之間存在的差距，更好地了解量子點在機體中吸收，代謝和毒性等機理。5.2.7 其他Patolsky等3利用FRET研究了在QDs表面進行的調節(jié)聚合反應和DNA復制動力學過程。Patolsky等將薔薇紅染料插入到新合成的調聚物或DNA復制物中，通過觀察QDs-薔薇紅染料之間FRET信號隨時間的變化，來研究調

46、節(jié)聚合反應和DNA復制的動力學。這個體系除了可以應用于探測酶作用于DNA的過程，也有望應用于癌細胞的快速、靈敏的檢測。掃描近場光學顯微術(SNOM) 42, 43由于其分辨率突破了Abbe衍射極限，自1980年代中期由Phol在技術上實現(xiàn)以來，在10多年的時間內獲得了迅速的發(fā)展，為生物亞顯微形態(tài)學及超微結構的生物學研究提供了一種有力的工具，在很多領域有很廣闊的應用前景。Sekatskii等提出將FRET原理應用于SNOM中以提高其分辨率，但其中存在著幾個問題：如探針在掃描樣品時，其距離上不能超過Förster半徑，這就要求探針的機械性能比較穩(wěn)定；以及含有供體的探針光漂白速率比較快等。

47、Müller等采用了一個新的供體-受體對可以很好地解決以上問題。他們將CdTe納米粒子連接到聚苯乙烯微球的表面，再將微球連接到SNOM的探針上；用Alexafluor標記樣品分子，形成一個FRET-SNOM體系，并報道了第一例用這個探針進行FRET-SNOM成像。結果表明，這種體系很有希望用于FRET-SNOM或者研究納米晶與單分子之間的受控相互作用。在FRET中，量子點不但可以作為供體，還可以作為受體。BSA是目前研究得最多的蛋白質之一，可以作為研究蛋白質-量子點偶聯(lián)的一個比較簡便的模型。Mamedova等44用戊二醛(G)作偶聯(lián)劑，研究了BSA與CdTe納米粒子之間的生物偶聯(lián)。C

48、dTe納米粒子表面用L-半胱氨酸修飾，G的一個醛基形成Schiff堿與量子點表面的L-半胱氨酸的氨基結合，另一個醛基與BSA中的賴氨酸以相同的鍵結合，這樣就形成了BSA-G-CdTe偶聯(lián)物。為了證實BSA-G-CdTe的形成，進一步研究發(fā)現(xiàn)：(1)BSA與CdTe主要形成1:1的偶聯(lián)物，其中含有少量的2:1的偶聯(lián)物；(2)偶聯(lián)后，蛋白質的三級結構大部分保持完整。用290nm的紫外光激發(fā)BSA-G-CdTe偶聯(lián)物時，發(fā)現(xiàn)BSA中色氨酸在340nm處所發(fā)射的熒光完全被猝滅，而CdTe的熒光強度增加了一倍，說明發(fā)生了類似于經典Förster能量轉移的過程，量子點通過共振能量轉移從蛋白質的色

49、氨酸基團中吸收能量。水溶性量子點由于表面覆有聚合物或蛋白質，造成粒子尺寸的增加，可能使FRET減弱或消失。而疏水性量子點的量子產率比水溶性量子點高，穩(wěn)定性好，并且許多生物過程發(fā)生在脂膜內，所以近來有科學家直接將疏水性量子點用于FRET研究。Kloepfer等45將疏水性CdSe量子點埋入脂膜中，研究了量子點作為供體分別與水溶性的染料Cy3.5和脂溶性的染料DiD之間的FRET，以及量子點作為受體與脂溶性的染料3-4-(2-(6-(二丁胺基)-2-萘)-反式-乙烯基)吡啶)丙磺酸酯(di-4-ANEPPS)之間的FRET。第一次在模擬膜體系中探索了疏水性量子點的能量轉移過程。熒光量子點在其他FR

50、ET體系中的應用包括：通過DNA的互補作用將光淬滅劑金與熒光量子點相連46，并用這些熒光量子點來研究抗生物素和生物素之間的相互作用47。將熒光量子點與DNA引物相連作為供體與熒光核苷受體聯(lián)用來分析DNA復制和調聚作用的動力學問題3。熒光量子點也被作為FRET體系供體在分子燈中應用49。定位于脂質囊中的熒光量子點作為供體與脂溶性或水溶性染料的相互作用也得到了研究50。6 小結與展望與有機熒光分子相比較而言，量子點作為熒光能量共振轉移的供體或受體，具有許多特別的光學性質。首先，激發(fā)量子點的激發(fā)波長范圍很寬，因此不同大小的量子點可以由同一個波長的光激發(fā)。另外，量子點具有較大的斯托克斯位移和狹窄對稱的

51、熒光譜峰，這樣就允許同時使用不同光譜特征的量子點，而發(fā)射光譜不交疊(Overlap)，或只有很少交疊。由于大小不同、材料不同的量子點受到光激發(fā)后發(fā)出一系列不同光譜的光，且發(fā)射的熒光強度足以使光學設備檢測到單個的量子點，當標記有不同量子點的兩個生物分子互相靠近，在這一區(qū)域的光譜就會發(fā)生變化，甚至發(fā)生能量轉移，就可以及時地觀察到整個過程的動態(tài)變化。盡管基于量子點的FRET得到了廣泛的應用，也取得了很大的成就，但還有許多有待改善的地方。如QDs的核比較大，在使用發(fā)射波長較長的QDs(例如，最大發(fā)射波長大于600nm)作為FRET的供體，或者使用比較大的蛋白質(如抗體)時，供-受體之間的距離有可能超過

52、10nm，使FRET的信號減弱或者無FRET發(fā)生。所以發(fā)展以QDs為基礎的FRET，可以從以下幾個方面展開探索和研究。(1)優(yōu)化能量傳遞的供體和受體，以增加能量轉移的效率：根據所要識別的物質的性質選擇合適的供體和受體，并且供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜要能夠有效的重疊，在供體的有效激發(fā)波長下能夠避免對受體的直接激發(fā)；此外供體和受體在供體的量子率、受體的消光系數、生物兼容性和抗干擾能力等方面均有要求。(2)為了在發(fā)生FRET時有足夠的信號改變，在使用QDs生物偶聯(lián)物時，可以根據受體配體的選擇性來選擇合適的中間體生物分子。(3)由于QDs的表面性質會影響它們在細胞環(huán)境下的穩(wěn)定性，因此在應用于細胞分

53、析領域時，對此須做進一步的改進。(4)將疏水性QDs直接用于FRET。與新技術、新材料的結合，使FRET對生物檢測的發(fā)展起到了更大的推動作用，在均相免疫檢測、生物大分子相互作用和構象變化的研究方面，以及發(fā)展以FRET為基礎的傳感器、生物芯片以及納米分析器件等方面將會有很好的前景，并將在環(huán)境檢測、生物防御等一系列領域有廣泛的應用。參考文獻1. a) Lakowicz, J. RPrinciples of Fluorescence Spectroscopy(2nd ed). New York: Kluwer academic, 1999. b) Stryer, L.; Haugland, R. P

54、. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967, 58, 719- 726.2. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. London: Academic Press, 1996.3. Patolsky, F.; Gill, R.; Weizmann, Y. et al. Lighting-up the dynamics of telomerization and DNA replication by CdSe-ZnS quantumdots. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13918-13919.4

55、. Medintz, I. L.; Clapp, A. R.; Mattoussi H. et al. Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors. Nat. Mater. 2003，2, 630-6385. Willard, D. M.; Lori, L.; Carillo, J. J. et al. CdSe-ZnS quantum dots as resonance energy transfer donors in a model protein-protein binding assay.

56、Nano Lett. 2001, 1, 469-4746. Tran, P. T.; Goldman, E. R.; Anderson, G. P. et al. Use of luminescent CdSe-ZnS nanocrystal bioconjugates in quantum dot-based nanoseneors. Physica Status Solidi-B. 2002, 229, 427-4327. Qu, L.; Peng, X. Control of photoluminescence properties of CdSe nanocrystals in gro

57、wth. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 2049-2055.8. Zhong, X.; Feng, Y.; Knoll, W. et al. Alloyed Zn(x)Cd(1-x)S nanocrystals with highly narrow luminescence spectral width. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13559-13563.9. Bailey, R. E.; Nie, S. Alloyed semiconductor quantum dots：Tuning the optical properties

58、without changing the particle size. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7100- 7106.10. Leatherdale, C. A.; Woo, W. K.; Mikulec, F. V. et al. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B. 2002，106, 7619 -7622.11. Bruchez, M. Z.; Moronen, M.; Gin, P. et al. Semi-conductor nanocrystals as fluorescent biological labels Science. 1998, 281, 2013-2016.12. Chan, W. C.; Nie, S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive noni