高二生物血紅蛋白的提取和分離

1、課題課題3血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離課標領(lǐng)航課標領(lǐng)航1概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。的基本原理。2能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，能根據(jù)凝膠色譜過程中的現(xiàn)象和結(jié)果，評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結(jié)評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結(jié)果。果。3嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本體驗從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本過程和方法。過程和方法?！局攸c重點】凝膠色譜法、電泳法基本原理。凝膠色譜法、電泳法基本原理?！倦y點難點】實驗操作的過程及分析。實驗操作的過程

2、及分析。課題背景課題背景為年老多病的人注射丙種為年老多病的人注射丙種球蛋白，可以在一定程度上增強球蛋白，可以在一定程度上增強其身體的抵抗力。在動物體內(nèi)，其身體的抵抗力。在動物體內(nèi)，丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合丙種球蛋白和許多蛋白質(zhì)混合在一起。要獲得純凈的丙種球蛋在一起。要獲得純凈的丙種球蛋白制品，就必須進行提取和分離。白制品，就必須進行提取和分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)了樣品中各種子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)了樣品中各種

3、分子的分離。分子的分離。基礎(chǔ)自主梳理基礎(chǔ)自主梳理一、凝膠色譜法一、凝膠色譜法1依據(jù)依據(jù)2概念概念3原理原理4 4結(jié)合結(jié)合P64下面和下面和P65上面，畫出分離方法的上面，畫出分離方法的表格表格5 注意事項注意事項二、緩沖溶液二、緩沖溶液1作用作用2配制配制3意義意義三、電泳三、電泳1概念概念2原理原理3作用過程作用過程4方法方法核心要點突破核心要點突破解讀實驗原理解讀實驗原理1蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運動情況分析蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運動情況分析相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量小相對分子質(zhì)量小直徑大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨贝笥谀z顆?？障吨睆綇叫∮谀z顆?？障吨毙∮谀z顆?？障吨睆綇竭\動

4、方式運動方式垂直向下運動垂直向下運動無規(guī)則的擴散運動無規(guī)則的擴散運動運動速度運動速度較快較快較慢較慢運動路程運動路程較短較短較長較長洗脫次序洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出先從凝膠柱中洗脫出來來后從凝柱中洗脫出來后從凝柱中洗脫出來四、實驗操作四、實驗操作原則：依據(jù)每一種蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)原則：依據(jù)每一種蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)血液、紅細胞、血紅蛋白的組成血液、紅細胞、血紅蛋白的組成1樣品處理：樣品處理： (1)紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌-離心去除血清離心去除血清 (2)血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放-蒸餾水漲破蒸餾水漲破 (3)分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液-離心處理離心處理思考感悟思考感悟 1洗滌紅細胞時

5、為什么不能用蒸餾水代替生理鹽洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水？水？【提示提示】生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。思考感悟思考感悟 2在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯的在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？目的是什么？【提示提示】(1)加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。(2)甲苯

6、的作用主要是溶解細胞膜。甲苯的作用主要是溶解細胞膜。細胞膜的主要細胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機溶劑，加入甲苯成分為磷脂，易溶于甲苯等有機溶劑，加入甲苯能加速紅細胞破裂并釋放出血紅蛋白。能加速紅細胞破裂并釋放出血紅蛋白。2粗分離：即透析粗分離：即透析 (1)方法方法 (2)目的：將樣品中相對分子質(zhì)量較小目的：將樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)除去。的雜質(zhì)除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由進出，原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。3純化：通過凝膠色譜柱將相對分子質(zhì)量較大的雜純化：通過凝膠色譜柱將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。操作如下：質(zhì)

7、蛋白除去。操作如下：(1)凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作取長取長40 cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。紙磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。目尼龍紗包好。頂塞的制作：打孔頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。特別提醒特別提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，

8、還塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。(2)凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填(本實驗使用的凝膠是交聯(lián)本實驗使用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠)固定：將色譜柱垂直固定在支架上固定：將色譜柱垂直固定在支架上 裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi)裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi) 洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h 注意事項注意事項:不能有氣泡存在；不能發(fā)生洗脫液流不能有氣泡存在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。(3)樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫a.準

9、備：加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面準備：加樣前，打開流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與上的緩沖液緩慢下降到與_平齊，關(guān)閉出平齊，關(guān)閉出口。口。b加樣：用吸管小心地將加樣：用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。c加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)內(nèi).洗脫：加入洗脫：加入_，打開下端出口，進，打開下端出口，進行洗脫。行洗脫。凝膠面凝膠面磷酸緩沖液磷酸緩沖液特別提醒特別提醒(1)滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同

10、時注意不要破壞凝膠面。同時注意不要破壞凝膠面。(2)在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功。說明色譜柱制作成功。4純度鑒定：判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求。純度鑒定：判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求。在鑒定的方法中，使用最多的是在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。五、操作提示五、操作提示1紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌2色譜柱填料的處理色譜柱填料的處理3凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填4蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離六、

11、結(jié)果分析與評價六、結(jié)果分析與評價【探規(guī)尋律探規(guī)尋律】對分離效果的判斷對分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。說明分離效果不好，裝填不成功?！净犹骄炕犹骄俊?1)凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項？事項？(2)血紅蛋白溶液是如何分離的？血紅蛋白溶液是如何分離的？【提示提示】(1)裝填前為了加速膨脹，可以加入裝填前

12、為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。內(nèi)的空氣。裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。象。(2)蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)離心原理進行的。當含有細蛋白質(zhì)的分離是根據(jù)離心原理進行的。當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重

13、力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場的強度及液體的黏度有關(guān)。像紅細胞大又與重力場的強度及液體的黏度有關(guān)。像紅細胞大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。下觀察到它們的沉降過程。 (2011年聊城高二檢測年聊城高二檢測)有關(guān)凝膠色譜法和有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是電泳法

14、的說法正確的是()A它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B它們的原理相同它們的原理相同C使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要需要D以上說法都正確以上說法都正確【嘗試解答嘗試解答】_A_【解析解析】凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分

15、子的分離。這兩種方度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度。法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度?！菊`區(qū)警示誤區(qū)警示】不同的蛋白質(zhì)在凝膠色譜中有三不同的蛋白質(zhì)在凝膠色譜中有三種運動情況：種運動情況：(1)分子很小，可進入凝膠全部內(nèi)孔隙；分子很小，可進入凝膠全部內(nèi)孔隙；(2)分子很大，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；分子很大，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；(3)分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)部分。相應(yīng)部分。跟蹤訓(xùn)練跟蹤訓(xùn)練下列各項中，一般不影響凝膠色譜法下列各項中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的分離度的是

16、分離蛋白質(zhì)的分離度的是()A層析柱的高度層析柱的高度B層析柱的直徑層析柱的直徑C緩沖溶液緩沖溶液 D樣品的分布樣品的分布解析：解析：選選B。分離度取決于柱高，為分離不同組。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱必須有適宜的高度，分離度與柱高的分，凝膠柱必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。樣品的分布也影響分離度，緩沖溶平方根相關(guān)。樣品的分布也影響分離度，緩沖溶液的液的pH影響蛋白質(zhì)所帶的電荷，因此也影響分影響蛋白質(zhì)所帶的電荷，因此也影響分離度。只有層析柱的直徑一般不會影響分離度。離度。只有層析柱的直徑一般不會影響分離度。 下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入加入(圖圖)和洗脫和洗脫(圖圖)示意圖，請據(jù)圖回答下列示意圖，請據(jù)圖回答下列問題。問題。( 1 ) 在 加 樣 示 意 圖 中 ， 正 確 的 加 樣 順 序 是在 加 樣 示 意 圖 中 ， 正 確 的 加 樣 順 序 是_。(2)用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是用吸管加樣時，應(yīng)注意正確操作，分別是 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 、 貼 著 管 壁 加 樣 、貼 著 管 壁 加 樣 、_。(3)等樣品等樣品_時，才加入緩沖液，待時，才加入緩沖液，待_接近色譜柱底端時，用試接近色譜柱底端時，用試管收