專題五 土壤微生物研究方法

1、專題四專題四 土壤土壤-微生物系統(tǒng)研究方法微生物系統(tǒng)研究方法 第一節(jié)第一節(jié) 土壤微生物研究概述土壤微生物研究概述 一、土壤微生物學(xué)的研究對(duì)象一、土壤微生物學(xué)的研究對(duì)象 土壤微生物多樣性：土壤微生物多樣性： 土壤微生物過(guò)程土壤微生物過(guò)程 土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系 n （一）土壤微生物的物種多樣性（一）土壤微生物的物種多樣性 土壤微生物的功能多樣性土壤微生物的功能多樣性 土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性 土壤微生物的遺傳多樣性土壤微生物的遺傳多樣性 1、土壤微生物功能多樣性：、土壤微生物功能多樣性： 指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度，主指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生

2、物的物種豐富度和均一度，主要從分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)角度對(duì)一定地域內(nèi)物種要從分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)角度對(duì)一定地域內(nèi)物種的現(xiàn)狀進(jìn)行研究。的現(xiàn)狀進(jìn)行研究。 目前主要通過(guò)培養(yǎng)基最大限度地培養(yǎng)各種菌落，由此了目前主要通過(guò)培養(yǎng)基最大限度地培養(yǎng)各種菌落，由此了解土壤中可培養(yǎng)的微生物種群。解土壤中可培養(yǎng)的微生物種群。 2、土壤微生物的功能多樣性、土壤微生物的功能多樣性 指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過(guò)程，對(duì)自然界元素循環(huán)具有重要意義的執(zhí)行過(guò)程，對(duì)自然界元素循環(huán)具有重要意義 如：分解功能、營(yíng)養(yǎng)傳遞功能以及促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)的如：分解功

3、能、營(yíng)養(yǎng)傳遞功能以及促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)的功能等。功能等。 目前一般采用底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式測(cè)算土壤微目前一般采用底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式測(cè)算土壤微生物群落的代謝功能多樣性。生物群落的代謝功能多樣性。 3、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性 指土壤微生物群落在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分上的多樣化程度，指土壤微生物群落在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分上的多樣化程度，這是導(dǎo)致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因這是導(dǎo)致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因 4、土壤微生物的遺傳多樣性、土壤微生物的遺傳多樣性 是土壤微生物在基因水平上攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺土壤微生物在基因水平上攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息的總和，這

4、是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映傳信息的總和，這是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映（二）土壤微生物過(guò)程（二）土壤微生物過(guò)程 土壤微生物是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力：土壤微生物是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力： 如如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖質(zhì)的分固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖質(zhì)的分 解和合成解和合成 土壤酶與微生物細(xì)胞一起推動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化土壤酶與微生物細(xì)胞一起推動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化 （三）土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系（三）土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系 如：全球變暖、森林銳減、土壤退化都與微生物如：全球變暖、森林銳減、土壤退化都與微生物 有關(guān)。有關(guān)。 二、土壤微生物研究方法進(jìn)程二、土壤微生物研究方法進(jìn)程 1676年，虎克用自

5、制的單式顯微鏡觀察到細(xì)菌個(gè)體年，虎克用自制的單式顯微鏡觀察到細(xì)菌個(gè)體 1897年，畢希納用無(wú)細(xì)胞酵母菌壓榨汁中的年，畢希納用無(wú)細(xì)胞酵母菌壓榨汁中的“酒花酶酒花酶” 對(duì)葡萄糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵成功，從而開(kāi)創(chuàng)了微生物生對(duì)葡萄糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵成功，從而開(kāi)創(chuàng)了微生物生 化研究的新時(shí)代化研究的新時(shí)代 1953年，沃森和克里克發(fā)表了關(guān)于年，沃森和克里克發(fā)表了關(guān)于DNA雙螺旋模型，雙螺旋模型， 整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段，是微整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段，是微 生物學(xué)發(fā)展史上成熟到來(lái)的標(biāo)志。生物學(xué)發(fā)展史上成熟到來(lái)的標(biāo)志。第二節(jié)第二節(jié) 土壤微生物的計(jì)數(shù)與分析土壤微生物的計(jì)數(shù)與分析 一、培養(yǎng)計(jì)數(shù)法

6、一、培養(yǎng)計(jì)數(shù)法 根據(jù)培養(yǎng)基上所生長(zhǎng)微生物的數(shù)量來(lái)根據(jù)培養(yǎng)基上所生長(zhǎng)微生物的數(shù)量來(lái)估算土壤中微生物的數(shù)量的方法估算土壤中微生物的數(shù)量的方法 稀釋平板法稀釋平板法 最大或然數(shù)法（最大或然數(shù)法（MPN稀釋法）稀釋法） 土粒法土粒法（一）一般微生物的分離與計(jì)數(shù)（一）一般微生物的分離與計(jì)數(shù) 稀釋平板法：稀釋平板法： 用已知質(zhì)量的土壤在適量的溶液中攪拌的時(shí)候，微生用已知質(zhì)量的土壤在適量的溶液中攪拌的時(shí)候，微生物和土壤分離，這些分開(kāi)的微生物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上物和土壤分離，這些分開(kāi)的微生物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)成為分散的菌落，根據(jù)菌落數(shù)換算得單位重量土壤中生長(zhǎng)成為分散的菌落，根據(jù)菌落數(shù)換算得單位重量土壤中

7、微生物的數(shù)量。土壤中微生物的數(shù)量很多，因此必須取少微生物的數(shù)量。土壤中微生物的數(shù)量很多，因此必須取少量樣品制成土壤懸液，然后稀釋，使發(fā)育在培養(yǎng)皿中的菌量樣品制成土壤懸液，然后稀釋，使發(fā)育在培養(yǎng)皿中的菌落可以很好地分散開(kāi)落可以很好地分散開(kāi)最大或然數(shù)法（最大或然數(shù)法（MPN稀釋法）稀釋法） 用于一些特殊功能菌的計(jì)數(shù)，如，硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌用于一些特殊功能菌的計(jì)數(shù)，如，硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌 假設(shè)被測(cè)定的微生物在稀釋液中均勻分布，并假設(shè)被測(cè)定的微生物在稀釋液中均勻分布，并在試管中全部存活，隨著稀釋倍數(shù)的加大，稀釋在試管中全部存活，隨著稀釋倍數(shù)的加大，稀釋液中微生物的數(shù)量將越來(lái)越少，直到將某一稀釋液中

8、微生物的數(shù)量將越來(lái)越少，直到將某一稀釋度的土壤稀釋液接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，沒(méi)有或度的土壤稀釋液接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，沒(méi)有或很少出現(xiàn)微生物，根據(jù)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌的最低稀釋很少出現(xiàn)微生物，根據(jù)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌的最低稀釋度和出現(xiàn)菌落的最高稀釋度計(jì)算土壤中微生物的度和出現(xiàn)菌落的最高稀釋度計(jì)算土壤中微生物的數(shù)量。數(shù)量。稀釋度稀釋度10-110-210-310-410-5生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)情況 +-+-讀數(shù)讀數(shù)55420該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長(zhǎng)的最高稀釋度的數(shù)量該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長(zhǎng)的最高稀釋度的數(shù)量指標(biāo)是指標(biāo)是5（10-2），出現(xiàn)菌落的最低稀釋度指標(biāo)是），出現(xiàn)菌落的最低稀釋度指標(biāo)是2（10-4），則該例

9、的數(shù)量指標(biāo)為），則該例的數(shù)量指標(biāo)為542，查重復(fù)為，查重復(fù)為5稀釋法稀釋法測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得近似值為測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得近似值為25gMPN /，單位干土重鮮土重?cái)?shù)量指標(biāo)首位稀釋倍數(shù)近似值菌落稀釋度稀釋度10-110-210-310-410-5生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)情況 +-+-+-讀數(shù)讀數(shù)54220 該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長(zhǎng)的稀釋度是該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長(zhǎng)的稀釋度是10-1，指標(biāo)，指標(biāo)是是5，后面還有三個(gè)稀釋度有數(shù)字，則將數(shù)量指標(biāo)最后一，后面還有三個(gè)稀釋度有數(shù)字，則將數(shù)量指標(biāo)最后一個(gè)數(shù)字（個(gè)數(shù)字（2）加到前一個(gè)數(shù)字（）加到前一個(gè)數(shù)字（2）即）即544，由表查得近似，由表查得近似值為值為35gMPN /

10、，單位干土重鮮土重?cái)?shù)量指標(biāo)首位稀釋倍數(shù)近似值菌落如果在所有試管都有微生物生長(zhǎng)的稀釋度后仍有三個(gè)數(shù)字如果在所有試管都有微生物生長(zhǎng)的稀釋度后仍有三個(gè)數(shù)字，土粒法土粒法 該法是將供試土壤顆粒，排列在適于某該法是將供試土壤顆粒，排列在適于某一生理類群微生物生長(zhǎng)的選擇性固體培一生理類群微生物生長(zhǎng)的選擇性固體培養(yǎng)基上，這一類微生物的菌落圍繞著顆養(yǎng)基上，這一類微生物的菌落圍繞著顆粒發(fā)育起來(lái)，由這些顆粒在試樣中所占粒發(fā)育起來(lái)，由這些顆粒在試樣中所占的百分?jǐn)?shù)可以得到這類菌在土壤中的含的百分?jǐn)?shù)可以得到這類菌在土壤中的含量及其近似值。量及其近似值。（二）、厭氧微生物的分離與計(jì)數(shù)（二）、厭氧微生物的分離與計(jì)數(shù) 充氮厭

11、氧培養(yǎng)法充氮厭氧培養(yǎng)法 用真空泵抽去真空干燥器中的空氣，用用真空泵抽去真空干燥器中的空氣，用N2、CO2H 或或H2代替。在真空干燥器中培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，可代替。在真空干燥器中培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，可 得表面菌落。得表面菌落。 焦性沒(méi)食子酸吸氧法焦性沒(méi)食子酸吸氧法 利用焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中能吸收游離氧來(lái)創(chuàng)造利用焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中能吸收游離氧來(lái)創(chuàng)造厭氧環(huán)境。厭氧環(huán)境。二、土壤微生物生物量的測(cè)定二、土壤微生物生物量的測(cè)定 氯仿熏蒸法氯仿熏蒸法 根據(jù)熏蒸和未熏蒸土壤釋放的根據(jù)熏蒸和未熏蒸土壤釋放的CO2的量計(jì)算生物量。的量計(jì)算生物量。 底物誘導(dǎo)呼吸法底物誘導(dǎo)呼吸法 在土壤中加入容易分解的底物進(jìn)

12、行培養(yǎng)，根據(jù)在土壤中加入容易分解的底物進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)CO2釋釋放量計(jì)算。放量計(jì)算。 腺苷三磷酸測(cè)定法腺苷三磷酸測(cè)定法 通過(guò)測(cè)定土壤中通過(guò)測(cè)定土壤中ATP的量測(cè)定土壤微生物量的量測(cè)定土壤微生物量第三節(jié) 土壤微生物多樣性分析 土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度,是是調(diào)節(jié)和維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)和維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵因素。她包括微生物群落多樣性、結(jié)因素。她包括微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性。構(gòu)多樣性及遺傳多樣性。研究方法研究方法 基于培養(yǎng)和分離手段來(lái)揭示土壤微生物的群基于培養(yǎng)和分離手段來(lái)揭示

13、土壤微生物的群落變化。落變化。 基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、基于生物指示分子（如磷脂脂肪酸、DNA及及RNA）變異模式的土壤微生物多樣性）變異模式的土壤微生物多樣性一、微生物功能多樣性研究方法一、微生物功能多樣性研究方法 指土壤微生物群落所能執(zhí)行指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過(guò)程，如分解功能、營(yíng)養(yǎng)傳遞功過(guò)程，如分解功能、營(yíng)養(yǎng)傳遞功能等能等BIOLOG碳素利用法：碳素利用法： 是由美國(guó)是由美國(guó)BIOLOG公司于公司于1989年開(kāi)發(fā)成功，最初應(yīng)用年開(kāi)發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物的鑒定，于純種微生物的鑒定，1991年開(kāi)始應(yīng)用于土壤微生物群年開(kāi)始應(yīng)

14、用于土壤微生物群落功能多樣性研究，目前以使用落功能多樣性研究，目前以使用BIOLOG ECO（生態(tài)板）（生態(tài)板）板最為實(shí)惠而受歡迎。板最為實(shí)惠而受歡迎?；驹恚夯驹恚?土壤微生物細(xì)胞利用土壤微生物細(xì)胞利用31種碳源進(jìn)行代種碳源進(jìn)行代謝，以代謝過(guò)程產(chǎn)生的酶與四唑類顯謝，以代謝過(guò)程產(chǎn)生的酶與四唑類顯色物質(zhì)（如色物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應(yīng)）發(fā)生顏色反應(yīng)的濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯性的濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯性排列技術(shù)分析土壤微生物的代謝特征排列技術(shù)分析土壤微生物的代謝特征指紋圖譜，反映不同環(huán)境條件引起的指紋圖譜，反映不同環(huán)境條件引起的土壤微生物群落變化土壤微生物群落變化 BIOL

15、OG 測(cè)試板含有測(cè)試板含有96個(gè)小孔，除對(duì)照外，個(gè)小孔，除對(duì)照外，其余孔內(nèi)分別含有不同的有機(jī)碳源和一種指示其余孔內(nèi)分別含有不同的有機(jī)碳源和一種指示劑，通過(guò)接種菌懸液，根據(jù)微生物對(duì)碳源利用劑，通過(guò)接種菌懸液，根據(jù)微生物對(duì)碳源利用時(shí)指示劑顏色變化差異來(lái)鑒定微生物群落功能時(shí)指示劑顏色變化差異來(lái)鑒定微生物群落功能多樣性多樣性該法優(yōu)點(diǎn)該法優(yōu)點(diǎn)靈敏度高、分辨力強(qiáng)靈敏度高、分辨力強(qiáng)無(wú)需分離培養(yǎng)純種微生物，可以最大限度地?zé)o需分離培養(yǎng)純種微生物，可以最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征保留微生物群落原有的代謝特征測(cè)定簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)讀取與記錄可以由計(jì)算機(jī)輔測(cè)定簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)讀取與記錄可以由計(jì)算機(jī)輔助完成助完成可以連續(xù)監(jiān)

16、測(cè)微生物的變化，可批量分析可以連續(xù)監(jiān)測(cè)微生物的變化，可批量分析該法缺點(diǎn)該法缺點(diǎn)特別依賴于群體生理活性，不能監(jiān)測(cè)休眠體，特別依賴于群體生理活性，不能監(jiān)測(cè)休眠體，也不能檢測(cè)那些不能利用也不能檢測(cè)那些不能利用BIOLOG碳源底物的碳源底物的群體；群體；如果不能很好地解釋一個(gè)區(qū)系中微生物種類如果不能很好地解釋一個(gè)區(qū)系中微生物種類的相互作用如何影響底物的利用情況，很難把的相互作用如何影響底物的利用情況，很難把這些變化同種類變化聯(lián)系起來(lái)；這些變化同種類變化聯(lián)系起來(lái)；測(cè)定是微生物在與野外環(huán)境完全不同的溶液測(cè)定是微生物在與野外環(huán)境完全不同的溶液中的代謝活性，因此，也不能確定它的結(jié)果能中的代謝活性，因此，也不能

17、確定它的結(jié)果能否反映土壤區(qū)系的實(shí)際代謝情況；否反映土壤區(qū)系的實(shí)際代謝情況；二、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性分析二、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性分析 磷脂脂肪酸法也稱為磷脂脂肪酸法也稱為PLEA法法 （phospholipid fatty acid 法）；法）； 磷酸脂肪酸是所有微生物細(xì)胞膜磷脂的組分，具有結(jié)構(gòu)多磷酸脂肪酸是所有微生物細(xì)胞膜磷脂的組分，具有結(jié)構(gòu)多樣性和較高的生物學(xué)特異性，用磷酸脂肪酸作為標(biāo)記物來(lái)樣性和較高的生物學(xué)特異性，用磷酸脂肪酸作為標(biāo)記物來(lái)研究鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化。研究鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化?；驹砘驹?PLEA是構(gòu)成活體生物細(xì)胞膜的重要組分，不是構(gòu)成活體生物細(xì)胞

18、膜的重要組分，不同類群微生物能通過(guò)相應(yīng)生化途徑形成特定同類群微生物能通過(guò)相應(yīng)生化途徑形成特定的的PLEA，使部分，使部分PLEA總是出現(xiàn)在同一類群總是出現(xiàn)在同一類群的衛(wèi)生中，作為區(qū)分活體微生物群落生物標(biāo)的衛(wèi)生中，作為區(qū)分活體微生物群落生物標(biāo)記的基礎(chǔ)。以此根據(jù)脂肪酸的種類及組分比記的基礎(chǔ)。以此根據(jù)脂肪酸的種類及組分比例可鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性變化。例可鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性變化。該法的缺點(diǎn)該法的缺點(diǎn) 很難從種的水平鑒定微生物類群，只能鑒定到屬很難從種的水平鑒定微生物類群，只能鑒定到屬 該法依賴于標(biāo)記脂肪酸，該法依賴于標(biāo)記脂肪酸， PLEA的組成和濃度可能的組成和濃度可能受土壤微生

19、物生長(zhǎng)發(fā)育及其外界環(huán)境的影響，難受土壤微生物生長(zhǎng)發(fā)育及其外界環(huán)境的影響，難以區(qū)別死與活的微生物，給微生物群落結(jié)構(gòu)的定以區(qū)別死與活的微生物，給微生物群落結(jié)構(gòu)的定性和定量分析帶來(lái)了一定困難。性和定量分析帶來(lái)了一定困難。 土壤中土壤中PLEA標(biāo)記物的組成及其穩(wěn)定性受提取方法、標(biāo)記物的組成及其穩(wěn)定性受提取方法、提取條件等因素直接影響提取條件等因素直接影響三、土壤微生物遺傳多樣性的分析三、土壤微生物遺傳多樣性的分析 指土壤微生物在基因水平所攜指土壤微生物在基因水平所攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息的綜合，是微生物多樣性的本的綜合，是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映質(zhì)和最終反映 基于雜交

20、的分析方法基于雜交的分析方法(fish技術(shù)技術(shù)) 基于基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，（聚合酶鏈反應(yīng)，polymerase chain reaction ）的分析方法）的分析方法基于基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，（聚合酶鏈反應(yīng)，polymerase chain reaction ）的分析方法）的分析方法 土壤土壤DNA提取與純化提取與純化 PCR：PCR能快速特性性擴(kuò)增任何已知序列，并能將能快速特性性擴(kuò)增任何已知序列，并能將pg水平的水平的DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增到混合物中的目的基因擴(kuò)增到ng、ug、mg級(jí)的級(jí)的特異性片段特異性片段 變性處理和分析檢測(cè)：電泳和酶切變性處理和分析檢測(cè)：電泳和酶切海南福

21、山香蕉園土壤微生物多樣性分析過(guò)程海南福山香蕉園土壤微生物多樣性分析過(guò)程 16S rRNA基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增 轉(zhuǎn)化宿主轉(zhuǎn)化宿主 構(gòu)建構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)基因文庫(kù) HhaI酶切酶切 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù). .香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性分析流程香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性分析流程總總DNA的提取的提取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落PCR 挑選測(cè)序、挑選測(cè)序、Blast分析分析多樣性分析多樣性分析 16S rRNA基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增 轉(zhuǎn)化宿主轉(zhuǎn)化宿主 構(gòu)建構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)基因文庫(kù) HhaI酶切酶切 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)4.4.香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性分析香蕉地土壤細(xì)菌種

22、類多樣性分析總總DNA的提取的提取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落PCR 挑選測(cè)序、挑選測(cè)序、Blast分析分析多樣性分析多樣性分析（1）庫(kù)容coverage C文庫(kù)的庫(kù)容計(jì)算：isiippHln1NnC11（2）ShannonWiener指數(shù)的計(jì)算（3）物種均勻度指數(shù)的計(jì)算公式MaxHHE （4）物種優(yōu)勢(shì)度Simpson指數(shù)的計(jì)算公式 siipD121（5）物種豐富度Margalef指數(shù)的計(jì)算公式NSdln1max多樣性指數(shù)計(jì)算多樣性指數(shù)計(jì)算香蕉園土壤真菌種類多樣性分析 香蕉園土壤總DNA進(jìn)行ITS片段擴(kuò)增 篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落PCR 選擇克隆子測(cè)序并比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 測(cè)得序列提交

23、GeneBank香蕉根際土壤樣品的香蕉根際土壤樣品的DNA含量和含量和DNA純度比較純度比較土壤樣品土壤樣品DNADNA純度純度濃度濃度g/mlg/ml干土干土gDNA/ggDNA/gODOD260260/OD/OD230230ODOD260260/OD/OD280280發(fā)病蕉園發(fā)病蕉園 直接法直接法1.571.571.761.760.0960.0960.960.96 間接法間接法1.401.401.691.690.2560.2560.510.51健康蕉園健康蕉園 直接法直接法1.631.631.641.640.0880.0880.880.88 間接法間接法1.481.481.781.780.

24、2110.2110.420.42香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性 圖圖4 4 土壤總土壤總DNA的的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)擴(kuò)增結(jié)果果本研究采用的本研究采用的PCR循環(huán)次數(shù)是循環(huán)次數(shù)是15次，同時(shí)做次，同時(shí)做10管，將管，將PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物回收后混合均勻，減少回收后混合均勻，減少PCRPCR偏向性偏向性的影響，以保證所構(gòu)建的文庫(kù)準(zhǔn)的影響，以保證所構(gòu)建的文庫(kù)準(zhǔn)確。確。香蕉地土壤總香蕉地土壤總DNA16SrDNA16SrDNA片段擴(kuò)增片段擴(kuò)增香蕉園土壤微生物多樣性參數(shù)香蕉園土壤微生物多樣性參數(shù)表表3 3 土樣土樣16SrDNA文庫(kù)的微生物多樣性參數(shù)文庫(kù)的微生物多樣性參數(shù)文庫(kù)文庫(kù)RFL

25、PRFLP庫(kù)容庫(kù)容香農(nóng)香農(nóng)-維納指數(shù)維納指數(shù)均勻度指數(shù)均勻度指數(shù)優(yōu)勢(shì)度指數(shù)優(yōu)勢(shì)度指數(shù)豐富度指數(shù)豐富度指數(shù)編號(hào)編號(hào)類型類型C CH HE ED Dd dmaxmax發(fā)病蕉園發(fā)病蕉園212196%96%1.711.710.560.560.970.974.344.34健康蕉園健康蕉園474793.5%93.5%3.593.590.930.930.920.928.878.87測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析表表4 4 發(fā)病香蕉園土壤發(fā)病香蕉園土壤16S rDNA文庫(kù)部分克隆子測(cè)序分析文庫(kù)部分克隆子測(cè)序分析編號(hào)編號(hào)所屬物種所屬物種E E值值同源性同源性所屬門所屬門D1B5D1B5Streptomyces

26、Streptomyces sp. sp.（鏈霉菌屬）（鏈霉菌屬）0.00.0100%100%放線菌門放線菌門D1B7D1B7NitrospiraNitrospira sp. sp.（硝化螺菌屬）（硝化螺菌屬）0.00.096%96%硝化螺旋菌門硝化螺旋菌門D1B11D1B11Uncultured Acidobacteria Uncultured Acidobacteria bacteriumbacterium0.00.097%97%未培養(yǎng)酸桿菌門未培養(yǎng)酸桿菌門D1B17D1B17 AcidobacteriumAcidobacterium sp. sp. （酸桿菌屬）（酸桿菌屬）0.00.094

27、%94%酸桿菌門酸桿菌門D1B19D1B19Uncultured prokaryoteUncultured prokaryote0.00.094%94%未培養(yǎng)原核生物未培養(yǎng)原核生物D1B24D1B24 Chloroflexus Chloroflexus sp.sp.（綠彎菌屬）（綠彎菌屬）0.00.095%95%綠屈撓菌門綠屈撓菌門D1B31D1B31ClostridiumClostridium sp. sp. （梭菌屬）（梭菌屬）0.00.099%99%厚壁菌門厚壁菌門發(fā)病香蕉園病土壤發(fā)病香蕉園病土壤16S rDNA文庫(kù)的克隆子有文庫(kù)的克隆子有6 6個(gè)屬，個(gè)屬，大約有大約有29%屬于厚壁菌門

28、，屬于厚壁菌門，22%屬于放線菌門，還有少屬于放線菌門，還有少部分屬于硝化螺旋菌門、酸桿菌門、綠屈撓菌門等部分屬于硝化螺旋菌門、酸桿菌門、綠屈撓菌門等。編號(hào)編號(hào)所屬種屬所屬種屬E E值值同源性同源性所屬門所屬門D2B006D2B006Streptomyces sp. （鏈霉菌屬）（鏈霉菌屬）0.00.0100%100%放線菌門放線菌門D2B007D2B007Oscillatoria sp. （顫藻屬）（顫藻屬）0.00.099%99%藍(lán)藻門藍(lán)藻門D2B011D2B011Clostridium sp.（梭菌屬梭菌屬）0.00.094%94%厚壁菌門厚壁菌門D2B015D2B015Azospiri

29、llum sp. （固氮螺菌屬）（固氮螺菌屬）0.00.087%87%-變形菌綱變形菌綱D2B016D2B016Sphingomonas sp.（鞘脂單胞菌屬（鞘脂單胞菌屬）0.00.097%97%-變形菌綱變形菌綱D2B022D2B022Clostridium sp.（梭菌屬）（梭菌屬）0.00.094%94%厚壁菌門厚壁菌門D2B027D2B027Nitrospira sp.（硝化螺菌屬）（硝化螺菌屬）0.00.096%96%硝化螺旋菌門硝化螺旋菌門D2B056D2B056Enterobacter sp.（腸桿菌屬）（腸桿菌屬）0.00.099%99%-變形菌綱變形菌綱D2B064D2B0

30、64Acinetobacter sp.（不動(dòng)桿菌屬）（不動(dòng)桿菌屬）0.00.0100%100%-變形菌綱變形菌綱D2B075D2B075Bacillus sp.（芽孢桿菌屬）（芽孢桿菌屬）0.00.091%91%厚壁菌門厚壁菌門D2B101D2B101Sinorhizobium sp.（中華根瘤菌屬）（中華根瘤菌屬）0.00.088%88%-變形菌綱變形菌綱D2B121D2B121Acidobacteriales sp.sp.（酸桿菌屬）（酸桿菌屬）0.00.097%97%酸桿菌門酸桿菌門D2B154D2B154Lysinibacillus sp. . （屬（屬芽孢桿菌科芽孢桿菌科）0.00.

31、099%99%厚壁菌門厚壁菌門D2B165D2B165Dokdonella sp.（屬（屬黃色單胞菌科黃色單胞菌科）0.00.098%98%-變形菌綱變形菌綱表表5 健康香蕉園土壤健康香蕉園土壤16S rDNA文庫(kù)部分克隆子測(cè)序分析文庫(kù)部分克隆子測(cè)序分析健康香蕉園土壤健康香蕉園土壤16S rDNA文庫(kù)的克隆子中有文庫(kù)的克隆子中有1414個(gè)屬，變個(gè)屬，變形菌門占形菌門占42%42%，厚壁菌門占，厚壁菌門占26%26%，放線菌門占，放線菌門占11%11%，酸桿菌，酸桿菌門占門占6%6%，還有藍(lán)藻門、硝化螺旋菌門等，還有藍(lán)藻門、硝化螺旋菌門等，圖圖6 6 基于基于16SrDNA16SrDNA序列的發(fā)

32、病香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)序列的發(fā)病香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)B圖圖6 6 基于基于16SrDNA16SrDNA序列的健康香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)序列的健康香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)B香蕉地土壤真菌種類多樣性香蕉地土壤真菌種類多樣性圖圖7 土壤總土壤總DNA的的ITS擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增結(jié)果香蕉地土樣總香蕉地土樣總DNA的的ITS序列擴(kuò)增序列擴(kuò)增編號(hào)編號(hào)所屬種屬所屬種屬E E值值同源性同源性D1I1Fusarium sp. ( (鐮刀菌屬鐮刀菌屬) )0.00.099%99%D1I2Stenella musicola( (疣絲孢疣絲孢屬屬) )0.00.095%95%D1I14Dioscorea polystachya( (薯蕷屬薯蕷屬) )0.00.090%90%D1I16Cladosporium musae( (枝孢屬枝孢屬) )0.00.099%99%D1I20Urostyla grandis( (尾尾枝