生物藥物分析與檢驗(yàn) 第三章 免疫分析法

1、第三章第三章 免疫分析法免疫分析法一、一、概述概述二、二、抗原抗原三、三、抗體與免疫反應(yīng)抗體與免疫反應(yīng)四、四、免疫分析方法及應(yīng)用免疫分析方法及應(yīng)用五、五、免疫擴(kuò)散法免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、一、概述概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法五、免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容主要內(nèi)容 免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對(duì)機(jī)體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理損傷的機(jī)制，研究有效的免疫措施，實(shí)現(xiàn)以防病，治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。一、概述一、概述 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？ 基于抗原和抗體的特

2、異性反應(yīng)基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)手段?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。高選擇性和低檢出限。 在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于抗原或抗體的檢測(cè)，用于免疫學(xué)診斷。(1) 在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測(cè)定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2) 在藥物的臨床檢測(cè)中在藥物的臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超過安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血

3、液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；(3) 在藥物生產(chǎn)中在藥物生產(chǎn)中，從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效組分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過程的在線監(jiān)測(cè)；(4) 對(duì)藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在藥物分析中，免疫分析法的在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：應(yīng)用主要集中在以下幾方面：免疫分析免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來選擇性識(shí)別和測(cè)定，可以作為抗體或抗原的待測(cè)物.免疫分析方法免疫分析方法非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標(biāo)記免疫分析標(biāo)記免疫分析標(biāo)記物標(biāo)記物有無有無非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分

4、析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析熒光免疫分析電化學(xué)免疫分析電化學(xué)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫分析免疫分析免疫分析檢測(cè)的發(fā)展免疫分析檢測(cè)的發(fā)展放射免疫檢測(cè)放射免疫檢測(cè)（興起于（興起于2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代年代) )酶聯(lián)免疫檢測(cè)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于（興起于2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代，年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)疫檢測(cè)技術(shù)（2020世紀(jì)世紀(jì)9090年代開始推廣使年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。 特點(diǎn)特點(diǎn)可逆性可逆性比例

5、性比例性反應(yīng)階段性反應(yīng)階段性特異性特異性免疫分析法的特點(diǎn)免疫分析法的特點(diǎn)特異性特異性特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ): :抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性空間構(gòu)型的互補(bǔ)性可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。影響因素：影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親

6、合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離牢固，越不易解離 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度 比例性和比例性和反應(yīng)階段性反應(yīng)階段性比例性：比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系量比關(guān)系前帶前帶(prezone)：抗體過量：抗體過量后帶后帶(postzone)：抗原過量：抗原過量等價(jià)帶等價(jià)帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適：抗原抗體比例合適 一、概述一、概述二、二、抗原抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法五、免疫擴(kuò)散法主要內(nèi)容主要內(nèi)容抗原（抗

7、原（antigen,Ag)：是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)抗原的兩種特性：免疫原性和抗原性（免疫反應(yīng)抗原的兩種特性：免疫原性和抗原性（免疫反應(yīng)性）性）免疫原性（免疫原性（immunogenicity),能刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的能力。免疫反應(yīng)性免疫反應(yīng)性能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)稱為完全抗原完全抗原 只有抗原性而不具有免疫原性的物質(zhì)稱為半抗原半抗原 半抗原+蛋白質(zhì)完全抗原 賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)稱為載體。載體。2.1 定義定義1.抗原的

8、免疫原性抗原的免疫原性抗原物質(zhì)必須具備的條件： 一、異物性 二、一定的理化性狀 三、完整性 四、宿主的遺傳性一、異物性一、異物性 異物是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與宿主的自身成分相異或機(jī)體的免疫細(xì)胞從未與它接觸過的物質(zhì)。異物性的物質(zhì)包括以下幾類： 1、異種物質(zhì) 如：馬血清蛋白、各種微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體而言都是異種物質(zhì)，具有強(qiáng)的免疫原性。 2、同種異體物質(zhì) 如：ABO血型抗原、人類主要組織相容性抗原。 3、自身抗原物質(zhì) 如：自身組織成分結(jié)構(gòu)改變、隱蔽性自身成分暴露構(gòu)成自身抗原。二、一定的理化性狀二、一定的理化性狀大分子膠體物質(zhì) 凡具有免疫原性的物質(zhì)，分子量都較大，一般在10kDa以上,在一定范圍內(nèi),分子量越

9、大免疫原性越強(qiáng)。一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu) 從化學(xué)組成來看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白質(zhì)，其免疫原性較強(qiáng)。從結(jié)構(gòu)來看，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜其免疫原性越強(qiáng)。分子構(gòu)象與易接近性 分子構(gòu)象是指抗原分子中一些特殊化學(xué)基團(tuán)的三維結(jié)構(gòu)，它決定抗原分子是否能與淋巴細(xì)胞表面的抗原受體相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化學(xué)基團(tuán)與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)的抗原受體相互接觸的難易程度。三、完整性三、完整性 具有一定理化性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸淋巴細(xì)胞，才能成為良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破壞了其結(jié)構(gòu)，就喪失了免疫原性。自然界中天然的抗原物質(zhì)有：蛋白質(zhì)、多

10、糖、核蛋白 四、宿主遺傳性四、宿主遺傳性抗原的免疫原性也與機(jī)體的應(yīng)答能力有關(guān)，同種動(dòng)物不同個(gè)體對(duì)同一種抗原的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，這種差異受遺傳因素控制，控制免疫應(yīng)答的基因稱為免疫應(yīng)答基因（immune response, Ir)。2.抗原的特異性抗原的特異性 抗原決定簇（基） 載體決定簇和半抗原決定簇 共同抗原和交叉反應(yīng)一、抗原決定簇一、抗原決定簇1、概念 抗原決定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱為表位（epitope)。表位的性質(zhì)、數(shù)目和空間構(gòu)象決定著抗原的特異性。抗原通過AD與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)

11、胞，引起免疫應(yīng)答。2、種類和數(shù)量 一個(gè)抗原分子可以有一種或多種不同的AD ，一種AD決定著一種特異性，多種AD決定著多種特異性3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相應(yīng)淋巴細(xì)胞所識(shí)別，稱功能性決定簇，存在抗原分子內(nèi)部的AD無激發(fā)免疫應(yīng)答的功能，稱隱蔽決定簇。只有經(jīng)理化因素處理后，使之暴露可能成為新的功能決定簇。4、大小 抗原決定簇的大小與相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相當(dāng)。一個(gè)蛋白質(zhì)抗原決定簇含5-7個(gè)氨基酸殘基一個(gè)多糖抗原決定簇含5-7個(gè)單糖一個(gè)核酸半抗原決定簇含6-8個(gè)核苷酸5、抗原結(jié)合價(jià)（antigenic valence)是指能和抗體分子結(jié)合的抗原決定簇的總數(shù)。半抗原為一價(jià)天然抗原的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜

12、，分子表面有多個(gè)決定簇為多價(jià) 構(gòu)象決定簇：序列上不相連而依賴于蛋白質(zhì)或多糖的空間構(gòu)象形成的決定簇，多暴露于分子表面。順序決定簇：一段相連的氨基酸序列所形成的決定簇，多位于抗原分子內(nèi)部。功能性AD：分子表面，易被識(shí)別。隱蔽性AD：分子內(nèi)部。B細(xì)胞決定簇：分子表面。T細(xì)胞決定簇：分子內(nèi)部。二、二、AD的分類的分類三、共同抗原和交叉反應(yīng)三、共同抗原和交叉反應(yīng) 兩種來源不同的抗原，除各有其主要的特異性抗原決定簇外，相互之間也存在部分相同的抗原決定簇，這種共有的抗原決定簇稱為共同抗原。 親緣關(guān)系很近的生物之間存在的共同抗原稱為類屬抗原。 無種屬關(guān)系的生物之間存在的共同抗原稱為異嗜性抗原。 一種共同抗原刺

13、激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可與其他含有共同抗原的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)。2.2 藥物分子的抗原性藥物分子的抗原性 1、藥物分子的免疫原性、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類藥物、多肽類藥物、激素類藥物也是完全抗原。 2、藥物分子的抗原特異性、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗原特異性可能會(huì)發(fā)生改變。 3、藥物分析中，為了得到高效價(jià)的抗血清，通常會(huì)與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗(yàn)。 常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)）半抗原和載體

14、結(jié)合的化學(xué)反應(yīng) 多肽類激素多肽類激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基縮合形成肽鍵 甾體甾體：甾體激素的羥基和酮基不能直接和載體蛋白形成有效的共價(jià)鍵，需要制備甾體的衍生物，通過含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連 抗生素抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價(jià)結(jié)合；氨基糖苷類抗生素用碳化二亞胺為連接劑實(shí)現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接在選擇結(jié)合半抗原的化學(xué)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮不同的連接方式可能對(duì)抗體的專一性產(chǎn)生不同的影響。半抗原沒有可以結(jié)合的官能團(tuán)時(shí)需要合成適當(dāng)?shù)难苌?。為得到特定抗原決定簇相對(duì)單純的合成抗原，需要根據(jù)半抗原的化學(xué)特性及連接產(chǎn)物的化學(xué)

15、特性選擇連接的半抗原。（2）半抗原和載體的選擇原則）半抗原和載體的選擇原則p半抗原選擇原則：半抗原選擇原則： 最好含有芳香結(jié)構(gòu)； 應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)的微環(huán)境； 合理利用分子類似物之間的交叉反應(yīng)。p載體選擇原則：載體選擇原則： 應(yīng)考慮載體對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響：選擇的載體應(yīng)和檢測(cè)體系不發(fā)生交叉反應(yīng)；用于包被合成抗原的載體和用于免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的合成抗原的載體蛋白不同。 免疫過程中考慮載體效應(yīng)的影響：抗體的特異性依賴于半抗原分子結(jié)構(gòu)中的免疫決定區(qū)，但整個(gè)載體蛋白大分子對(duì)于抗體反應(yīng)的性質(zhì)和量也有影響；應(yīng)使用相同載體的合成抗原制備半抗原抗體。（3）合成抗原的測(cè)定p定性測(cè)定方法：定性測(cè)定方法： 光譜分析：半抗

16、原和載體蛋白的結(jié)合導(dǎo)致蛋白構(gòu)象的改變，改變程度和半抗原的結(jié)合量有關(guān)，半抗原結(jié)合量越大，構(gòu)象改變程度越大。 熱力學(xué)分析：半抗原和載體蛋白結(jié)合后熱力學(xué)特征會(huì)有變化，差異可通過差示掃描量熱法（DCS）等方法測(cè)定。p定量測(cè)定方法定量測(cè)定方法 相對(duì)含量測(cè)定法：通過ELISA法比較半抗原與載體蛋白的相對(duì)結(jié)合量。絕對(duì)含量測(cè)定法：半抗原具有與載體蛋白完全不同的廣譜吸收特征，且半抗原在此特定波長(zhǎng)下具有較強(qiáng)的吸收；或能利用特定的化學(xué)反應(yīng)定量測(cè)定半抗原的量，且不與載體蛋白發(fā)生反應(yīng)。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、三、抗體與免疫反應(yīng)抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用五、免疫擴(kuò)散法五、免疫擴(kuò)

17、散法主要內(nèi)容主要內(nèi)容免疫分析實(shí)際上是一種特殊的試劑分析，特點(diǎn)是抗體成為分析試劑抗體成為分析試劑。 1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）, 受體（receptor）和其他結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 . 抗體（抗體（antibody，Ab）：是由抗原進(jìn)入機(jī)體刺激B細(xì)胞分化增殖為漿細(xì)胞而合成并分泌的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合并產(chǎn)生免疫效應(yīng)的含有糖基的球蛋白?？贵w分布于體液（血液、淋巴液、組織液及粘膜的外分泌液）中，主要存在于血清內(nèi)。 1. 抗體（抗體（antibody

18、, Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。所有抗體都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗體。免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。 抗體的基本結(jié)構(gòu)輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成一個(gè)四肽鏈

19、分子稱為Ig分子的單體；單體是構(gòu)成所有免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)；所有抗體的單體都是四條肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即：兩條糖基化重鏈(H)和兩條非糖基化輕鏈(L)；每條重鏈和輕鏈分為氨基端(N端)和羧基端(C端)。 IgG分子由四條多肽鏈四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連以二硫鍵相連，有三個(gè)功能區(qū)。 抗體在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時(shí)通過hi區(qū)的轉(zhuǎn)動(dòng)以適應(yīng)不同距離的抗原決定簇。 與抗原結(jié)合后，IgG分子構(gòu)象改變，暴露出Fc上的活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出固定和激活補(bǔ)體以及粘結(jié)單核細(xì)胞等親細(xì)胞反應(yīng)的功能。Fab：抗原結(jié)合片段：抗原結(jié)合片段Fc：可結(jié)晶片段：可結(jié)晶片段胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二

20、硫鍵（C端） 裂解片段，F(xiàn)（ab）2，無Fc片段 與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng) 木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（N端） 裂解片段，2個(gè)Fab（54KD），一個(gè)Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。 一、多克隆抗體一、多克隆抗體（polyclonal antibodypolyclonal antibody） 1. 定義：抗原分子通常具有多個(gè)抗原決定簇，動(dòng)物免疫后可刺激多種具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對(duì)不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAb）。 2

21、. 實(shí)際意義 （1）預(yù)防、治療感染性疾?。ㄌ禺愋圆?，可發(fā)生超 敏反應(yīng)） （2）臨床診斷二、單克隆抗體二、單克隆抗體（monoclonal antibody, McAbmonoclonal antibody, McAb） 1. 定義：由單一克隆B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只識(shí)別 抗原分子某一特定抗原決定簇的、具有高度特異性的 抗體。每種單克隆抗體其類、亞類、型及親和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特點(diǎn) 具有高度均一性。 3. 雜交瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞無限增殖； 免疫B細(xì)胞合成、分泌特異性抗體。 4. 雜交瘤技術(shù) HAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。三、基因工程抗體三、基

22、因工程抗體 基因工程抗體是通過PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床診斷、預(yù)防和治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。 人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）； 人改型抗體（reshaped humanized antibody）； 小分子抗體； 雙特異性抗體（bispecific antibody）等。、 IgM IgG IgA IgD IgE 抗體的功能： 清除侵入機(jī)體的微生物，寄生蟲等異物，中和它們所釋放的毒素或清除某些自身抗原。初次反應(yīng)，再次反應(yīng)和回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體。初次反應(yīng)，再次反應(yīng)和回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體。抗體的規(guī)律：2

23、抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià)抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià) 抗體的特異性抗體的特異性是無與倫比的，不需或只需要簡(jiǎn)單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性較高的穩(wěn)定性。 這兩點(diǎn)奠定了分析免疫高度靈敏和高度專一的基礎(chǔ)。 此外，抗體還有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)：每個(gè)抗體分子有兩個(gè)抗原的結(jié)合點(diǎn)，即多價(jià)性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號(hào)反差。 3、抗體的制備、抗體的制備 （1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體多克隆抗體）：指人工被動(dòng)免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制備、動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。免疫原的制備免疫原的制備 免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑

24、。 水劑由無菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。 弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達(dá)到油包水的程度。 不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。動(dòng)物免疫動(dòng)物免疫 通常的免疫動(dòng)物為家兔和羊。 免疫的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。 免疫抗原量通常為110mg或50100mg。試血及效價(jià)測(cè)定試血及效價(jià)測(cè)定 家兔的試血通?？捎啥夓o脈取血，取血量0.5ml。 不同稀釋度的抗血清和1%的血細(xì)胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測(cè)血細(xì)胞的凝聚情況，即可測(cè)得免疫血清的效價(jià)。（2）單克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基

25、礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。 高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個(gè)識(shí)別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來自雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)法 & 接種動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法制備步驟制備步驟2、抗體的純化 利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類的免疫球蛋白。 利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專一性的抗體。2022-6-1459沉淀分離 通過改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀析出，與其它成分分離的技術(shù)。 是純化生物大分子物質(zhì)常用的經(jīng)典方法 包括鹽析沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和非離子聚合物沉淀法等。2022-6-1460（一）鹽析法 在物質(zhì)的水溶液中添加一定濃度的中性鹽，使

26、物質(zhì)的溶解度減小而沉淀析出，這一過程稱為“鹽析”。 優(yōu)點(diǎn)：成本低，不需要昂貴的設(shè)備；操作簡(jiǎn)便，安全；對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；對(duì)pH、溫度要求不嚴(yán)格。 缺點(diǎn)：分離效果有限2022-6-1461鹽析的基本原理鹽析的基本原理 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)親水基團(tuán)、與水形成水化膜的程度、以及所帶有電荷的情況決定的。 當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液中，鹽離子對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是減弱甚至消除蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜。同時(shí)，鹽離子所帶的電荷中和部分蛋白質(zhì)分子表面電荷，更加導(dǎo)致其溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。2022-6-1462鹽類和濃度的選擇鹽類和濃度的選擇p常用的中性鹽有硫酸銨

27、、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等p硫酸銨最為常用硫酸銨最為常用，其優(yōu)點(diǎn)是：溶解度大；溫度系數(shù)小；密度小，有利于析出蛋白的離心分離；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸銨溶液中穩(wěn)定，低溫下可保存一年；價(jià)廉易得；分離效果比其它鹽好。p但硫酸銨緩沖能力比較弱，pH難控制；銨離子干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。p高濃度鹽析法高濃度鹽析法是粗純樣品的常用方法。2022-6-1463脫鹽脫鹽 蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的方法有： 透析法透析法 超濾法超濾法 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G50G50層析法。層析法。2022-6-1464（二）有機(jī)溶劑沉淀

28、法p利用待分離物質(zhì)與雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使某一溶質(zhì)沉淀析出，從而與其它成分分離的方法。 p有機(jī)溶劑破壞溶質(zhì)分子周圍的水化層；有機(jī)溶劑降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。2022-6-1465p優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分辨率比鹽析法高，即一種溶質(zhì)發(fā)生沉淀的有機(jī)溶劑濃度范圍比較窄；溶劑容易除去，并可以回收；沉淀無需脫鹽，易于離心或過濾分離。p缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑可使某些生物大分子變性失活，操作常需在低溫下進(jìn)行；有機(jī)溶劑具有一定毒性。2022-6-1466有機(jī)溶劑的選擇p選擇有機(jī)溶劑的原則：選擇有機(jī)溶劑的原則：有機(jī)溶劑的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免損害工作人員

29、的健康和污染環(huán)境；不與溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，價(jià)格便宜。p使用較多的是乙醇、丙酮、甲醇等。使用較多的是乙醇、丙酮、甲醇等。2022-6-1467p殘留的有機(jī)溶劑去除的方法：殘留的有機(jī)溶劑去除的方法： 自然蒸發(fā)或負(fù)壓蒸發(fā)，可在室溫進(jìn)行； 凝膠過濾除去。（三）離子交換層析法 離子交換層系離子交換層系（ion exchange chromatography， IEC）是利用離子交換劑上可交換離子與組分中的離子發(fā)生可逆交換時(shí)結(jié)合力的差別，而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于很多生命物質(zhì)的分析、制備和純化等。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)單易行； 分辨力強(qiáng)，回收率高； 具有多孔性，表面積大、交換容量大； 具有親水

30、性，對(duì)大分子的吸附不牢固，層析條件溫和，不致引起物質(zhì)變性或失活。2022-6-1469離子交換法的固定相是離子離子交換法的固定相是離子交換劑；交換劑；若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附若擔(dān)體帶有正電荷，可吸附著負(fù)電荷分子，則為陰離子著負(fù)電荷分子，則為陰離子交換法；不帶凈電荷的分子交換法；不帶凈電荷的分子，以及陽離子則直接流出，以及陽離子則直接流出，不會(huì)被吸不會(huì)被吸附上去。附上去。這些被固相單體所吸附的離這些被固相單體所吸附的離子，統(tǒng)稱為子，統(tǒng)稱為 counter ioncounter ion，因?yàn)槠潆姾膳c擔(dān)體上的電荷因?yàn)槠潆姾膳c擔(dān)體上的電荷相反相反 (counter (counter 是是 相反相反 的

31、意思的意思) ) 離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團(tuán)，根離子交換劑為人工合成的惰性高分子聚合物，其上帶有許多可電離基團(tuán)，根據(jù)這些基團(tuán)所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。它可分據(jù)這些基團(tuán)所帶電荷的不同，可分為陰離子交換劑和陽離子交換劑。它可分三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子?；驹砘驹?022-6-1470陽離子交換反應(yīng)：陽離子交換反應(yīng)：R-AR-A- - H H+ + + Y + Y+ + R-AR-A- - X X+ + + H + H+ + 陰離子交換反應(yīng)：陰離子交換反應(yīng)：R-BR-B

32、+ + OH OH- - + X + X- - R-BR-B+ + X X- - + OH + OH- - R R代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)，代表離子交換劑的高分子聚合物基質(zhì)， A A- - 和和B B+ +分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)，物共價(jià)結(jié)合的電荷基團(tuán)， H H+ + 和和OHOH- -分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子，分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子， Y Y+ + 和和X X- -分別代表溶液中的離子基團(tuán)。分別代表溶液中的離子基團(tuán)。2022-6-1471離子交換層析對(duì)

33、物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑離子交換層析對(duì)物質(zhì)的分離通常是在一根充填有離子交換劑的玻璃管的玻璃管（1.5 cm15 cm）中進(jìn)行的。中進(jìn)行的。l含有預(yù)被分離的離子含有預(yù)被分離的離子的溶液通過離子交換柱的溶液通過離子交換柱時(shí)，各種離子即與離子時(shí)，各種離子即與離子交換劑上的荷電部位競(jìng)交換劑上的荷電部位競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。爭(zhēng)結(jié)合。l任何離子通過柱時(shí)的任何離子通過柱時(shí)的移動(dòng)速率取決于與離子移動(dòng)速率取決于與離子交換劑的親和力、電離交換劑的親和力、電離程度和溶液中各種競(jìng)爭(zhēng)程度和溶液中各種競(jìng)爭(zhēng)性離子的性質(zhì)和濃度性離子的性質(zhì)和濃度。2022-6-14722022-6-1473p 兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸

34、等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定pHpH條件下呈現(xiàn)的條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。離子狀態(tài)。p 大多數(shù)蛋白在生理大多數(shù)蛋白在生理pHpH（pH6pH68 8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化換柱純化，極端的，極端的pHpH下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。 p 洗脫可采用改變?nèi)芤旱南疵摽刹捎酶淖內(nèi)芤旱膒HpH或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pHpH與離與離子強(qiáng)度的方法。改變子強(qiáng)度的方法。改變pHpH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有

35、較大的影響，可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。p 用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。 2022-6-1474表表3-8 3-8 在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫在陰離子交換柱上血漿蛋白組分的分段洗脫NaCl(mol/L)NaCl(mol/L)0.01mol/L PB0.01mol/L PB的

36、的pHpH洗脫的蛋白質(zhì)洗脫的蛋白質(zhì)0.0250.0258.08.0IgGIgG0.0300.0307.07.0IgGIgG0.0350.0357.07.0IgGIgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0400.0407.07.0轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原0.0450.0457.07.02 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0500.0507.07.0IgAIgA、2 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0600.0606.56.5IgAIgA、白蛋白、白蛋白0.0700.0706.56.5白蛋白白蛋白0.0800.0806.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、白蛋白脂蛋白、白

37、蛋白0.0900.0906.56.52 2蛋白、珠蛋白、白蛋白蛋白、珠蛋白、白蛋白0.100.106.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白脂蛋白、珠蛋白、白蛋白0.150.156.56.5IgMIgM、-脂蛋白、脂蛋白、球蛋白球蛋白0.200.206.56.5銅藍(lán)蛋白、銅藍(lán)蛋白、蛋白蛋白2022-6-1475三、技術(shù)要點(diǎn)三、技術(shù)要點(diǎn)（一）離子交換劑的選擇和處理（一）離子交換劑的選擇和處理p兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的理化性質(zhì)和在特定理化性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)

38、的離子狀態(tài)。條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。p大多數(shù)蛋白在生理大多數(shù)蛋白在生理pH（pH68）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下下蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。蛋白會(huì)變性失活，應(yīng)盡量避免。p處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)處理的目的：使交換劑充分溶脹，使其顆粒的孔隙增大，讓具有交換活性的電荷基團(tuán)充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。充分暴露出來，再用酸堿浸泡，除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。 （二）裝柱和加樣（二）裝柱和加樣p選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和選擇平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH時(shí)，首先

39、要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交時(shí)，首先要保證待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；其次是使離子交換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。換劑與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，而不與樣品中雜質(zhì)結(jié)合，以達(dá)到分離的目的。p溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度常用不影響蛋白質(zhì)吸附到交換劑上的最高離子強(qiáng)度液，常用的離子強(qiáng)度為度為20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脫和收集（三）洗脫和收集p洗脫可采用改變?nèi)芤旱南疵摽刹捎酶淖內(nèi)芤旱膒H或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變或離子強(qiáng)度，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度的方法與離子強(qiáng)度的方法。改變

40、。改變pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。洗脫。p用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液用一定鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來。洗脫下來。（四）離子交換劑的再生與保存（四）離子交換劑的再生與保存p使其帶上所需的平衡離子。使其帶上所需的平衡離子。 2022-6-1476（四）親和層析法 親和層析親和層析是利用某些生

41、物分子之間專一可逆結(jié)是利用某些生物分子之間專一可逆結(jié)合特性的一種高度專一的吸附層析類型。合特性的一種高度專一的吸附層析類型。 配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和配體是發(fā)生親和反應(yīng)的功能部位，也是載體和被親和分子之間的橋梁。被親和分子之間的橋梁。 配體本身配體本身必須有兩個(gè)基團(tuán)必須有兩個(gè)基團(tuán)： 一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)一個(gè)能與載體共價(jià)結(jié)合，連接后的配體對(duì)互補(bǔ)分子的親和力不會(huì)改變分子的親和力不會(huì)改變 一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。一個(gè)能與被親和分子結(jié)合。2022-6-1477親和層析法有點(diǎn)像在釣魚，魚是我們所要的分子親和層析法有點(diǎn)像在釣魚，魚是我們所要的分子 (B) (B) 雜夾在

42、一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中雜夾在一堆蛋白質(zhì)當(dāng)中，魚餌是與，魚餌是與 B B 具有專一性的分子具有專一性的分子 (A, (A, 上圖上圖 1)1)；A A 與與 B B 的專一性很高，只的專一性很高，只會(huì)在樣本中與會(huì)在樣本中與 B B 結(jié)合，而排除其它雜質(zhì)結(jié)合，而排除其它雜質(zhì) ( (上圖上圖 2)2)；若把結(jié)合在吸著劑上的；若把結(jié)合在吸著劑上的 B B 溶離下來，就可以得到均質(zhì)的溶離下來，就可以得到均質(zhì)的 B (B (上圖上圖 3)3)。2022-6-14782022-6-1479表表3-16 3-16 親和層析中部分蛋白配體親和層析中部分蛋白配體配基配基純化的物質(zhì)純化的物質(zhì)蛋白蛋白A/A/蛋白蛋白B B各

43、種免疫球蛋白各種免疫球蛋白單克隆抗體單克隆抗體各種抗原、蛋白各種抗原、蛋白A A抗原抗原特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體特異性單克隆抗體、特異性多克隆抗體核苷酸核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白脂肪酸結(jié)合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖血凝素、糖苷苷甘酶甘酶生物素生物素親和素、生物素結(jié)合蛋白親和素、生物素結(jié)合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、DNADNA聚合酶、連接組織蛋白聚合酶、連接組織蛋白酶酶鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶鈣調(diào)蛋白結(jié)合酶TriazineTriazine染料

44、染料脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等脫氫酶、激酶、多聚酶、干擾素、限止酶等3、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定 抗體的效價(jià)抗體的效價(jià)又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗體的效價(jià)指將血清稀釋，測(cè)定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價(jià)。 常用的效價(jià)測(cè)定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。 特異性抗體的篩選，特異性抗體的篩選，制備出含不同的抗原決定簇的特異性抗原，然后根據(jù)抗體和這些抗原相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行分析。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、四、免疫

45、分析方法及應(yīng)用免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容四、免疫分析方法及其應(yīng)用四、免疫分析方法及其應(yīng)用 放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA） 熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（FIA） 克隆酶給予體免疫分析法（克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA） 酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA） 1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分

46、析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量范圍也明顯擴(kuò)大。分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量范圍也明顯擴(kuò)大。 由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放發(fā)展。近年來，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。射分析法更加完善。 放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類中建立最早、應(yīng)用最廣的一類競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù).基本原理基本原理 基本原理：放射

47、性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)原或待測(cè)抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合結(jié)合 , ,這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來表示：這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來表示： Ag + Ab AgAb + Ag+* Ag*Ag + *AgAb抗原抗原 抗體抗體常用的標(biāo)記物：常用的標(biāo)記物：125 I和氚標(biāo)記物和氚標(biāo)記物放射性活度（貝克，放射性活度（貝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰變：每秒一次核衰變比活度（比活度（Bp/g）：）：每單位質(zhì)量所含的放射性比活度每單位質(zhì)量所含的放射性比活度游離狀態(tài)游離狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)具

48、體步驟具體步驟 抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的和游離的放射性物質(zhì)的分離放射性活度的測(cè)定柱色譜法柱色譜法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗體發(fā)抗抗體發(fā)微孔濾膜法微孔濾膜法固相法固相法求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量反應(yīng)曲線）熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence i

49、mmunoassay, FIA）在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位在實(shí)際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類 直接法 間接法 補(bǔ)體法 其他直接法直接法 將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢 操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性染色少 敏感性低抗原標(biāo)記抗體熒光間接法間接法 先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢未知抗原未知抗原未標(biāo)記未標(biāo)記抗體抗體標(biāo)記抗標(biāo)記抗體體

50、熒光熒光補(bǔ)體法 利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光補(bǔ)體補(bǔ)體標(biāo)記抗標(biāo)記抗補(bǔ)體抗補(bǔ)體抗體體時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時(shí)間分辨熒光儀即可測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而推測(cè)待測(cè)物含量。基本原理基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物待測(cè)物與酶連接與酶連接，然后通過，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。用于定量測(cè)定。 測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有

51、在這種測(cè)定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色劑酶作用的底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。 它是檢測(cè)抗原最常用ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體固相抗體-抗原抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物合物。復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正

52、比。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測(cè)抗原含量。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 雙抗體夾心法雙抗體夾心法酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。1、HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)。催化過氧化物的氧化反應(yīng)。供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長(zhǎng)為492nmTMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯

53、藍(lán)色，用HCL或H2SO4終止后，由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長(zhǎng)為405nm 2、AP為磷酸酯酶為磷酸酯酶 一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)一、一、光度酶聯(lián)免疫分析光度酶聯(lián)免疫分析1 1、酶聯(lián)免疫吸附分析（、酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent enzyme-linked immunosorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合結(jié)合到某種到某種固相載體表面固相載體表面；抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原酶

54、標(biāo)抗原或或抗體抗體； 在測(cè)定時(shí)，使在測(cè)定時(shí)，使受檢標(biāo)本受檢標(biāo)本和和酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步或抗體按不同的步驟驟與固相抗原與固相抗原或固相抗體起或固相抗體起反應(yīng)反應(yīng)； 用用洗滌洗滌的方法使固相載體上形成的的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物與與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與酶量與標(biāo)本中標(biāo)本中受受檢物質(zhì)的量成檢物質(zhì)的量成一定的一定的比例比例； 加入酶反應(yīng)加入酶反應(yīng)底物底物，底物被酶催化為，底物被酶催化為有色產(chǎn)物有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量，產(chǎn)物量與與標(biāo)本中標(biāo)本中受檢物受檢物的的量相關(guān)量相關(guān)，用分光光度法進(jìn)行定量。，用分光光度法進(jìn)行定量。2 2、E

55、LISAELISA的固相載體的固相載體 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底，孔底透明度高透明度高，各板之間、同一板各孔之間，各板之間、同一板各孔之間性能相近性能相近。 最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。 聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。值也略高。 ELISAELISA載體的形式有載體的形式有小試管小試管、小珠小珠和和微量反應(yīng)板微量反應(yīng)板。3 3、固相載體的包被與封閉、固相載體的包被與封閉（1 1）包被包被（coatingcoating）指將）指將抗原抗原或抗體或抗

56、體連接連接到到固相載體固相載體上的過程。上的過程。 以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶以聚苯乙烯微量反應(yīng)板為例，通常先將抗原或抗體溶于于pH 9.6pH 9.6的的碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液（或（或pH 7.2pH 7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液，pH 7pH 78 8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液）中，緩沖液）中，加滿反應(yīng)孔加滿反應(yīng)孔，置，置44過夜過夜，洗滌即可。，洗滌即可。 包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì)的

57、包被濃度為一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.10.12020g/mlg/ml。（2 2）封閉封閉（blockingblocking）指繼包被之后用）指繼包被之后用高濃度高濃度的的無關(guān)無關(guān)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶液溶液再包被再包被的過程。的過程。 封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 所有的所有的ELISAELISA固相載體均需封閉固相載體均需封閉。 常用封閉劑有常用封閉劑有0.05%0.05%0.5% 0.5% BSABSA；10%10%小牛血清小牛血清或或1%1%明明膠膠

58、；脫脂奶粉脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可高濃度使用（，比較價(jià)廉，可高濃度使用（5%5%）。）。4 4、稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液、稀釋液、洗滌液和酶反應(yīng)終止液（1 1）稀釋液稀釋液用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。用于稀釋酶標(biāo)抗體及標(biāo)本。 常用常用中性中性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl緩沖液緩沖液，其中含有，其中含有無關(guān)高濃無關(guān)高濃度蛋白度蛋白（如（如1010動(dòng)物血清、動(dòng)物血清、1 1BSABSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）、1 1明膠等）和明膠等）和非離子型表面活性劑非離子型表面活性劑（如（如0.050.05Tween 20Tween 20或或TritonX-100TritonX-10

59、0等）。等）。（2 2）洗滌液洗滌液一般與稀釋液相同，常用一般與稀釋液相同，常用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl緩緩沖液。沖液。 四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表四種常用的抗體稀釋液和三種常用的洗滌液列于表7-7-2 2。編編號(hào)號(hào)吐溫吐溫20/%組成組成稀稀釋釋液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗滌滌液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22

60、PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl緩沖液緩沖液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液常用的抗體稀釋液和洗滌液（3 3）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HRPHRP）反應(yīng)終止液為）反應(yīng)終止液為2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性條件下喪失酶活性）。在酸性條件下喪失酶活性）。 很多很多ELISAELISA試劑采用試劑采用堿性磷酸酶堿性磷酸酶（APAP）作為標(biāo)記酶）作為標(biāo)記酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH終止酶反應(yīng)后，