海綿相關(guān)的微生物群落的多樣性和生物技術(shù)潛能

1、海綿相關(guān)的微生物群落的多樣性和生物技術(shù)潛能海綿相關(guān)的微生物群落的多樣性和生物技術(shù)潛能 劉杰劉杰 10808076汕頭大學多學科研究中心海洋占地球表面積的71%，體積占生物圈的95。蘊藏著極為豐富的生物資源。在動物種類方面，在已知的33個動物門中，海洋中有32個，其中有15種是海洋所獨有的。微生物方面，與陸棲微生物相比，海洋微生物處在高鹽、高壓、低溫和低營養(yǎng)等極端條件下。生存環(huán)境的特異性，使海洋微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上表現(xiàn)出多樣性和特異性，體內(nèi)存在特殊代謝途徑酶，相應(yīng)產(chǎn)生一些特殊的活性代謝物質(zhì)。因此從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)新酶、新化合物的概率將比陸棲微生物要大的多。海綿海綿sponge海綿（

2、marine sponge）屬于動物界多孔動物門（Porifera）,是一大類低等細胞海洋動物，約占海洋物種總量的1/15，是熱帶海洋中除珊瑚外的第二生物量，全世界約有1000015000種。桶狀海綿桶狀海綿 玻璃海綿玻璃海綿 海綿的形態(tài)變化很多，最典型的有中空壺狀、花瓶裝及囊狀，海綿的形態(tài)變化很多，最典型的有中空壺狀、花瓶裝及囊狀，有時也呈扁平、圓筒狀、條狀、葉狀和圓磚狀，它們的體色變有時也呈扁平、圓筒狀、條狀、葉狀和圓磚狀，它們的體色變化從黃、藍、桃紅至白、黑色均有，體高也從化從黃、藍、桃紅至白、黑色均有，體高也從1200cm不等。不等。海綿是一種原始的無脊椎動物，生活在海洋中的巖石上，只

3、有極少數(shù)分布在淡水中,從潮間帶到9000m的深海均有分布，靠近河口處的海域往往更豐富，常有其優(yōu)勢種.海綿是固生、多孔、濾食性動物,其體表有很多細小的管道，海水通過這些管道流經(jīng)體內(nèi)，海綿就以海水中的微生物和其他有機碎片作為食物來源。其過濾微生物的效率可達75%99%海綿的濾水系統(tǒng)非常發(fā)達，據(jù)報導，有一種海綿，每1千克的體重在一晝夜可過濾24噸的海水。在海綿濾食過程中，許多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海綿體內(nèi)保留，這樣在海綿體內(nèi)和體表就富集了大量的微生物。海綿體內(nèi)和體表富集了大量的微生物海綿中的微生物分布在宿主細胞的胞外和胞內(nèi)，如海綿外層海綿中的微生物分布在宿主細胞的胞外和胞內(nèi)，如海綿外層

4、的胞外共生微物和海綿中膠層的胞內(nèi)共生微生物。胞內(nèi)（包的胞外共生微物和海綿中膠層的胞內(nèi)共生微生物。胞內(nèi)（包括細胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi)）的生物可以長久的存在于細胞和細括細胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi)）的生物可以長久的存在于細胞和細胞核內(nèi)。胞核內(nèi)。海綿微生物的分布海綿微生物的分布海綿微生物的多樣性海綿微生物的多樣性 海綿微生物（marine sponge microorganisms）的定義是比較廣泛的，所有自海綿組織中分離得到的微生物都可以定義為海綿相關(guān)微生物（marine sponge associated microorganisms），包括偶然出現(xiàn)在海綿體內(nèi)的微生物，海綿中膠層（mesohyl）內(nèi)的微生物，永

5、久性生存在海綿細胞內(nèi)部的微生物。海綿中的微生物古細菌異養(yǎng)細菌藍細菌綠藻紅藻鞭毛蟲硅藻真菌海綿中微生物的數(shù)量在不同的宿主中有一定的差異。海綿中微生物的數(shù)量在不同的宿主中有一定的差異。海綿相關(guān)的細菌海綿相關(guān)的細菌 海綿中細菌的分布遵循一個常規(guī)的模式： (1)有光合活性的微生物，像藍藻，真核藻類，分布于外面光曝露的組織層。 (2)異養(yǎng)的，可能也有一些自養(yǎng)的細菌分布于內(nèi)層。 早期研究海綿與細菌的聯(lián)系 （基于細菌形態(tài)學） 類似于周圍海水環(huán)境的細菌，并不是海綿所特有的 細胞內(nèi)的細菌，它們是海綿所特有的 細菌在海綿的膠層中，也是海綿所特有的 海綿相關(guān)的真菌海綿相關(guān)的真菌從生態(tài)學上講真菌在營養(yǎng)更新的循環(huán)中起著

6、重要的作用，一些海洋真菌會引起海洋動物和植物的疾病，而其它一些真菌會與一些器官形成互助的共生關(guān)系。一些真菌產(chǎn)生毒素，一些會是免疫損害海洋動物和海灘游泳者的病原菌。 從六個不同的區(qū)域（包括溫帶，亞熱帶，熱帶）中的海綿分離的真菌中尋找新的天然化合物，從16個海綿種中一共分離得到681真菌菌種。分離的真菌屬于13個子囊菌屬類，2個接合菌類，37個放線菌類真菌。不同的區(qū)域的樣本，真菌屬的多樣性和每個樣本分離得到的真菌數(shù)量是不同的。 (1)細菌細胞壁的特征（革蘭氏陽性和革蘭氏陰性）(2)用透射電子顯微鏡觀察的細菌細胞膜的結(jié)構(gòu)（1）受到培養(yǎng)條件的限制。因為即使在海綿中只是微量組分的微生物，在一定得培養(yǎng)條件

7、下也會成為優(yōu)勢菌種。海綿相關(guān)微生物研究技術(shù)海綿相關(guān)微生物研究技術(shù)1.早期對海綿共附生微生物多樣性的研究主要是通過形態(tài)觀察早期對海綿共附生微生物多樣性的研究主要是通過形態(tài)觀察(顯微鏡顯微鏡)2.2.培養(yǎng)的方法（培養(yǎng)的方法（生理學和系統(tǒng)發(fā)育學的多樣性）（2）很多微生物是沒有被培養(yǎng)過或不可培養(yǎng)的據(jù)估計，在實驗室條件下培養(yǎng)鑒定的微生物只是海洋環(huán)境中的極少部分（約占總類別的0.11%）一些有特殊生理特性的細菌已經(jīng)從海綿中分離得到，諸如：需氧化能異養(yǎng)菌，固氮菌，甲烷氧化細菌，光合細菌，厭氧光合菌。在最近，從幾種海綿中培養(yǎng)得到了新的放線菌。3.分子生物學技術(shù)分子生物學技術(shù)（不依賴于培養(yǎng)） （1）16S rD

8、NA序列序列16S rDNA技術(shù)能很精確的確定細菌的種屬位置. 16S rDNA是存在于核糖體上的一段長約1500bp的基因序列。16S rDNA因進化緩慢，種屬特異性強而成為生物進化中的化石。由于其能快速準確地對細菌分類進行定位而稱為細菌“指紋”。16S rDNA已經(jīng)成為細菌鑒定系統(tǒng)的一個基本指標將實驗中測定的將實驗中測定的16S rDNA序列輸入到一些國際上著名的核酸序列數(shù)據(jù)庫序列輸入到一些國際上著名的核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對分析來尋找其最為相近的種屬，確定菌株的分類位置。進行比對分析來尋找其最為相近的種屬，確定菌株的分類位置。DGGE的原理是在聚丙烯酰氨凝膠中加入DNA變性劑，在電場作用下

9、形成變性劑濃度梯度，雙鏈DNA分子在變性凝膠中發(fā)生解鏈，由于PCR產(chǎn)物的堿基組成不同，因此隨變性劑濃度的增大，樣品在電泳中順從解鏈，而率先解鏈的由于遷移阻力的增大而涌動較慢，后解鏈的則電泳中位移較快。這樣相同長度的DNA雙鏈分子就可以得到分開。2.變性梯度凝膠電泳（變性梯度凝膠電泳（DGGE）它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定

10、性、定量或相對定位分析。3.熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）用不同微生物用不同微生物16S rDNA的熒光原位雜交技術(shù)（的熒光原位雜交技術(shù)（FISH），在海綿組織），在海綿組織薄片上，對海綿體內(nèi)微生物進行熒光原位雜交分析，結(jié)果表明在不需薄片上，對海綿體內(nèi)微生物進行熒光原位雜交分析，結(jié)果表明在不需要對微生物（其中包括許多不可分離培養(yǎng)的微生物）進行分離培養(yǎng)的要對微生物（其中包括許多不可分離培養(yǎng)的微生物）進行分離培養(yǎng)的條件下，可以將存在于海綿中質(zhì)層內(nèi)的細菌，精確分類到屬甚至種的條件下，可以將存在于海綿中質(zhì)層內(nèi)的細菌，精確分類到屬甚至種的水平上。水平上。海綿微生物和海綿天然產(chǎn)物海綿微生物和海綿天

11、然產(chǎn)物兩千多年前，地中海沿岸的居民就將海綿的角質(zhì)骨骼用于沐浴、洗滌、醫(yī)兩千多年前，地中海沿岸的居民就將海綿的角質(zhì)骨骼用于沐浴、洗滌、醫(yī)藥、美術(shù)和美容等，古時歐洲人還將其用做止血劑。我國的本草綱目也記藥、美術(shù)和美容等，古時歐洲人還將其用做止血劑。我國的本草綱目也記載了一種名為紫梢花的淡水海綿可以入藥。載了一種名為紫梢花的淡水海綿可以入藥。就目前所知，海綿是迄今為止海洋天然產(chǎn)物的最大來源。就目前所知，海綿是迄今為止海洋天然產(chǎn)物的最大來源。天然產(chǎn)物研究開發(fā)的國際權(quán)威雜志“Natural Products Reports”每年度都進行海洋天然產(chǎn)物綜述，在（20022004）各類雜志上發(fā)表的海洋天然產(chǎn)物

12、中，來源于海綿的分別占到了36.3（316/869）、38.2（303/793）和32.6(247/756)。海綿天然產(chǎn)物主要表現(xiàn)為抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧疾、抗污染、驅(qū)蟲和酶抑制劑等活性。海綿相關(guān)微生物的藥物化合物海綿相關(guān)微生物的藥物化合物從已公布的海綿化學成分來看，海綿生物活性化合物可分為萜類、甾醇、大從已公布的海綿化學成分來看，海綿生物活性化合物可分為萜類、甾醇、大環(huán)內(nèi)酯、生物堿、肽類、高級脂肪醇（酸、酯）及含硫、含鹵素化合物等，環(huán)內(nèi)酯、生物堿、肽類、高級脂肪醇（酸、酯）及含硫、含鹵素化合物等，其中以萜類化合物含量最多。這些化合物大多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、其中以萜類化合物

13、含量最多。這些化合物大多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、凝血和融血等生理活性作用。降血壓、凝血和融血等生理活性作用。例如：例如：1.從貪婪倔海綿從貪婪倔海綿Dysidea avara中分離得到的兩種倍半萜中分離得到的兩種倍半萜Avarol及其氧化產(chǎn)物及其氧化產(chǎn)物Avarone具有抑制具有抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶且對病毒裝逆轉(zhuǎn)錄酶且對病毒裝配和釋出液有阻斷作用配和釋出液有阻斷作用2.以海綿尿苷為先導化合物研制開發(fā)的阿糖胞苷（以海綿尿苷為先導化合物研制開發(fā)的阿糖胞苷（Ara-C），臨），臨床上主要治療急性白血病和消化道癌癥床上主要治療急性白血病和消化道癌癥海綿相關(guān)微生物產(chǎn)生的酶海綿相關(guān)微生物產(chǎn)生的酶淀

14、粉酶，纖維素酶，蛋白酶，和其它水解酶在工業(yè)上用于藥物，食品，飲料，糖果，也在紡織和皮革生產(chǎn)，廢水的處理中有廣泛的應(yīng)用 海綿懸浮于包含大量有機顆粒的海水中。因此，有理由相信海綿中的一些微生物或者海綿自身會產(chǎn)生一些水解酶類來使一些有機物質(zhì)轉(zhuǎn)換為營養(yǎng)物質(zhì) 。從海綿Spirastrella sp.中分離到得細菌Arthrobacterilicis和真Mucor sp.被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生乙酰膽堿酯酶和淀粉酶，這兩種酶是熱耐性型的，它們的活性不受海水中相對高濃度的主要陽離子Na+, Ca2+, and Mg2+,的影響 。海綿中分離得到的細菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離得到的細菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離得到的放線菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離得到的放線菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離得到的真菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離得到的真菌和其相關(guān)產(chǎn)物海綿中分離