分子生物學基因突變

1、基基 因因 突突 變變 & 相相 關(guān)關(guān) 技技 術(shù)術(shù)Dr. Liu J Natural SelectionFebruary 12th ,2009 marked the 200th birthday for famous evolution scientist Charles Darwin (02/12/1809-04/19 /1882), who laid the foundations for the evolution theory - mutation & natural selection. As per Darwin, mutation provides new tra

2、its for species, and then the nature selects those species with advantageous heritable traits - the process Darwin called natural selection. Natural SelectionScience and Research如果要對近幾年的社會話題按如果要對近幾年的社會話題按照照“敏感指數(shù)敏感指數(shù)”排出一個名次排出一個名次的話，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題的話，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題恐怕至少要入圍三甲。究其背恐怕至少要入圍三甲。究其背后的原因，如果不是轉(zhuǎn)基因食后的原因，如果

3、不是轉(zhuǎn)基因食品在安全性問題上確有遮掩、品在安全性問題上確有遮掩、隱瞞的話，那么我們就該反思，隱瞞的話，那么我們就該反思，是不是真正地了解了是不是真正地了解了“轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因食品的安全性到底是怎么一回食品的安全性到底是怎么一回事兒？事兒？”轉(zhuǎn)基因食品的安全問題轉(zhuǎn)基因食品的安全問題Evolution Mutations are engines of natural selection Spiral goat George was all mouth The eyes have itBack to the WaterScience: 科學家揭示科學家揭示人類長相各異的原因人類長相各異的原因 人類的長相

4、各異，沒有兩個人長相完全相同的。是什么導致了人面部形態(tài)各人類的長相各異，沒有兩個人長相完全相同的。是什么導致了人面部形態(tài)各異呢？遺傳學證據(jù)顯示父母和子女長相類似，但是哪些因素使得異呢？遺傳學證據(jù)顯示父母和子女長相類似，但是哪些因素使得DNA調(diào)控如此精調(diào)控如此精確，使得兩個人長相不同呢？確，使得兩個人長相不同呢？ 伯克利國家重點實驗室的科學家揭示了增強子在面部發(fā)育中發(fā)揮重要作用。伯克利國家重點實驗室的科學家揭示了增強子在面部發(fā)育中發(fā)揮重要作用。相關(guān)報道發(fā)表在近期的相關(guān)報道發(fā)表在近期的Science雜志上。該文章的通訊作者雜志上。該文章的通訊作者Axel Visel博士稱其博士稱其研究結(jié)果表明很可

5、能人類基因組中的數(shù)千個增強子都不同程度的參與到面部發(fā)育研究結(jié)果表明很可能人類基因組中的數(shù)千個增強子都不同程度的參與到面部發(fā)育過程中。過程中。v該研究總共分析了四千多個可能與面部發(fā)育相關(guān)的增強子序該研究總共分析了四千多個可能與面部發(fā)育相關(guān)的增強子序列，建立了增強子序列的基因組圖譜。此外他們還細致分析列，建立了增強子序列的基因組圖譜。此外他們還細致分析了其中了其中200個基因增強子的活性。子女遺傳了父母的基因，個基因增強子的活性。子女遺傳了父母的基因，但是由于增強子的存在，在面部發(fā)育過程中基因活性不盡相但是由于增強子的存在，在面部發(fā)育過程中基因活性不盡相同，最終導致面部發(fā)育結(jié)果不完全相同。該結(jié)果還

6、提示遺傳同，最終導致面部發(fā)育結(jié)果不完全相同。該結(jié)果還提示遺傳學家，增強子的特異突變也會在新生兒缺陷中發(fā)揮作用。有學家，增強子的特異突變也會在新生兒缺陷中發(fā)揮作用。有助于開發(fā)更好的診斷和治療措施助于開發(fā)更好的診斷和治療措施。vFine Tuning of Craniofacial Morphology by Distant-Acting Enhancers Catia Attanasio, Alex S. Nord, Yiwen Zhu, Matthew J. Blow, Zirong Li, Denise K. Liberton, Harris Morrison, Ingrid Plajzer

7、-Frick, Amy Holt, Roya Hosseini, Sengthavy Phouanenavong, Jennifer A. Akiyama, Malak Shoukry, Veena Afzal, Edward M. Rubin, David R. FitzPatrick, Bing Ren, Benedikt Hallgrmsson, Len A. Pennacchio, Axel ViselvThe shape of the human face and skull is largely genetically determined. However, the genomi

8、c basis of craniofacial morphology is incompletely understood and hypothesized to involve protein-coding genes, as well as gene regulatory sequences. We used a combination of epigenomic profiling, in vivo characterization of candidate enhancer sequences in transgenic mice, and targeted deletion expe

9、riments to examine the role of distant-acting enhancers in craniofacial development. We identified complex regulatory landscapes consisting of enhancers that drive spatially complex developmental expression patterns. Analysis of mouse lines in which individual craniofacial enhancers had been deleted

10、 revealed significant alterations of craniofacial shape, demonstrating the functional importance of enhancers in defining face and skull morphology. These results demonstrate that enhancers are involved in craniofacial development and suggest that enhancer sequence variation contributes to the diver

11、sity of human facial morphology.doi: 10.1126/science.1241006運動和咖啡因運動和咖啡因會改變你的會改變你的DNA你可能會認為不管做任何事情，自己的DNA都是不會受影響而改變的。但在某種意義上說，這一想法是錯誤的。在3月Cell出版社的細胞代謝細胞代謝雜志上，研究人員發(fā)表報告稱當身體處于健康狀態(tài)時，不怎么運動的男性和女性在運動鍛煉幾分鐘后，他們體內(nèi)的DNA會出現(xiàn)瞬間變化。更讓人驚奇的是，這項研究表明我們早晨喝的咖啡中咖啡因成分也可能會以相同方式影響肌肉中的DNA。doi:10.1016/j.cmet.2012.01.001女性攜帶離婚基因

12、女性攜帶離婚基因 A-allele 者離婚率高出五成者離婚率高出五成v很多時候，當婚姻出現(xiàn)問題時，人們會把責任怪罪在男方頭上，認為男士的花心導致了婚姻破裂。v在近期的Biological Psychiatry雜志上刊登的一項研究成果表明，據(jù)瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡醫(yī)學院的最新研究發(fā)現(xiàn)，婚姻出現(xiàn)破裂也有可能是女性體內(nèi)攜帶的一種基因作祟所致。一種叫A-allele的催產(chǎn)素受體基因會在女性體內(nèi)搞怪，讓女性對婚姻關(guān)系中偶爾出現(xiàn)的不和諧插曲缺乏耐心，脾氣暴躁，從而提高離婚率。v女性處于生產(chǎn)期和哺乳期時體內(nèi)會自行分泌催產(chǎn)素，這種激素能拉近女性和后代間的關(guān)系。不過若催產(chǎn)素分泌異常就會攪亂大腦對感情問題的處理

13、能力，催生叫A-allele的“離婚基因”。研究人員調(diào)查了1800名女性后發(fā)現(xiàn)攜帶這種基因的女性離婚率高50%。doi:10.1016/j.biopsych.2011.09.002v概念及分類概念及分類v誘因與特點誘因與特點v突變與疾病突變與疾病v突變與遺傳工程技術(shù)突變與遺傳工程技術(shù)v突變的檢測突變的檢測基因突變概要基因突變概要A mutation has caused this garden moss rose(百葉百葉薔薇薔薇) to produce flowers of different colors. This is a somatic mutation that may also

14、be passed on in the germ line 概概 念：念：v基因突變：基因組基因突變：基因組DNADNA分子中發(fā)生分子中發(fā)生堿基堿基的的增添、缺失增添、缺失或改變或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進而引起遺傳表而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進而引起遺傳表型的改變。型的改變。一、概一、概 念念 及及 分分 類類Illustrations of five types of chromosomal mutations.Cells with one additional set of chromosomes, for a total of 69 chromosomes, are called t

15、riploidWhen an individual has two or more cell populations with a different chromosomal makeup, this situation is called chromosomal mosaicism.In a balanced translocation, pieces of chromosomes are rearranged but no genetic material is gained or lost in the cell.Mitochondria provide the cells energy

16、.基因突變基因突變指一個基因變?yōu)樗闹敢粋€基因變?yōu)樗牡任换虻任换颍腔蚍肿?，是基因分子結(jié)構(gòu)或化學組成上的改變。結(jié)構(gòu)或化學組成上的改變。突突 變變 分分 類類（遺傳信息的改變）（遺傳信息的改變）突變突變分類分類堿基改變堿基改變密碼效應(yīng)密碼效應(yīng)點突變點突變（point mutation）堿基插入突變堿基插入突變（base insert ）堿基缺失突變堿基缺失突變（base deletion）同義突變同義突變（synonymous mutation）錯義突變錯義突變（missense mutation）無義突變無義突變（nonsense mutation）移碼突變移碼突變（frame-shi

17、fting mutation）堿基改變堿基改變v點突變點突變：DNADNA被化學修飾或復制時發(fā)生錯配被化學修飾或復制時發(fā)生錯配 ，使一個堿基，使一個堿基變成另一個堿基變成另一個堿基。v堿基插入突變堿基插入突變：DNADNA鏈中插入鏈中插入1 1個或多個堿基（轉(zhuǎn)座子個或多個堿基（轉(zhuǎn)座子TnTn），突變后可引起），突變后可引起DNADNA序列閱讀框架改變序列閱讀框架改變。v堿基缺失突變堿基缺失突變：DNADNA鏈中鏈中1 1個或多個堿基發(fā)生丟失，突變個或多個堿基發(fā)生丟失，突變后可引起后可引起DNADNA序列閱讀框架改變序列閱讀框架改變。突變分類突變分類基因突變的基因突變的密碼效應(yīng)密碼效應(yīng)分類分類v

18、同義突變：堿基被替代后沒有密碼子改變，其產(chǎn)物同義突變：堿基被替代后沒有密碼子改變，其產(chǎn)物AAAA序序列也無變化。列也無變化。v錯義突變：堿基序列的改變引起錯義突變：堿基序列的改變引起AAAA序列改變。序列改變。v無義突變：某個堿基改變使某個無義突變：某個堿基改變使某個AAAA的密碼子成為蛋白質(zhì)的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。合成的終止密碼子。纈氨酸纈氨酸G U AHb中一條鏈中一條鏈 谷氨酸谷氨酸 G A A基因突變的其他分類方式基因突變的其他分類方式 形態(tài)突變形態(tài)突變生化突變生化突變致死突變致死突變按突變的表型特征分類按突變的表型特征分類: : 突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型

19、改變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細的生化技變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細的生化技術(shù)才能檢測出與術(shù)才能檢測出與野生型（野生型（WT)WT)的差別的差別，有的突變的表型效應(yīng)，有的突變的表型效應(yīng)可能如此之大，以致產(chǎn)生形態(tài)上的嚴重缺陷甚至死亡可能如此之大，以致產(chǎn)生形態(tài)上的嚴重缺陷甚至死亡。1 1、形態(tài)突變、形態(tài)突變(morphological mutation):(morphological mutation): 突變主要影響生物體突變主要影響生物體的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。如形狀、大小、如形狀、大小、色澤等的改變。色澤等的改變。

20、2 2、生化突變、生化突變(biochemical mutations): (biochemical mutations): 突變影響生物的代謝突變影響生物的代謝過程。導致一個特定的生化功能的改變或喪失。過程。導致一個特定的生化功能的改變或喪失。 （1 1）失去功能的突變：突變事件通常是破壞性的）失去功能的突變：突變事件通常是破壞性的，多數(shù)情況下，突變事，多數(shù)情況下，突變事件導致功能的喪失，完全喪失基因功能的突變稱為無效突變件導致功能的喪失，完全喪失基因功能的突變稱為無效突變(null (null mutation) mutation) 。通常喪失功能的突變是隱性的，。通常喪失功能的突變是隱性

21、的，有時候也可以是顯性的。有時候也可以是顯性的。 （2 2）獲得功能的突變）獲得功能的突變: :突變事件引起的遺傳隨機變化有可能使之獲得某種突變事件引起的遺傳隨機變化有可能使之獲得某種新的功能。新的功能。3 3、致死突變致死突變(lethal mutation):(lethal mutation): 影響生物體的生活力，導致個體死亡的一類突變。影響生物體的生活力，導致個體死亡的一類突變。 條件致死突變條件致死突變(conditional lethal mutations)(conditional lethal mutations)：在某些條件下能成活，：在某些條件下能成活，而在某些條件下是致死

22、的。例如而在某些條件下是致死的。例如T4T4噬菌體的溫度敏感突變型在噬菌體的溫度敏感突變型在2525時能在時能在E E. .colicoli 宿主細胞中正常生長，形成噬菌斑，但在宿主細胞中正常生長，形成噬菌斑，但在42 42 時就不能生長。時就不能生長。按發(fā)生突變的細胞分類按發(fā)生突變的細胞分類 基因突變可以發(fā)生在體細胞或生殖細胞基因突變可以發(fā)生在體細胞或生殖細胞中，這兩種突變有完全不同的后果。中，這兩種突變有完全不同的后果。體細胞體細胞突變突變生殖細胞生殖細胞突變突變1 1、體細胞突變體細胞突變( (somatic mutations): ): 在保持分裂的身體組織的一個細胞發(fā)生突在保持分裂的

23、身體組織的一個細胞發(fā)生突變，這個細胞便成為一群相同突變細胞的祖先。在發(fā)育過程中，體細胞突變事變，這個細胞便成為一群相同突變細胞的祖先。在發(fā)育過程中，體細胞突變事件發(fā)生的愈早，對表型的影響就愈大。體細胞突變一般不能遺傳給后代。件發(fā)生的愈早，對表型的影響就愈大。體細胞突變一般不能遺傳給后代。2 2、生殖細胞突變、生殖細胞突變(germinal mutation) ：生殖細胞突變發(fā)生在種系生殖細胞突變發(fā)生在種系(germ line)中。中。如果突變的性細胞參與受精過程，那么突變基因就會傳給下一代。如果突變的性細胞參與受精過程，那么突變基因就會傳給下一代。最典型的例最典型的例子是性連鎖遺傳的血友病突變

24、在歐洲王室通過維多利亞女王子是性連鎖遺傳的血友病突變在歐洲王室通過維多利亞女王在其整個家系中的在其整個家系中的遺傳遺傳。二、突變誘因及特點二、突變誘因及特點v自發(fā)性突變自發(fā)性突變 DNADNA復制過程中偶然堿基配對出現(xiàn)復制過程中偶然堿基配對出現(xiàn)錯誤錯誤 ，突變頻率低突變頻率低 (10-9 10-10) 。v誘變劑的作用誘變劑的作用 誘變劑（誘變劑（mutagen）外源誘發(fā)突）外源誘發(fā)突變的因素，種類繁多，突變頻率高變的因素，種類繁多，突變頻率高，是自然突變是自然突變的的100-1000100-1000倍倍 。主要有以下幾種：。主要有以下幾種：突變誘因突變誘因（1 1）物理因素物理因素 ：紫外線

25、、電離輻射等。紫外線、電離輻射等。（2 2） 生物因素生物因素 ：病毒、真菌、細菌等病毒、真菌、細菌等（3 3）化學因素化學因素 ： 烷化劑烷化劑 堿基類似物堿基類似物 : : 如如5-BrU5-BrU5-BrU 5-BrU 引起引起DNADNA堿基堿基改變示意圖改變示意圖 其他化學誘變劑其他化學誘變劑: : 羥胺、亞硝酸鹽等羥胺、亞硝酸鹽等基因突變表現(xiàn)出以下幾個方面的普遍特征：基因突變表現(xiàn)出以下幾個方面的普遍特征： (一一) 突變的平行性、重演性和可逆性突變的平行性、重演性和可逆性 (二二) 突變的多方向性與復等位基因突變的多方向性與復等位基因 (三三) 隨機性隨機性生物個體發(fā)育的任何時期生

26、物個體發(fā)育的任何時期 體細胞突變體細胞突變 不遺傳給后代不遺傳給后代 生殖細胞突變生殖細胞突變遺傳給后代遺傳給后代 (四四) 廣泛性和有害性（多數(shù)）廣泛性和有害性（多數(shù)）基因突變的一般特征基因突變的一般特征1.1.平行性平行性 是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)較近似而是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)較近似而發(fā)生相似基因突變的現(xiàn)象。發(fā)生相似基因突變的現(xiàn)象。 如小麥有早熟、晚熟的變異類型，屬于禾本科的其它物種如大麥、如小麥有早熟、晚熟的變異類型，屬于禾本科的其它物種如大麥、黑麥、燕麥、水稻、玉米等同樣存在這些變異類型。黑麥、燕麥、水稻、玉米等同樣存在這些變異類型。 2.2.重演性重演性 相同的基因

27、突變可以在同種生物的不同個體間相同的基因突變可以在同種生物的不同個體間重復發(fā)生，稱為重演性。重復發(fā)生，稱為重演性。 同一基因突變在不同的個體上均可能發(fā)生。同一基因突變在不同的個體上均可能發(fā)生。 不同群體中發(fā)生同一基因突變的頻率相近。不同群體中發(fā)生同一基因突變的頻率相近。突變的平行性、突變的平行性、重演性重演性和可逆性和可逆性 3. 可逆性可逆性：基因突變的發(fā)生方向是可逆的。：基因突變的發(fā)生方向是可逆的。正突變正突變(forward mutation)：顯性基因顯性基因A隱性基因隱性基因a ；反突變反突變(reverse mutation)： 隱性基因隱性基因a顯性基因顯性基因A 。通常認為：野

28、生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突通常認為：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突變往往是野生型基因突變而喪失功能、發(fā)生功能改變，表現(xiàn)為變往往是野生型基因突變而喪失功能、發(fā)生功能改變，表現(xiàn)為隱性基因。所以反突變又稱為隱性基因。所以反突變又稱為回復突變回復突變(back mutaiton)。 通常用通常用u表示正突變頻率、表示正突變頻率、v表示反突變頻率，則：表示反突變頻率，則： 正突變正突變u 野生型野生型=突變型突變型 一般一般 uv 反突變反突變v突變的多方向性：突變的多方向性：指基因突變可以多方向指基因突變可以多方向發(fā)生，即基因內(nèi)部多個突變部位分別改變發(fā)生，即基因內(nèi)部多個突變部

29、位分別改變后會產(chǎn)生多種等位基因形式。后會產(chǎn)生多種等位基因形式。例如：例如：A基因不同部位發(fā)生改變產(chǎn)生突變基因基因不同部位發(fā)生改變產(chǎn)生突變基因a1、a2、a3等對等對A均表現(xiàn)為隱性的基因。新基因可能均均表現(xiàn)為隱性的基因。新基因可能均是無功能的，也可能各具不同功能。這些復等位基是無功能的，也可能各具不同功能。這些復等位基因可以從野生型基因突變產(chǎn)生，也可以從其它任何因可以從野生型基因突變產(chǎn)生，也可以從其它任何一個突變基因突變產(chǎn)生。一個突變基因突變產(chǎn)生。 突變的突變的多方向性多方向性與與復等位基因復等位基因 復等位基因復等位基因(multiple allele)(multiple allele)： 位

30、于同一基因位點上的多種等位基因。位于同一基因位點上的多種等位基因。在二倍體與異源多倍體中，在二倍體與異源多倍體中，同一位點只能有一對同一位點只能有一對基因基因，最多存在兩種等位基因形式；因此復等位，最多存在兩種等位基因形式；因此復等位基因的各種形式會存在于基因的各種形式會存在于生物群體生物群體的的不同個體不同個體中。中。等位基因概念等位基因概念 人類紅細胞表面抗原的特異性由人類紅細胞表面抗原的特異性由3個個復等位基因復等位基因IA，IB，i決定。決定。其中其中IA，IB對對i均為顯性；均為顯性； IA，IB間為共顯性。間為共顯性。 3種基因兩兩組合可能形成種基因兩兩組合可能形成6種基因型、種基

31、因型、4種紅細胞表面抗種紅細胞表面抗原反應(yīng)類型，如下表所示原反應(yīng)類型，如下表所示(其中用其中用IO表示表示i)：人類人類ABO血型的復等位基因血型的復等位基因三、基因突變與疾病三、基因突變與疾病v人類所有疾病均可視為基因病v按照參與疾病發(fā)生過程的基因性質(zhì)和來源，基因病可分為三按照參與疾病發(fā)生過程的基因性質(zhì)和來源，基因病可分為三種種：Gene Mutations and Disease基因型基因型genotype表型表型phenotype正常正常/異常異常單基因病單基因病多基因病多基因病獲得性基因病獲得性基因病正常正常/異常異?；蛲蛔兣c疾病基因突變與疾病v代謝性疾病代謝性疾病v神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病

32、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病v發(fā)育缺陷發(fā)育缺陷v腫瘤腫瘤v早老癥早老癥No Symptoms Severe Symptoms Mild Symptoms No Symptoms Disease Inheritance is ComplexSearching Disease Families血友病突變在維多利亞女王血友病突變在維多利亞女王及及其整個家系中的遺傳其整個家系中的遺傳突突 變變 與與 疾疾 病病Tumor / Cancer早早 老老 癥癥早衰癥早衰癥全稱早年衰老綜合癥，又稱兒童早老癥，屬遺傳病。Hutchinson于1886年首先報告雖然本病為一種先天遺傳性疾病，但還不能確定是常染色體隱性還是顯性

33、遺傳。本病為一綜合征，特點為發(fā)育延遲，至嬰兒時期就發(fā)生進行性老年性退行性改變?；颊呱眢w的老化過程十分快速。而罹患此病孩童的年齡很少超過13歲，大約每八百萬個新生兒之中有一位患有此疾。赫赫-吉綜合征吉綜合征(HGPS)日本京都大學靈長類研究所副教授大日本京都大學靈長類研究所副教授大石高生的研究小組發(fā)現(xiàn)了年齡小但面石高生的研究小組發(fā)現(xiàn)了年齡小但面相衰老的相衰老的“早衰癥早衰癥”猴子，并將此發(fā)猴子，并將此發(fā)現(xiàn)發(fā)表在了美國科學雜志上?，F(xiàn)發(fā)表在了美國科學雜志上。該小組目標通過猴子細胞制造出的人該小組目標通過猴子細胞制造出的人工多功能干細胞工多功能干細胞(iPS)使機體各種細使機體各種細胞變異，體外再現(xiàn)早

34、衰癥病狀，以此胞變異，體外再現(xiàn)早衰癥病狀，以此幫助衰老研究。大石教授表示幫助衰老研究。大石教授表示“不僅不僅希望揭開早衰癥的病理，同樣想要研希望揭開早衰癥的病理，同樣想要研究人類正常衰老的課題究人類正常衰老的課題”。著色性干皮?。ㄖ愿善げ。╔P） 著色性干皮病著色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)與共濟失調(diào)毛細與共濟失調(diào)毛細血管擴張癥一樣，屬血管擴張癥一樣，屬DNA修復缺陷所致的遺傳性共濟失調(diào)綜合征。修復缺陷所致的遺傳性共濟失調(diào)綜合征。XP是常染色體隱性是常染色體隱性遺傳病遺傳病，具有遺傳異質(zhì)性。，具有遺傳異質(zhì)性。 著色性干皮病是著色性干皮病是一種發(fā)生在暴露部位的色

35、素變化，一種發(fā)生在暴露部位的色素變化，萎縮萎縮，角化及，角化及癌變癌變的遺傳性疾的遺傳性疾病，屬病，屬常染色體隱性遺傳病常染色體隱性遺傳病。21三體綜合三體綜合癥患兒癥患兒（先天愚型）（先天愚型）唇裂與腭裂Mitochondrial Mutator Mice Validate the mtDNA Mutation Theory for Mammalian Aging研究基因突變與疾病關(guān)系時應(yīng)注意的問題研究基因突變與疾病關(guān)系時應(yīng)注意的問題v致病突變與基因多態(tài)性致病突變與基因多態(tài)性：基因中某種突變在人群中發(fā)生頻率基因中某種突變在人群中發(fā)生頻率1%，屬，屬于基因多態(tài)性，該突變?yōu)橹行酝蛔?。發(fā)生頻率于基

36、因多態(tài)性，該突變?yōu)橹行酝蛔儭０l(fā)生頻率80%）而受到普遍歡迎，光是2012年的前9個月就有超過400篇發(fā)表的論文中用到這個產(chǎn)品。多位點定點突變多位點定點突變v在改造酶的活性或者動力學特性，研究蛋白之間的相互作用位點等研究過程中，單點突變不能滿足實驗的需要，重復進行單點突變也非常浪費時間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次實驗可以引入5個定點突變。原理就是準備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一

37、個引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)（mutant ssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點突變的質(zhì)粒。這樣，一次實驗可以得到不同數(shù)目突變的質(zhì)粒，對于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也是有用的。PCR定點突變定點突變_重疊延伸重疊延伸PCR誘變誘變v 試驗概要試驗概要：擴增的擴增的DNA片段在預設(shè)突變處重疊片段在預設(shè)突變處重疊(2次次PCR)，再與兩，再與兩 個與原始片段互補的側(cè)翼引物進行第個與原始片

38、段互補的側(cè)翼引物進行第3次次PCRv特點特點：需兩個突變誘導引物，兩個側(cè)翼引物，需兩個突變誘導引物，兩個側(cè)翼引物，3次次PCR。誘變率極高。誘變率極高大引物大引物PCR定點誘變定點誘變v試驗概要試驗概要：兩輪兩輪PCR，2個側(cè)翼引物，其中一個為預設(shè)突變引物，第個側(cè)翼引物，其中一個為預設(shè)突變引物，第一輪一輪PCR后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高（72）v特點特點：簡單，經(jīng)濟，平均誘變效率可達：簡單，經(jīng)濟，平均誘變效率可達80PCR原理示意圖原理示意圖PA5PA5PA5PA5PA5PA5PA5PA5PB5PC5PA5PB5PA5P

39、C555PCR-1PCR-1PCR-2PCR-2混合，變性混合，變性 ，退火，退火重疊延伸重疊延伸PCR定點突變定點突變5555PB5PC555PCR-3DNA 聚合酶聚合酶大引物大引物PCR定點誘變定點誘變5353引物引物2引物引物3PCR產(chǎn)生大引物產(chǎn)生大引物引物引物1突變體突變體PCR2五、突變的檢測五、突變的檢測v限制性片段長度多態(tài)性（限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）v單鏈構(gòu)象多態(tài)性（單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ single-strand conformation polymorphism ,SSCP ）v等位基因特

40、異性等位基因特異性PCR （ allele specific PCR ）v毛細管電泳法（毛細管電泳法（capillary electrophoresis）v測序（測序（sequencing）vDNA 芯片（芯片（chip）PCR-RFLP: 多聚酶鏈反應(yīng)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)限制性片段長度多態(tài)性性 (Restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理原理：PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶切多態(tài)性分產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶切多態(tài)性分 析，析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點發(fā)生改變。發(fā)生重排后，酶切位點發(fā)生改變。 優(yōu)點優(yōu)點：具有分辯率高，無需標記：具有

41、分辯率高，無需標記,重復性好，重復性好， 簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析 與比較與比較, 微生物的分群分型分亞型，癌基因微生物的分群分型分亞型，癌基因 分析，遺傳病的診斷等。分析，遺傳病的診斷等。 局限局限：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點改變：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點改變 的情況下，一次只能完成一個特定位點突變的情況下，一次只能完成一個特定位點突變 篩選，檢測效率低。篩選，檢測效率低。限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性PCR-RFLP原理示意原理示意聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ PCR-SSCP）原理：是將

42、經(jīng)擴增的原理：是將經(jīng)擴增的DNADNA片段經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由片段經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標準物的對比，即可檢測出有無電泳的遷移率不同，通過與標準物的對比，即可檢測出有無變異。變異。剛建立時是將同位素摻入剛建立時是將同位素摻入PCRPCR擴增的產(chǎn)物中，通過放射自顯擴增的產(chǎn)物中，通過放射自顯影顯示結(jié)果。后用銀染取代同位素顯示影顯示結(jié)果。后用銀染取代同位素顯示DNADNA帶型，大大降低帶型，大大降低了成本，具有經(jīng)濟、快速、靈敏等特點。了成本，具有經(jīng)濟、快速、靈敏等

43、特點。19931993年起用年起用EBEB染色染色法顯示法顯示DNADNA帶型，使得帶型，使得SSCPSSCP操作更簡單，更經(jīng)濟，更迅速。操作更簡單，更經(jīng)濟，更迅速。單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性 在引物設(shè)計中將在引物設(shè)計中將3端和端和/或附近設(shè)計一堿基，使其僅或附近設(shè)計一堿基，使其僅能與突變型或野生型相同（能與突變型或野生型相同（正鏈引物正鏈引物）或互補（）或互補（反鏈引反鏈引物物），），從而只擴增突變型或野生型基因，根據(jù)擴增帶的有從而只擴增突變型或野生型基因，根據(jù)擴增帶的有無進行突變純合子、雜合子或野生型的判斷。無進行突變純合子、雜合子或野生型的判斷。 M 1 2 3左圖左圖 AS-PCR檢測兩個基因檢測兩個基因突變位點。突變位點。M-Marker，1, 2-正常組，正常組，3-突變組突變組等位基因特異性等位基因特異性PCR (AS-PCR) 根據(jù)根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無直接進行突變分析的方法。產(chǎn)物的有無直接進行突變分析的方法。1、高效毛細管電泳技術(shù)簡介、高效毛細管電泳技術(shù)簡介 毛細管電泳毛細管電泳(capillary electrophoresis)又稱高效毛細管電泳又稱高效毛細管電泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE)，是，是20世世紀紀80年代中期問世的一種高效液相分離法，是經(jīng)典電泳技術(shù)年代中期問世的