生物電子顯微術第一章ppt課件

1、 生物電子顯微術河北農(nóng)業(yè)大學生命學院生物電子顯微術1 緒論基本概念EM發(fā)展史EM分類及特點電鏡技術的應用各種顯微鏡性能與特點的比較2 電子顯微鏡的基本知識TEM的結(jié)構(gòu)和原理SEM的結(jié)構(gòu)和原理3 超薄切片技術基本概念普通超薄切片技術4 負染色技術5 金屬投影和復型技術金屬投影技術復型技術6 EM冷凍制樣技術概述冷凍超薄切片技術冷凍斷裂(蝕刻)及復型技術冷凍安全規(guī)則7 SEM的樣品制備技術 概述SEM電鏡的樣品制備特殊樣品的制備8 電鏡的應用(個案分析）花粉表面形態(tài)的SEM觀察熏蒸固定真菌的SEM觀察樣品包埋塊的制作掃描電鏡觀察石蠟切片觀察法植物原生質(zhì)體超薄切片的制作真菌菌絲及孢子的包埋9 X-r

2、ay顯微分析X-ray微區(qū)分析的基本原理X-ray顯微分析儀工作的基本原理X-ray顯微分析的方法及應用10 其他顯微技術掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡掃描電-聲顯微鏡生物電子顯微術I.課時安排II.講授：30學時III.實驗：10學時IV.主要內(nèi)容：V.電鏡的原理、構(gòu)造TEM，SEM）VI.電鏡的樣品制備技術VII. 1) 超薄切片技術 4) 金屬投影及復型技術 VIII. 2) 負染色技術 5) SEM制樣技術IX. 3) 冷凍制樣技術 6) 其他制樣技術X.應用舉例主要參考文獻生物電子顯微術 張景強 中山大學出版實用生物電子顯微術 林鈞安 遼寧科技出版生物電子顯微術教程 陳

3、力 北師大出版電子顯微鏡與電子光學 黃蘭友 科學出版生物醫(yī)學電子顯微技術 程時 北醫(yī)、協(xié)和生物學工作者實用生物電子顯微術 英 G1976 參考文獻參考文獻1，2，3圖書館均有圖書館均有第一章 緒論1.1基本概念1. 電子顯微鏡：簡稱電鏡 利用電子束作為照明源，電磁透鏡聚焦成像，并結(jié)合特定的機械裝置，應用現(xiàn)代電子技術、高真空技術而制成的一種精密電子光學儀器。 TEM：Transmission Electron MicroscopeSEM： Scanning Electron Microscope2電子顯微術：以電子顯微鏡為工具，對物質(zhì)樣品進行物理、化學、成分、超微結(jié)構(gòu)等方面研究的一種技術。 電子

4、顯微術定義: 電子顯微學是凝聚態(tài)物理、材料科學、乃至生命科學的交叉學科，是物質(zhì)科學研究的一個重要組成部分。它是以電子顯微學等方法, 在原子尺度上對物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)進行研究分析, 從而促進了新物質(zhì)、新結(jié)構(gòu)、新性能、新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，極大地推動了新材料、新器件的發(fā)展。 3超微結(jié)構(gòu)： 指一般光學顯微鏡不能分辨的細微形態(tài)結(jié)構(gòu)亞顯微 構(gòu)造），直至生物大分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、核酸、多糖、 脂類）。4電子顯微方法：Electron Microscopy 指利用電子與固體樣品作用時所發(fā)出的信息，對樣品 進行微區(qū)觀察和分析的一種方法。 1mm=103 m 1m=103nm 1nm=10 1 =10-10m1.2 電子顯微鏡

5、的發(fā)展概況光學顯微鏡的發(fā)展(LM: light microscope)光鏡的誕生人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的兩點之間的最短距離用“”表示 13世紀玻璃的發(fā)明 制造眼鏡、放大鏡16世紀 歐洲放大鏡=0.01 M=330倍1590年 荷蘭眼鏡商Hans之子-Janssen裝配具有劃時代意義的“顯微鏡”1665年 英國物理學家Robert Hook(虎克) 第一臺光學顯微鏡1675年 荷蘭Leeuwen.Hook(列文.賀克 M=270倍, 共研制247臺光鏡高倍率的光鏡18世紀到19世紀中葉 英、法、意相繼研制消色差顯微鏡 M=15002000 人的視力提高了1000多倍 0.2 m 3. 光鏡

6、的局限性1878年 德.理論光學家 E.Abbe提出 光鏡的最優(yōu)分辨率 opt=0.4*光波的反射水波障礙物:石塊產(chǎn)生的影子蘆葦桿表1-1 電磁波各光譜區(qū)的一些參數(shù)及相應的結(jié)構(gòu)分析方法 光譜區(qū) 波長/nm 波數(shù)1/ )(cm 頻率()/ Hz 能量/eV 對應分析 方法 無線電波 10131010 10-610-4 105109 10-1010-5 核磁共振 微波 109106 10-3101 1091011 10-510-3 順磁共振 紅外光 106103 101104 10121014 10-2100 紅外光譜 可見光 8102 4102 1.31042.5104 3.810141015

7、1.6101 可見光譜 紫外光 4102 1102 2.5104105 10151.51016 101102 紫外光譜 X 射線 10210-2 106108 10161018 103106 X射線光譜 拉 曼 光 譜 可見光波長 40008000 opt=0.4*光 紫外線波長 =3900130 紫外線顯微鏡opt=1000 X-ray =1000.5 但無法偏轉(zhuǎn)不能成像 目前,光鏡最好分辨率opt=0.160.32 m 結(jié)論: 利用波長的更短光線做照明光源,可提高分辨率。 （OR：波長越短，分辨率越高） 電子波波長很短 易于成像，從而導致 電鏡的產(chǎn)生和發(fā)展l電鏡的發(fā)展l國外情況l 電鏡產(chǎn)生

8、的三大理論基礎l Thomson1897證明電子的存在l L.de.Broglie(德.1923)提出微觀粒子的波粒二l 相 性l H.Busch(德.1926)建立幾何電子光學理論l電子的存在l19世紀50年代 德.波恩Geisslerl 1858年,Pluker(德.波恩物理學家),發(fā)現(xiàn)陰極射線1881年,Hertz(赫茲)只認識到陰極射線具有波動性1897年, Thomson證明陰極射線是帶電粒子其荷質(zhì)比為1011C/Kg波粒二相性 法國. L.de.Broglie提出: 一個動量為P,能量為E的自由運動的電子,相當于波長為 =h/p,頻率為V=E/h,并沿著粒子運動方向傳播的平面波.

9、電子束既有粒子性,也有波動性。l幾何電子光學理論l 電子光學：指研究和利用電子流的偏轉(zhuǎn)、聚焦、l 成像規(guī)律的一門學科。l1925年，柏林工學院M.knoll 和 A.Matthias嘗試做聚焦的電子束透鏡l1926年， H.Busch 帶有鐵軛的短磁透鏡聚焦理論lD.gabor(M.knoll 的學生包殼透鏡(1948年提出全息技術 全息技術之父并獲諾貝爾獎)l1928-1929, Ernst.Ruska 極靴磁透鏡,現(xiàn)代磁透鏡l透射電鏡的誕生l1932年， M.Knoll 和他的學生E.Ruska發(fā)明了電鏡 ,放大倍數(shù)16倍;改進后75Kv, 1.2萬倍l1939年,西門子制造第一臺商品透射

10、電鏡l1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌體,建立第一個開放實驗室l1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer獲得諾貝爾物理獎l掃描電鏡的誕生l1935年， M.knoll 設計第一臺SEMl1956年，二次電子探測器出現(xiàn)l1956年， SEM商品化l國內(nèi)情況l校外狀況lTEMl1953年，長春光機所第一臺 XD-100型 100kv TEMl1965年，中科院科儀廠 DX-2型TEM 100kv 5 l1970年，上海新躍儀表廠 DXB1_12型TEM 40萬l1977年，上海新躍 DXB2_12型TEM 80萬 2 lSEMl19

11、75年，中科院科儀廠 第一臺SEMl DX-3 100 DX-5 60 l1980年，中科儀 KYKY-1000Bl1993年，中科儀 KYKY-2000 KYKY-2800 l KYKY-2800B KYKY-3800vSTM (scanning tunneling microscope)v1987年，中科儀、中科院化學所白春禮等研制 第一臺STM SSX-1型v國產(chǎn)電鏡的缺點：v 制造工藝粗燥、自動化程度低、清潔度差v我校情況v1980s DX-2型TEMv2019年， KYKY-2800型數(shù)字式掃描電鏡v分辨率6nm，放大倍數(shù)10萬1.3 EM分類及特點透射電鏡TEM）原理：利用TE，整

12、幅像同時成立，在熒光板上成象特點：樣品超薄 h1000 二維平面像、立體感差分辨率高 opt=2 樣品制備復雜觀察對象：樣品內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡SEM）原理：利用SE，逐點成像，顯像管上成象特點：圖象立體感強、可觀察一定厚度的樣品樣品制備簡單，可觀察較大的樣品分辨率高，3040 倍率連續(xù)可變，從4倍15萬倍可配附件，進行微區(qū)的定量、定性分析觀察對象：樣品表面微觀結(jié)構(gòu)掃描透射電鏡STEM）兼顧SEM/TEM的特點、造價高、可觀察較厚樣品(0.204m)分辨率不如TEM高,高分辨型0.30.5nm;附件型1.53nm在200KV時，輻射損傷小、污染小能過檢測到掃描透射電子，獲取更多超微結(jié)構(gòu)信息圖像

13、的反差和亮度易調(diào)節(jié)，切片可以不染色顯像方式：熒光屏、顯像管 觀察對象：外表、內(nèi)部超高壓電鏡UHVEM:ultra-high voltage electron microscope） HV500kv為超高壓電鏡，Hvmax=3MV 其特點：穿透能力強、可觀察較厚的樣品 m 級分辨率高，2 晶格分辨率）單色性好，色差小，成像質(zhì)量好輻射損傷小體積龐大、結(jié)構(gòu)復雜、價格昂貴、需專用的防護裝置觀察對象：主要非生物材料的晶格結(jié)構(gòu)、觀察細胞骨架 系統(tǒng)微梁、微絲）l分析電鏡AEM:analysis electron electron microscope )l 連續(xù)X-ray 背底扣除l 能量：Z 特征X-ra

14、y的能量l 特征X-ray l 波長： Z 特征X-ray的波長l波譜儀WDS）l Wavelength-disperse spectrometerl 微區(qū)定量分析，4Be 92U 慢2060分，靈敏度高l能譜儀EDS）l Energy- disperse spectrometerl 微區(qū)定性分析，11Na 92U 快23分，靈敏度低l低壓掃描電鏡LVSEM:low voltage）l HV=1Kv，可觀察絕緣物質(zhì)、生物樣品l 試樣不易發(fā)生充放電效應l生物分析電鏡BATEM:biologic analysis ）l TEM+EDSor：WDS）l 分辨率高 =1.5 、分析性能好l掃描隧道顯微

15、鏡STM:scanning tunneling microscope）l M=1000萬倍，水平1 ， 垂直0.1 l可進行“活體觀察、可在大氣、液體環(huán)境下直接觀察物質(zhì)表面特征l 只能觀察導體和半導體的表面結(jié)構(gòu)、非導電的物質(zhì)需要覆蓋一層導電薄膜l STM主要用于研究表面科學、半導體材料、生命科學 優(yōu)點：優(yōu)點： 可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術，將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷。這些特點適用于研究生物并且探測過程對樣品無損傷。這些特點適用于研究生物樣品和在

16、不同試驗條件下對樣品表面的評價，例如對于樣品和在不同試驗條件下對樣品表面的評價，例如對于多相催化機理、超導機制、電化學反應過程中電極表面多相催化機理、超導機制、電化學反應過程中電極表面變化的監(jiān)測等。變化的監(jiān)測等。STM在生物領域的應用：在生物領域的應用： STM在生物和有機材料一領域有著廣泛的應用前在生物和有機材料一領域有著廣泛的應用前景。盡管目前還存在著如何解釋生物樣品的景。盡管目前還存在著如何解釋生物樣品的STM圖象、圖象、如何更好地制備生物樣品以及選擇合適襯底以沉積生物如何更好地制備生物樣品以及選擇合適襯底以沉積生物分子等問題，但實際應用中已取得了不少好結(jié)果。例如分子等問題，但實際應用中

17、已取得了不少好結(jié)果。例如在真空、大氣和溶液條件下的在真空、大氣和溶液條件下的DNA研究，球蛋白、膠原研究，球蛋白、膠原蛋白及紅血球的研究等。蛋白及紅血球的研究等。STM在納米科技中的應用：在納米科技中的應用： STM不僅能夠?qū)悠繁砻孢M行成像，而且還能在納不僅能夠?qū)悠繁砻孢M行成像，而且還能在納米尺度上對材料表面進行刻蝕與修飾。由微觀到宏觀，米尺度上對材料表面進行刻蝕與修飾。由微觀到宏觀，即直接操縱單個原子和分子，對它們進行排列組合，以即直接操縱單個原子和分子，對它們進行排列組合，以形成新的物質(zhì)，或制造出一定功能的機器這是實現(xiàn)納米形成新的物質(zhì)，或制造出一定功能的機器這是實現(xiàn)納米加工的新思想，加

18、工的新思想，STM的出現(xiàn)使這一思想變?yōu)楝F(xiàn)實。自從的出現(xiàn)使這一思想變?yōu)楝F(xiàn)實。自從STM問世以來，問世以來，STM作為一種納米加工的工具的研究已作為一種納米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻寫、電子束誘導沉積以及單原子操縱涉及到表面直接刻寫、電子束誘導沉積以及單原子操縱等方面，并取得了一批高水平的研究結(jié)果。等方面，并取得了一批高水平的研究結(jié)果。硅硅111面面7 7原子重構(gòu)象原子重構(gòu)象 硅片是大家熟悉的制作晶體管和大規(guī)模集成電路的硅片是大家熟悉的制作晶體管和大規(guī)模集成電路的半導體材料，為了得到表面清潔的單質(zhì)材料，要對硅片半導體材料，為了得到表面清潔的單質(zhì)材料，要對硅片進行高溫加熱和退火處理，在加熱和

19、退火處理的過程中進行高溫加熱和退火處理，在加熱和退火處理的過程中硅表面的原子進行重新組合，結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，這就硅表面的原子進行重新組合，結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，這就是所謂的重構(gòu)。是所謂的重構(gòu)。液體中觀察原子圖象液體中觀察原子圖象 下圖所示的是在電解液中得到的硫酸根離子吸下圖所示的是在電解液中得到的硫酸根離子吸附在銅單晶附在銅單晶(111)表面的表面的STM圖象。圖中硫酸根圖象。圖中硫酸根離子吸附狀態(tài)的一級和二級結(jié)構(gòu)清晰可見。離子吸附狀態(tài)的一級和二級結(jié)構(gòu)清晰可見。 1990年，IBM公司的科學家展示了一項令世人瞠目結(jié)舌的成果，他們在金屬鎳表面用35個惰性氣體氙原子組成“IBM三個英文字母。 科學家把

20、碳60分子每十個一組放在銅的表面組成了世界上最小的算盤。與普通算盤不同的是，算珠不是用細桿穿起來，而是沿著銅表面的原子臺階排列的. 這是中國科學院化學所的科技人員利用納米加工技術在石墨表面通過搬遷碳原子而繪制出的世界上最小的中國地圖。DNA分子拉成的DNA圖象l原子力顯微鏡AFM：atomic force microscope)l導電樣品、非導電樣品均可觀察l分辨率達到原子水平 l 可以在真空、超高真空、電化學環(huán)境、常溫低溫條件下工作l 應用于表面科學、生命科學、材料科學l l 注：以STM、AFM為基礎，衍生出掃描探針顯微鏡SPM ：Scanning probe microscope ）：如激光力顯微鏡LFM）、掃描電化學顯微鏡SECM）l環(huán)境掃描電鏡ESEM）l特點：l多種真空狀態(tài)：高、低、超低真空l 1Torr=1mmHg柱壓力=1/760大氣壓=133.3Pal 粗真空：76010乇l 低真空：1010-3乇l 高真空：10-310-8乇l 超高真空：10-8乇以下l 多種真空條件下可得SE像、BE像，且 =4nml樣品室可充氣體:水氣、氮氣l動態(tài)分析：樣品溫度從-185 1000 l制樣簡單：樣品無