豬人工授精實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵技術(shù)

1、豬人工授精實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵技術(shù)豬人工授精實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵技術(shù) 報(bào)告內(nèi)容報(bào)告內(nèi)容豬人工授精的歷史及現(xiàn)狀豬人工授精的歷史及現(xiàn)狀豬人工授精的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備豬人工授精的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備豬人工授精的意義豬人工授精的意義豬精液的人工采集豬精液的人工采集豬精液的品質(zhì)檢查豬精液的品質(zhì)檢查豬精液的保存處理豬精液的保存處理豬精液處理后輸精豬精液處理后輸精豬人工授精的歷史及現(xiàn)狀豬人工授精的歷史及現(xiàn)狀該技術(shù)始于該技術(shù)始于20世紀(jì)世紀(jì)30年代，已有年代，已有70多年的歷史多年的歷史我國始于上世紀(jì)我國始于上世紀(jì)50年代，未達(dá)到理想的推廣程度年代，未達(dá)到理想的推廣程度20世紀(jì)世紀(jì)90年代后，該技術(shù)得到迅速普及年代后，該技術(shù)得到迅速普及目前該技術(shù)

2、已成為豬配種繁殖的主要手段之一目前該技術(shù)已成為豬配種繁殖的主要手段之一豬人工授精的意義豬人工授精的意義減少飼養(yǎng)頭數(shù)，充分發(fā)揮優(yōu)秀公豬的遺傳潛力減少飼養(yǎng)頭數(shù)，充分發(fā)揮優(yōu)秀公豬的遺傳潛力減少疾病傳播，提高生產(chǎn)效率，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益減少疾病傳播，提高生產(chǎn)效率，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益與繁殖控制技術(shù)結(jié)合，利于現(xiàn)代化養(yǎng)豬技術(shù)體系建立與繁殖控制技術(shù)結(jié)合，利于現(xiàn)代化養(yǎng)豬技術(shù)體系建立精液保存技術(shù)的發(fā)展，加快豬育種進(jìn)程精液保存技術(shù)的發(fā)展，加快豬育種進(jìn)程公畜使用不受其生理年限限制公畜使用不受其生理年限限制便于引入外源群體基因，加快遺傳進(jìn)展的擴(kuò)散速度便于引入外源群體基因，加快遺傳進(jìn)展的擴(kuò)散速度實(shí)現(xiàn)科學(xué)養(yǎng)豬，養(yǎng)豬生產(chǎn)規(guī)模

3、化，現(xiàn)代化的重要手段實(shí)現(xiàn)科學(xué)養(yǎng)豬，養(yǎng)豬生產(chǎn)規(guī)?；?，現(xiàn)代化的重要手段精液的冷凍保存，可降低活體保種成本，防止基因漂變精液的冷凍保存，可降低活體保種成本，防止基因漂變豬人工授精的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備豬人工授精的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 儀儀 器器顯微鏡、精子密度測(cè)定儀、電子天平顯微鏡、精子密度測(cè)定儀、電子天平 、恒溫水浴、恒溫水浴鍋、恒溫精液保存箱、鍋、恒溫精液保存箱、pH計(jì)（試紙）、計(jì)（試紙）、 精子計(jì)數(shù)精子計(jì)數(shù)數(shù)器、移液器等數(shù)器、移液器等 器器 皿皿溫度計(jì)、量筒、燒杯、保溫瓶、溫度計(jì)、量筒、燒杯、保溫瓶、采精杯采精杯、玻璃棒等、玻璃棒等 消耗品消耗品紗布、輸精瓶、輸精管、乳膠手套、采精袋紗布、輸精瓶、輸精管、乳膠手套

4、、采精袋 、 稀稀稀釋粉等稀釋粉等豬精液的采集豬精液的采集采采集集前前的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備工工作作豬豬精精液液采采精精的的方方法法精液采集前的準(zhǔn)備工作精液采集前的準(zhǔn)備工作實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備精精液液稀稀釋釋液液準(zhǔn)準(zhǔn)備備操操作作人人員員的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備采采精精器器皿皿的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備檢檢測(cè)測(cè)儀儀器器的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備分分裝裝器器皿皿的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備采采精精公公豬豬的的準(zhǔn)準(zhǔn)備備豬的人工采精方法豬的人工采精方法電電刺刺激激采采精精法法手手握握采采精精法法假假陰陰道道采采精精法法手握采精法手握采精法用溫的生理鹽水清洗豬腹部和包皮用溫的生理鹽水清洗豬腹部和包皮 一手帶雙層手套，另一手持集精杯一手帶雙層手套，另一手持集精杯公豬

5、伸出陰莖時(shí)，脫去外層手套公豬伸出陰莖時(shí)，脫去外層手套 用手緊握伸出的公豬陰莖螺旋狀龜頭用手緊握伸出的公豬陰莖螺旋狀龜頭順其向前沖力將陰莖的順其向前沖力將陰莖的“S”狀彎曲拉直狀彎曲拉直 收集濃份精液于集精杯的一次性采精袋收集濃份精液于集精杯的一次性采精袋 成年公豬：成年公豬：2次次/ 周周 青年公豬：青年公豬： 1次次/周周 豬精液的品質(zhì)檢查豬精液的品質(zhì)檢查品品質(zhì)質(zhì)檢檢查查的的目目的的精精液液顯顯微微鏡鏡檢檢查查精精液液外外觀觀檢檢查查精液的外觀檢查精液的外觀檢查 乳白色或淺灰色乳白色或淺灰色呈云霧狀呈云霧狀 綠色、黃色綠色、黃色 淺紅色、紅褐色淺紅色、紅褐色 略帶腥味略帶腥味 惡臭等異常氣味

6、惡臭等異常氣味 正常精液正常精液pH值為值為 pH值越低值越低, 精子密度越大精子密度越大 電子天平稱量法電子天平稱量法按按1g = 1 ml計(jì)計(jì) 射精量為射精量為200500 ml 正常正常正常正常異常異常異常異常精液的顯微鏡檢查精液的顯微鏡檢查 精精子子活活率率檢檢查查精精子子畸畸形形率率檢檢查查精精子子密密度度檢檢查查精子活率檢查精子活率檢查玻片升溫至玻片升溫至37 取精液取精液10l制片制片 于于37恒溫臺(tái)上恒溫臺(tái)上 相差顯微鏡下相差顯微鏡下 400倍觀察精子倍觀察精子 與受精能力相關(guān)與受精能力相關(guān) 精子活率精子活率精液品質(zhì)的指標(biāo)精液品質(zhì)的指標(biāo) 按的十級(jí)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)估按的十級(jí)評(píng)分法進(jìn)行

7、評(píng)估 目測(cè)估測(cè)法目測(cè)估測(cè)法活率要求活率要求 鮮精活率鮮精活率0.7才可進(jìn)行稀釋配制才可進(jìn)行稀釋配制 保存精液活率保存精液活率0.6才可以使用才可以使用 一個(gè)精子為一個(gè)精子為“密密”一個(gè)精子為一個(gè)精子為“中中”一個(gè)精子為一個(gè)精子為“稀稀”滴上滴上1滴稀釋精液滴稀釋精液原精液原精液200L3%NaCl稀釋稀釋10倍倍計(jì)數(shù)板上放蓋玻片計(jì)數(shù)板上放蓋玻片計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)5個(gè)中方格精子個(gè)中方格精子將該數(shù)乘以將該數(shù)乘以50萬萬精子計(jì)數(shù)注意：讓稀釋后的精液通過毛細(xì)作用自行吸入！用吸管稀釋后精液用吸管稀釋后精液注入計(jì)數(shù)室注入計(jì)數(shù)室共有兩個(gè)對(duì)稱的計(jì)數(shù)室精子計(jì)數(shù)以圖示次序計(jì)數(shù)，精子以圖示次序計(jì)數(shù)，精子的頭部為準(zhǔn)，依數(shù)上不的

8、頭部為準(zhǔn)，依數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左右不數(shù)右的數(shù)下，數(shù)左右不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)格線上的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)格線上的精子。白色精子不計(jì)數(shù)精子。白色精子不計(jì)數(shù)計(jì)算公式計(jì)算公式 1ml原精液內(nèi)的精子數(shù)原精液內(nèi)的精子數(shù)5個(gè)中方個(gè)數(shù)的個(gè)中方個(gè)數(shù)的精子數(shù)精子數(shù)5 10 1000 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) （如為原精液不（如為原精液不 稀釋倍數(shù)）稀釋倍數(shù)）精子畸形率檢查精子畸形率檢查取中層精液抹片 固定液固定20minGiemsa染色90min水洗并風(fēng)干置1000倍油鏡下觀察精子 300個(gè)畸形率檢查方法畸形率檢查方法 相差顯微鏡直接觀察伊紅或姬姆薩等染色后普通顯微鏡觀察畸形率要求畸形率要求 一般要求不超過18%為宜染色后顯微鏡觀查

9、染色后顯微鏡觀查 儀器觀察精子活力及膜的完整性A.死精子區(qū)域:PI,陽性;AnV-FITC,陰性。B.死精子區(qū)域:PI,陽性;AnV-FITC,陽性。 C.活精子區(qū)域:PI,陰性;AnV-FITC,陰性。 D.活精子區(qū)域:PI,陰性;AnV-FITC,陽性。H33342 標(biāo)記所有精子細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；PI標(biāo)記死精子的細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光；發(fā)生頂體反應(yīng)或頂體膜破損的精子被FITC-PNA 標(biāo)記,呈現(xiàn)綠色頂體。l熒光顯微鏡下觀察精子的活力和頂體狀態(tài)熒光顯微鏡下觀察精子的活力和頂體狀態(tài)l流式細(xì)胞儀觀察精子的活力和頂體狀態(tài)流式細(xì)胞儀觀察精子的活力和頂體狀態(tài)豬精液的保存處理豬精液的保存處理精液的稀釋精液

10、的稀釋精液的分裝精液的分裝精液的保存精液的保存精液的冷凍及解凍精液的冷凍及解凍精液的運(yùn)輸精液的運(yùn)輸精液的稀釋精液的稀釋器具須消毒，使用前，用少量稀釋液沖洗一遍品質(zhì)檢查不合格(活率0.7)的精液不能稀釋精液采集后盡快稀釋, 原精貯存時(shí)間不宜超過30min稀釋時(shí)嚴(yán)禁太陽光直射精液,應(yīng)于較暗處操作精液要求等溫稀釋,以精液為標(biāo)準(zhǔn),調(diào)節(jié)稀釋液溫度稀釋液沿杯壁加入到精液中,沿一個(gè)方向攪拌混勻高倍稀釋時(shí)先進(jìn)行低倍稀釋,以防 “稀釋打擊”稀釋倍數(shù): 根據(jù)精液的品質(zhì),輸精量,配種母豬頭數(shù)以每個(gè)輸精劑量40億/80 100ml來確定稀釋倍數(shù)稀釋后要求靜置片刻再作精子活率檢查精液的分裝精液的分裝精液的分裝精液的分裝

11、 瓶裝管裝袋裝分裝簡(jiǎn)單方便用于冷凍保存輸精方便，但需分裝機(jī)分裝后標(biāo)注分裝后標(biāo)注 公豬品種公豬耳號(hào)生產(chǎn)日期稀釋液名稱稀釋后分裝的豬精液精液的保存精液的保存保存溫度保存溫度 常溫（17等）低溫（4等）冷凍（-196）生產(chǎn)上：常溫17常溫保存要求常溫保存要求 精液需緩慢降溫，室溫12h或紗布包裹每12h將精液搖勻1次，要輕緩均勻注意冰箱內(nèi)溫度的變化防止溫度升高或降低減少保存箱開關(guān)次數(shù)，以減少對(duì)精子的影響使用前檢查活率，活率0.6精液應(yīng)棄之用稀釋液保存的精液，應(yīng)盡快用完精液的冷凍及解凍方法精液的冷凍及解凍方法 (Westendorf et al. 設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)， Bwanga et al 改進(jìn)改進(jìn)) 稀

12、釋流程稀釋流程 冷凍流程冷凍流程解凍流程解凍流程 精液采集并進(jìn)行質(zhì)量檢查 用BTS稀釋，降溫（15，3 h） 離心（800g，10 min），棄除上清 用LEY稀釋，降溫（5，2 h） 5條件下，用含甘油的LEY稀釋 分裝于5ml扁平袋（細(xì)管）或0.5 ml細(xì)管 置于冷凍支架并移入程序冷凍儀（5） 3 /min， 5 -5，保持 1 min結(jié)晶 50/min， -5 -140，液氮儲(chǔ)存 5ml扁平袋: 50 ，13 s 5ml 細(xì)管: 50 ， 40 s 0.5ml 細(xì)管: 50 ，12 s或37 , 20s精液的運(yùn)輸精液的運(yùn)輸精液運(yùn)輸關(guān)鍵精液運(yùn)輸關(guān)鍵 保溫、防震、避光運(yùn)輸注意事項(xiàng)運(yùn)輸注意事項(xiàng)

13、 運(yùn)輸前應(yīng)檢查活率，低于0.7的精液嚴(yán)禁調(diào)出包裝瓶（袋）應(yīng)排盡空氣，以減少運(yùn)輸震蕩運(yùn)輸過程中，放入保溫箱中保溫（1618）到達(dá)目的地，檢查精子活率，合格方可接收運(yùn)輸過程中，應(yīng)嚴(yán)格避光輸精輸精輸精的時(shí)間輸精的時(shí)間輸精的方法輸精的方法填寫輸精記錄填寫輸精記錄人工授精人工授精（Artifical insemination：AI）借助于專門的器械，用人工的方法采取借助于專門的器械，用人工的方法采取公畜精液，經(jīng)體外檢查與處理后，再輸公畜精液，經(jīng)體外檢查與處理后，再輸入發(fā)情母畜的生殖道內(nèi)，使其受胎的一入發(fā)情母畜的生殖道內(nèi)，使其受胎的一種繁殖技術(shù)。種繁殖技術(shù)。人工授精技術(shù)包括：人工授精技術(shù)包括： 采精采精精

14、液品質(zhì)評(píng)定精液品質(zhì)評(píng)定稀釋稀釋保存保存運(yùn)運(yùn)輸輸輸精等環(huán)節(jié)。輸精等環(huán)節(jié)。輸精的時(shí)間輸精的時(shí)間輸精時(shí)間輸精時(shí)間 第一次輸精：出現(xiàn)靜立反射后12h左右進(jìn)行第二次輸精：第一次輸精后812h進(jìn)行豎耳，陰部紅腫，出現(xiàn)靜立反射母豬接收公豬或其它母豬的爬跨有爬跨其它母豬的行為發(fā)情母豬表現(xiàn)發(fā)情母豬表現(xiàn) 豬發(fā)情癥狀與人工授精最佳時(shí)間輸輸 精精 方方 法法子宮頸輸精法子宮頸輸精法 intra-cervical insemination，intra-CAI子宮內(nèi)輸精法子宮內(nèi)輸精法 post-cervical insemination，post-CAI子宮角輸精法子宮角輸精法 deep uterine insemina

15、tion，DUI 宮頸輸精法宮頸輸精法 消毒清潔雙手，戴上消毒手套 清潔母豬外陰、尾根及臀部周圍 取出滅菌后的輸精管，在其前端涂上潤滑劑 將輸精管45向上插入母豬生殖道內(nèi)直到子宮頸 取出精液輕輕搖勻，去除瓶嘴，接輸精管，輸精 輸精完畢后抽出輸精管 一個(gè)情期內(nèi)輸精兩次(間隔812 h)豬人工授精 精子在母畜生殖道運(yùn)行中的損耗精子在母畜生殖道運(yùn)行中的損耗 射精后的精子射精后的精子在母畜生殖道在母畜生殖道內(nèi)要通過三道內(nèi)要通過三道屏障：屏障：子宮頸子宮頸子宮子宮腺窩與宮管結(jié)腺窩與宮管結(jié)合部合部壺峽連壺峽連接部接部精子在受精前的準(zhǔn)備精子在受精前的準(zhǔn)備（精子獲能與頂體反應(yīng)）（精子獲能與頂體反應(yīng)） 精子在母畜生殖道內(nèi)存活時(shí)間精子在母畜生殖道內(nèi)存活時(shí)間和維持受精能力的時(shí)間和維持受精能力的時(shí)間動(dòng)物品種動(dòng)物品種牛牛豬豬羊羊馬馬維持存活時(shí)間維持存活時(shí)間1556h50h48h6d維持受精能力維持受精能力1820h812h1216h420h各種家畜精液的稀釋倍數(shù)和輸精劑量各種家畜精液的稀釋倍數(shù)和輸精劑量家畜種家畜種類類稀釋比稀釋比例例輸精計(jì)輸精計(jì)量（量（ml）有效精有效精子數(shù)子數(shù)（億）（億）豬豬1:1330501020牛牛1:104011.50.10.5馬馬1:132030