IVF實驗室的基本操作

1、IVF實驗室的實驗室的基本操作基本操作實驗室操作原則實驗室操作原則 防止防止 污染污染配子標本的配子標本的標記；標記；受精、胚胎受精、胚胎移植；移植； 兩人核對兩人核對毒性測試；毒性測試；培養(yǎng)液、耗材培養(yǎng)液、耗材的使用；的使用；實驗室的質(zhì)量實驗室的質(zhì)量控制和管理控制和管理無誤無誤無菌無菌無毒無毒輔助生殖技術(shù)基本操作輔助生殖技術(shù)基本操作配子、胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)配子、胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)1配子的收集和處理配子的收集和處理2體外受精技術(shù)體外受精技術(shù)3胚胎培養(yǎng)和移植胚胎培養(yǎng)和移植4胚胎冷凍和解凍胚胎冷凍和解凍5培養(yǎng)液的準備培養(yǎng)液的準備v培養(yǎng)液的基本組分培養(yǎng)液的基本組分 無機鹽離子無機鹽離子-維持維持pHpH和滲透壓

2、和滲透壓 碳水化合物碳水化合物-能量來源能量來源 蛋白質(zhì)來源蛋白質(zhì)來源 抗生素抗生素v礦物油礦物油 有利于維持培養(yǎng)液溫度、有利于維持培養(yǎng)液溫度、pHpH值和滲透壓穩(wěn)定值和滲透壓穩(wěn)定 防護屏障，減少污染防護屏障，減少污染 吸收脂溶性毒素吸收脂溶性毒素 防止液體蒸發(fā)防止液體蒸發(fā)培養(yǎng)液的準備培養(yǎng)液的準備 取卵前一日下午進行取卵前一日下午進行v原則：高效、方便、安全、經(jīng)濟原則：高效、方便、安全、經(jīng)濟 v四孔培養(yǎng)皿四孔培養(yǎng)皿卵卵v處理精液所需培養(yǎng)液處理精液所需培養(yǎng)液v微滴培養(yǎng)微滴培養(yǎng)受精卵、胚胎受精卵、胚胎v胚胎移植液胚胎移植液37 ， 5% 或或 6%CO2培箱內(nèi)培箱內(nèi) 平衡過夜平衡過夜卵母細胞的獲取

3、卵母細胞的獲取v注射注射hCGhCG后后36-3836-38小時取卵小時取卵v陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡道穿刺抽吸卵泡v核對姓名核對姓名v解剖顯微鏡下辨認卵冠丘解剖顯微鏡下辨認卵冠丘復(fù)合物復(fù)合物OCCCOCCCv37, 537, 56%CO6%CO2 2 培養(yǎng)培養(yǎng) v操作迅速，避光操作迅速，避光精液處理精液處理v正常精液：同正常精液：同IUIIUIv極度少精：增加離心力極度少精：增加離心力v死精癥：低滲腫脹實驗死精癥：低滲腫脹實驗v附睪穿刺精子：附睪穿刺精子：v睪丸穿刺或活檢精子：睪丸穿刺或活檢精子： 1ml1ml注射器針頭挑碎組織，離心懸液注射器針頭挑碎組織，

4、離心懸液v附睪、睪丸精子的冷凍附睪、睪丸精子的冷凍常規(guī)受精常規(guī)受精 取卵后取卵后4-8h 適應(yīng)癥：精液正常，適應(yīng)癥：精液正常， 輕度少、弱精癥輕度少、弱精癥受精率：受精率：6580（MII卵）卵）受精時間：長受精、短受精受精時間：長受精、短受精卵母細胞漿內(nèi)單精子顯微注射卵母細胞漿內(nèi)單精子顯微注射v適應(yīng)癥：嚴重少弱精、梗阻性無精、畸精癥、既適應(yīng)癥：嚴重少弱精、梗阻性無精、畸精癥、既往往IVFIVF常規(guī)受精失敗史、某些不明原因不孕等常規(guī)受精失敗史、某些不明原因不孕等v時間：取卵后時間：取卵后2 2小時小時v剝卵：利用透明質(zhì)酸酶（剝卵：利用透明質(zhì)酸酶（80mIU/ml)80mIU/ml)和機械法剝除

5、和機械法剝除顆粒細胞顆粒細胞卵母細胞漿內(nèi)單精子顯微注射v卵母細胞成熟度的評價卵母細胞成熟度的評價GVMIMII 卵母細胞漿內(nèi)單精子顯微注射卵母細胞漿內(nèi)單精子顯微注射v操作滴的準備：操作滴的準備：7 7PVP PVP v加精加精v裝針裝針v顯微注射顯微注射 v受精率：受精率：7070受精方式的選擇受精方式的選擇vICSIICSI的安全性？的安全性？ 逃避了自然選擇過程逃避了自然選擇過程 垂直傳遞遺傳缺陷垂直傳遞遺傳缺陷 操作過程對配子的損傷操作過程對配子的損傷v嚴格掌握嚴格掌握ICSIICSI適應(yīng)癥適應(yīng)癥非男性因素不孕非男性因素不孕ICSI治療結(jié)局治療結(jié)局非男性因素不孕癥，非男性因素不孕癥，IC

6、SI未顯現(xiàn)出優(yōu)勢未顯現(xiàn)出優(yōu)勢檢查受精檢查受精v時間：受精后時間：受精后15151818小時小時v機械法除去顆粒細胞及放射冠機械法除去顆粒細胞及放射冠v正常受精：兩個原核，兩個極體正常受精：兩個原核，兩個極體合子形態(tài)評價合子形態(tài)評價v原核的大小、位置及方向原核的大小、位置及方向v核仁前體的數(shù)目、大小、分布核仁前體的數(shù)目、大小、分布v胞漿的外觀胞漿的外觀v早期卵裂情況早期卵裂情況異常受精異常受精1PN1PNv發(fā)生率發(fā)生率 1 15 5 卵裂率卵裂率 74%74% 染色體二倍體率染色體二倍體率 5 5 囊胚形成率囊胚形成率 29% 29% (Noyes 2008)(Noyes 2008)v機制：機制

7、： 雌雄原核發(fā)育不同步雌雄原核發(fā)育不同步 雌雄原核融合雌雄原核融合 孤雌來源孤雌來源 ICSIICSI多見多見異常受精多異常受精多PNv發(fā)生率：發(fā)生率：IVF 5-8% IVF 5-8% ICSI 1% ICSI 1%v發(fā)生機制：發(fā)生機制： 2 2精子進入精子進入 第第2 2極體滯留極體滯留 雙倍體卵母細胞雙倍體卵母細胞未見原核未受精未見原核未受精v可能機制可能機制 卵母細胞未成熟卵母細胞未成熟 卵母細胞染色體異常卵母細胞染色體異常v卵裂率卵裂率 10%10% 染色體二倍體率染色體二倍體率 3%3% 優(yōu)胚率低優(yōu)胚率低 (12/38) (12/38) 囊胚形成囊胚形成 (0/12) (0/12)

8、 (Noyes 2008)(Noyes 2008) 受精失敗受精失敗v受精率受精率20% 20% 受精率低下受精率低下 所有成熟卵均未受精所有成熟卵均未受精 受精失敗受精失敗v常規(guī)受精周期常規(guī)受精周期 失敗率失敗率 1010 精子功能障礙精子功能障礙 卵母細胞成熟障礙卵母細胞成熟障礙 補打補打ICSI?ICSI?vICSIICSI周期周期 失敗率失敗率 2 23 3 嚴重精子畸形嚴重精子畸形 卵母細胞激活卵母細胞激活 鈣離子載體？機械激活？鈣離子載體？機械激活？ 胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)胚胎質(zhì)量評價胚胎質(zhì)量評價v胚胎評價標準胚胎評價標準 細胞數(shù)細胞數(shù) 碎片碎片: :無碎片無碎片 碎片碎片10% 50%

9、50% 卵裂球均勻程度卵裂球均勻程度 囊胚的評分體系囊胚的評分體系4AA4AA囊胚腔的大小囊胚腔的大小內(nèi)細胞團細胞分級內(nèi)細胞團細胞分級滋養(yǎng)層分級滋養(yǎng)層分級三位評分法三位評分法1:1:不到整個胚胎的一半不到整個胚胎的一半2 :2 :超過了胚胎體積的一半超過了胚胎體積的一半3 :3 :完全占據(jù)整個胚胎完全占據(jù)整個胚胎4:4:擴張囊胚擴張囊胚5:5:孵化囊胚孵化囊胚 6:6:孵化后囊胚孵化后囊胚A A包裹緊密，大量細胞包裹緊密，大量細胞B B結(jié)構(gòu)松散，少量細胞結(jié)構(gòu)松散，少量細胞C C極少量細胞極少量細胞A A許多細胞緊密結(jié)合許多細胞緊密結(jié)合B B少量細胞，結(jié)構(gòu)松散少量細胞，結(jié)構(gòu)松散C C極少量細胞極

10、少量細胞 2AA5AA 4BA4CC胚胎移植操作胚胎移植操作v選擇需要移植的胚胎選擇需要移植的胚胎, ,移入移植滴內(nèi)移入移植滴內(nèi) 3535歲以下，首次移植的病人移植歲以下，首次移植的病人移植2 2枚胚胎枚胚胎 3535歲以上，或非首次移植的病人移植歲以上，或非首次移植的病人移植3 3枚胚胎枚胚胎v確認核對患者姓名確認核對患者姓名vD3 or D5 D3 or D5 移植？移植？移植液移植液移植液移植液移植液和胚胎移植液和胚胎氣氣 20l氣氣胚胎移植操作胚胎移植操作胚胎冷凍胚胎冷凍v意義：提高累計妊娠率，避免多胎，減少卵巢過度意義：提高累計妊娠率，避免多胎，減少卵巢過度刺激風(fēng)險刺激風(fēng)險v溫度的急

11、劇變化形成冰晶溫度的急劇變化形成冰晶 機械性損傷機械性損傷 溶質(zhì)性損傷溶質(zhì)性損傷 滲透壓損傷滲透壓損傷 核心：避免冰晶形成核心：避免冰晶形成v冷凍方法：慢凍速融法冷凍方法：慢凍速融法 玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法v冷凍保護劑冷凍保護劑 滲透性保護劑：滲透性保護劑：EG PRON EG PRON 甘油甘油 非滲透性保護劑：蔗糖非滲透性保護劑：蔗糖 大分子物質(zhì)大分子物質(zhì)胚胎的冷凍胚胎的冷凍: :慢速冷凍慢速冷凍室溫室溫 15min室溫室溫 5min室溫室溫15minPBS1.5M丙二醇丙二醇1.5M丙二醇丙二醇0.1M蔗糖蔗糖慢凍速融法慢凍速融法v冷凍程序冷凍程序 2 2007 3/min7 3/mi

12、n -7 -7 人工植冰人工植冰 -7-730 0.3/min30 0.3/min -30 -30120 30/min120 30/min胚胎復(fù)蘇胚胎復(fù)蘇12340.5M丙二醇丙二醇0.2M蔗糖蔗糖 5min0.2M蔗糖蔗糖 5minPBS 5min1.0M丙二醇丙二醇 0.2M蔗糖蔗糖 5min 預(yù)防冰晶的再形成預(yù)防冰晶的再形成 復(fù)蘇程序：復(fù)蘇程序： 室溫室溫 40s 30水浴水浴 1min胚胎凍融損傷胚胎凍融損傷v復(fù)蘇胚胎評價：復(fù)蘇胚胎評價：50%50%卵裂球完整卵裂球完整 存活存活 復(fù)蘇率復(fù)蘇率90%90%v無損傷胚胎著床率高無損傷胚胎著床率高 部分損傷胚胎著床能力下降部分損傷胚胎著床能力下降玻璃化冷凍玻璃化冷凍v原理原理v條件：高濃度冷凍保護劑條件：高濃度冷凍保護劑 極快的降溫速度極快的降溫速度v載體：開放式載體：開放式 密閉式密閉式v適應(yīng)癥：卵母細胞適應(yīng)癥：卵母細胞 囊