黃酮類成分分析

1、黃酮類成分分析一、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)一、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)n結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征 基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）n理化性質(zhì)理化性質(zhì)物理性狀物理性狀結(jié)晶性固體或無定形粉末。大多數(shù)呈黃色，其顏色的有無與交叉共軛體系有關(guān)。如：黃酮、黃酮醇及其苷類多呈黃色；二氫黃酮、二氫黃酮醇及黃烷醇呈無色；異黃酮呈無色或微黃色。溶解性溶解性游離苷元易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶及稀堿水黃酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑OO酸堿性酸堿性酸性：與酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān) 7,4- 二羥基 7或4- 羥基 一般酚羥基 5-羥基堿性：r-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子，可表現(xiàn)出微弱堿性顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 還原

2、反應(yīng)（鹽酸鎂粉反應(yīng)） 與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽） 硼酸顯色反應(yīng)堿性試劑反應(yīng) 五氯化銻反應(yīng) Gibbs反應(yīng)和Emerson反應(yīng)光譜特征光譜特征 I帶(300-400nm) B環(huán)桂皮?；?II帶(240-285nm) A環(huán)苯甲?；?n色譜法色譜法 1.薄層色譜法薄層色譜法硅膠-分離鑒別弱極性黃酮類化合物遵循正相色譜原理，化合物極性越大，所選擇的展開劑極性也相應(yīng)增大，同時(shí)根據(jù)化合物酸性強(qiáng)弱調(diào)節(jié)展開劑的酸堿性。常用展開劑有苯-甲醇等。聚酰胺-分離檢識(shí)含游離酚羥基的黃酮及其苷利用氫鍵吸附原理，由于聚酰胺和黃酮類化合物上酚羥基形成氫鍵締合，所以作用力較強(qiáng)，需要極性強(qiáng)的展開劑，而在展開劑中

3、大多含有醇、酸或水，或兼有兩者。所以，分離檢識(shí)游離黃酮常用有機(jī)溶劑作為展開劑，如氯仿- 甲醇等；而分離檢識(shí)黃酮苷常用含水有機(jī)溶劑作為展開劑，如甲醇- 水等。纖維素-分離黃酮類多糖苷混合物展開系統(tǒng)：正丁醇-乙酸-水，5%40%乙酸 展開好的色譜，常在紫外燈（365nm）下觀察熒光斑點(diǎn)及其顏色；亦可噴三氯化鋁試劑，在日光燈或紫外燈下觀察熒光是否加強(qiáng)；也可氨熏，是否出現(xiàn)黃色、棕色熒光斑點(diǎn)等。 2.紙色譜法紙色譜法 適用于分離各種類型的黃酮化合物，包括游離黃酮和黃酮苷類。 混合物的檢識(shí)常采用雙向色譜法，第一向采用醇性展開劑如正丁醇-乙酸-水（4:1:5上層，BAW）等，此為正相分配色譜，極性小的化合物

4、比極性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展開劑，如水、 2%6%乙酸等，其色譜行為類似于反向色譜，極性大的化合物比極性小的化合物Rf值大。 游離黃酮類化合物的檢識(shí)，一般宜用醇性展開劑；花色素及花色苷的檢識(shí)可用含鹽酸或乙酸的水溶液作展開劑。 多數(shù)黃酮類化合物在紙色譜上用紫外燈檢查時(shí)，可以看到有色點(diǎn)，以氨蒸氣處理后常產(chǎn)生明顯的顏色變化。此外，還可以噴以2%AlCl3甲醇溶液（在紫外燈下檢查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液等顯色劑。三、含量測(cè)定三、含量測(cè)定 中藥制劑中含有黃酮類成分，可按要求測(cè)定總黃酮含量、黃酮類單體含量或兩者均須測(cè)定。含量測(cè)定方法主要有分光光度法、薄層色譜

5、法、高效液相色譜法等。（一）、總黃酮含量測(cè)定一）、總黃酮含量測(cè)定 1.分光光度法一般用于總酮類成分的含量測(cè)定。大多數(shù)黃酮類化合物在甲醇溶液中的紫外吸收光譜由兩個(gè)主要吸收帶組成。 帶出現(xiàn)在300400nm之間的吸收帶 帶出現(xiàn)在240285nm之間的吸收帶 含黃酮類化合物的原料藥及部分制劑經(jīng)必要的提取純化后，可直接于最大吸收波長(zhǎng)附近測(cè)定總黃酮的吸光度，對(duì)照品的選定應(yīng)以最大吸收波長(zhǎng)與總黃酮的相近為原則，單體黃酮和總黃酮均可作為對(duì)照品，常以蘆丁等對(duì)照品計(jì)算總黃酮的含量。中國(guó)藥典2015版中淫羊藿總黃酮的含量測(cè)定（書P156頁(yè)）2 .鋁鹽配位比色法鋁鹽配位比色法 本法采用分光光度法測(cè)定中藥中黃酮類成分，

6、若供試液中其他組分的吸收存在干擾，可進(jìn)行比色測(cè)定。該法利用黃酮類成分與鋁鹽發(fā)生配位反應(yīng)，生成的配合物與背景最大吸收波長(zhǎng)差別較大，可消除背景（即陰性空白）的干擾，顯著提高含量測(cè)定的選擇性。（1）硝酸鈉）硝酸鈉-硝酸鋁硝酸鋁-氫氧化鈉比色法氫氧化鈉比色法 將中藥通過適當(dāng)方法制成供試液 加5%亞硝酸鈉反應(yīng)6min 10%硝酸鋁反應(yīng)6min 4%氫氧化鈉反應(yīng)15min 生成紅色配合物后在500nm測(cè)定，常用蘆丁作為對(duì)照品。 （：該法是基于鄰二酚羥基的反應(yīng)，并非黃酮類化合物的專屬反應(yīng)。）垂盆子顆粒中總黃酮含量測(cè)定鋁鹽配位比色法（見書156頁(yè)）（2）三氯化鋁）三氯化鋁醋酸鉀比色法醋酸鉀比色法 常用蘆丁為對(duì)

7、照品，采用三氯化鋁醋酸鉀為顯色劑，顯色后在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定黃酮類成分含量。 (p S:黃酮類化合物與三氯化鋁醋酸鉀反應(yīng)后最大吸收波長(zhǎng)并不一定都 在420nm處，因此，最好用所含黃酮作對(duì)照品） 消咳喘糖漿中總黃酮含量測(cè)定-鋁鹽配位比色法 見書p157頁(yè) （二）、單體黃酮含量測(cè)定（二）、單體黃酮含量測(cè)定n薄層掃描法樣品經(jīng)適宜的溶劑提取得到供試液，經(jīng)硅膠、聚酰胺或纖維素薄層 色譜有效分離后，用薄層掃描儀直接進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)黃酮類單體 既可以進(jìn)行紫外-可見光掃描，又可以進(jìn)行熒光掃描。n高效液相色譜法正相色譜(多用于沒有羥基或乙?；S酮類成分化合物） 固定相為硅膠，流動(dòng)相可套用薄層色譜條件，但極性要

8、相對(duì)小一點(diǎn)。反相色譜（C18或C8） 固定相多為十八烷基硅烷鍵合相 流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸（磷酸緩沖液），乙腈-水n檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器銀杏葉提取物銀杏葉提取物總黃酮醇苷總黃酮醇苷含量含量測(cè)定測(cè)定 含量測(cè)定含量測(cè)定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，山柰素酚峰與異鼠李素峰的分離度應(yīng)大于1.5。 對(duì)照品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備（略） 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約相當(dāng)于總黃酮醇苷1

9、9.2mg的粉末，精密稱定，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，置100ml錐形瓶中，加甲醇10ml、25%鹽酸溶液5ml，搖勻，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45m）濾過，取濾液，即得。 測(cè)定法測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮苷的含量。 總黃酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量）2.51 中藥名稱中藥名稱主要黃酮類成分

10、主要黃酮類成分黃芩黃芩苷， 黃芩素，漢黃芩苷，漢黃芩素，千層紙素槐米蘆丁，槲皮素葛根葛根素，大豆苷陳皮橙皮苷，川陳皮素，新橙皮苷，橘皮素枳實(shí)橙皮苷，川陳皮素，新橙皮苷，5-鄰-去甲基川陳皮素山楂槲皮素，金絲桃苷淫羊藿淫羊藿苷，淫羊藿次苷，槲皮素射干次野鳶尾黃素，野鳶尾苷補(bǔ)骨脂補(bǔ)骨脂查爾酮，異補(bǔ)骨脂查爾酮+常見的黃酮類成分分析 p158p159中藥名稱:葛根成分: 葛根素定性鑒別方法：取本品粉末0.8g，加甲醇10ml，放置2小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取葛根對(duì)照藥材0.8g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取葛根素對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)

11、照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光條斑。理化特征：溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，三氯甲烷或乙醚中不溶。Mp:187（分解）UV:254nm常用分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法n中藥名稱：槐花n 成分：蘆丁n定性鑒別方法：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，密塞，振搖10分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取蘆丁對(duì)照品，加甲醇制成每1ml

12、含4mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。n理化性質(zhì)：易溶于堿水；可溶于熱水、甲醇、乙醇、吡啶；微溶于丙酮、乙酸乙酯；難溶于冷水、苯、乙醚、三氯甲烷。Mp:177178 ;UV:259,266,299,359nmn常見分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法n中藥名稱：黃芩n成分：黃芩苷n定性鑒別方法：取本品粉末1g，加乙酸乙

13、酯-甲醇（3：1）的混合溶液30ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，取上清液作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、漢黃芩素對(duì)照品，加甲醇分別制成每1ml含1mg、0.5mg、0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各2l及上述三種對(duì)照品溶液各1l，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）為展開劑，預(yù)飽和30分鐘，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色

14、的斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯三個(gè)相同的暗色斑點(diǎn)。 n理化性質(zhì)：易溶于二甲基甲酰胺、吡啶，微溶于熱冰乙酸、碳酸氫鈉和氫氧化鈉等溶液，難溶于甲醇、乙醇、丙酮，幾乎不溶于水、乙醚、苯、三氯甲烷。Mp:233 UV:242,272,310nmn常見分析方法：HPLC,TLCSn中藥名稱：淫羊藿 n成分：淫羊藿苷n定性鑒別方法：取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，溫浸30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，作為供試品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和含量測(cè)定淫羊藿苷項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各10l，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1

15、）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗紅色斑點(diǎn)；噴以三氯化鋁試液，再置紫外光燈（365nm）下檢視，顯相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)。 n理化性質(zhì)：溶于乙醇、乙酸乙酯，不溶于醚、苯、三氯甲烷。Mp:231232 UV:272nmn常見分析方法：HPLC;TLCSn中藥名稱：陳皮n成分：橙皮苷n定性鑒別方法：取本品粉末0.3g，加甲醇10ml，加熱回流20分鐘，濾過，取濾液5ml，濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2l，分別點(diǎn)于同

16、一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100：17：13）為展開劑，展至約3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20：10：1：1）的上層溶液為展開劑，展至約8cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 n理化性質(zhì)：在60溶于二甲基酰胺及甲酰胺。略微溶于甲醇及熱冰醋酸，幾乎不溶于水，丙酮、苯及三氯甲烷。而易溶于稀堿及吡啶。Mp:258262 UV:284nmn常見分析方法：HPLC;TLCSn中藥名稱：銀杏葉 n成分：槲皮素n定性鑒別方法：取本品粉末1g，加50%

17、丙酮溶液40ml，加熱回流3小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇5ml使溶解，加入已處理好的聚酰胺柱（3060目，1g，內(nèi)徑為1cm，用水濕法裝柱）上，用5%乙醇40ml洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸去乙醇，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)颖?ml使溶解，作為供試品溶液。另取銀杏內(nèi)酯A對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品、銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品及白果內(nèi)酯對(duì)照品，加丙酮制成每1ml各含銀杏內(nèi)酯A0.5mg、銀杏內(nèi)酯B0.5mg、銀杏內(nèi)酯C0.5mg、白果內(nèi)酯1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

18、照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各51，分別點(diǎn)于同一用4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10：5：5：0.6）為展開劑，在15以下展開，取出，晾干，在醋酐蒸氣中熏15分鐘，在140160中加熱30分鐘，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 n理化性質(zhì)：略溶于無水乙醇，易溶于沸乙醇，溶于冰醋酸、堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水。Mp：314（分解）n常見分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法黃酮類化合物的生理活性生理活性及在人體內(nèi)的作用生理活性及在人體內(nèi)的作用 代表化合物代表化合物抗菌消炎作用抗菌消炎作用如黃芩苷如黃芩苷 黃芩素黃芩素 木犀草素等木犀草素等擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加血流擴(kuò)張冠狀動(dòng)