肝癌H22石蠟切片的制作

1、石蠟切片法（一） -取材、固定、洗滌、脫水一、 實驗原理 材料的選擇是制作切片的第一步，用于制片的動物、植物材料應選擇新鮮的，用陳腐的材料制片，往往不能反映材料的真實情況。 固定就是將新鮮材料投入某類化學藥液中，借助化學藥品的作用使細胞組織的形態(tài)保存下來不使其改變形態(tài)和變質的過程。 材料經(jīng)過固定液作用以后，內部滲入很多固定液，一定要把滲入里面的固定液洗去，否則留在材料中的固定液有的會妨礙染色，有的會發(fā)生沉淀或結晶，影響觀察，有的繼續(xù)作用，使材料變壞等。所以材料中的固定液必須徹底洗凈。 材料經(jīng)過洗滌后含有大量水分，必須用脫水劑脫盡里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存，因為水在里面能使材料分解

2、，而且透明劑與水是不相混合的，只有在完全無水的情況下，透明劑才能完全透入。二、 實驗用品（一） 器材 解剖刀，解剖針，解剖剪，鑷子，解剖盤，培養(yǎng)皿，吸管。（二） 試劑 福爾馬林-酒精-醋酸混合固定液（簡稱FAA），10中性福爾馬林，秦克（Zenker）氏液，卡諾（Carnoy）氏液，各級酒精（30、50、70、80、90、95、100）。（三） 材料 一般動物組織。三、 實驗程序（一） 取材1. 取材的方法 取材應根據(jù)需要，用鋒利的刀片從所需部位上切取一小塊放在固定液中固定。動物組織的切片，厚度不超過3mm，體積不大于1.5×1.5×0.5cm。材料的選擇和切取部位也很重要

3、。2. 取材的注意事項（1） 取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發(fā)生變化。（2） 切取材料應根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。（3） 切取病理材料時，應特別注意不能將有病的組織損傷，為了和正常無病組織相區(qū)別，在取材時除了切取病理材料外，正常的組織也須切取一部分，以便作比較觀察。（二） 固定1. 固定的方法取到新鮮材料，應按材料的種類、大小、性質和制作要求，立即將材料投入固定液加以固定，使其形態(tài)結構和成分被化學試劑固定下來，與生活時保持相仿。小鼠肝癌組織固定于10甲醛固定液中。固定的時間，視材料的種類、大小、性質、固定液的種類與性質、滲透力的強弱等而

4、定，可以從12h到十幾小時或二十幾小時，甚至可以長至幾天。一些小的材料，僅須幾十分鐘。如：兔肝固定于Zenker氏液或Carnoy氏液里，固定時間為1224h。2. 固定的注意事項（1） 一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。（2） 有些混合固定液的成分之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合。如果混合太早，固定時就沒有作用了。（3） 固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有些水分多的材料，中間應更換12次新液。（4） 材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外貼上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應的標

5、簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。（三） 洗滌材料自固定液中取出后，須立即洗滌，所用的沖洗液應依固定液的性質而定。1. 固定液為酒精或酒精混合液，一般不沖洗。若需洗滌則必須用與固定的酒精相近濃度的酒精沖洗。2. 用含有苦味酸的固定液的材料（苦味酸與福爾馬林混合的固定液除外），需要用70的酒精反復浸洗。3. 含有鉻酸、重鉻酸接的，必須用流水沖洗。沖洗時間應與固定時間相同或更長。4. 用福爾馬林固定的，一般可以不沖洗，但長期固定于福爾馬林的材料應充分水洗。5. 含四氧化餓的固定液用水沖洗。6. 固定液含有氯化汞的，應根據(jù)溶劑的性質用水

6、或酒精沖洗。一般的洗滌方法，將材料放入指管或廣口瓶，并加半管水，用紗布將管口扎住，然后倒置于水槽內，這樣可以使指管半沉半浮于水中。打開水龍頭，讓材料按沖洗的時間在流水中沖洗。注意水流不能太急，以免沖壞材料。流水沖洗的時間可根據(jù)材料和固定液的情況而定，一般需要1224h。（四） 脫水1. 脫水的方法 脫水一般多使用酒精，為了不使材料急劇收縮，應用不同濃度的酒精，自低濃度到高濃度逐級脫水。一般的材料可以從30的濃度開始，經(jīng)50、70、80、90、95直至純酒精。在用純酒精時，需要換2次（使徹底脫水）。對于一些薄嫰、柔弱的材料，可依次經(jīng)10、20、30每級相差10直至純酒精。 在每級酒精中停留的時間

7、，依照材料的大小、性質以及留在固定液中的時間長短和固定液溶解性而定。一般動物組織如小白鼠的腎臟24mm厚，每級停12h。2. 脫水注意事項（1） 脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行，防止吸收空氣中的水分。（2） 在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水紙吸盡器皿內剩余液，然后于器皿中加入高一級脫水劑。（3） 在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，負責易使組織變軟，助長材料的解體。（4） 在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。（5） 如需過夜，應停留在70酒精中。（6） 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現(xiàn)白色渾

8、濁現(xiàn)象。 石蠟切片法（二） -透明、透蠟、包埋一、 實驗原理 材料在脫水以后，所用的大多數(shù)脫水劑（酒精、丙酮等）不能和石蠟相混合，而透明劑即可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合，因而可通過透明劑的作用把脫水劑替換出來，使石蠟能順利地進入材料中。當材料中全部為透明劑占有時，材料可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)。 蠟是將材料中的透明劑逐步清除，以致完全由石蠟充分滲透。 包埋就是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟，一起倒入一定形狀的容器（如紙盒）內，并立即投入冷水中，使它立即凝固成含材料的蠟塊，以備切片。二、 實驗用品（一）器材 恒溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，紙盒，酒精燈，鑷子，解剖針，面盆。（二）試劑無水酒精，二

9、甲苯，石蠟。（三）材料已脫水的動物材料。三、 實驗程序（一） 透明1. 透明的方法 透明過程也是漸次由低濃度到高濃度。脫水的材料一般先在純酒精和透明劑各半的混合液中浸漬12h，然后再轉入純透明劑中透明。透明浸漬的時間可視材料情況而定，一般30min到2h。在純二甲苯中應更換二次，總的停留時間以不超過3h為宜。2. 透明注意事項（1） 使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。（2） 更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。（3） 在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。（二） 透蠟1.

10、透蠟的方法 石蠟透入動物組織的方法是：材料自透明劑中取出后先移入透明劑和石蠟等量的混合液（蠟杯）約1530min，然后進入純石蠟中（蠟杯），換新鮮石蠟（蠟杯）一次?？偟氖炌溉霑r間約11.5h；如組織塊?。s2mm×3mm×3mm），通過3個杯子的時間合計30min已足夠；組織塊大約（3mm×3mm×10mm）的，不僅每次轉換的時間要延長，還需要多加一只杯子，共需2h左右。2. 透蠟注意事項（1） 盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；（2） 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；（3） 操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變

11、脆、收縮等。（三） 包埋1. 包埋的工具（1） 溫臺：為了避免在包埋時石蠟立即凝固，包埋要在溫臺中進行。（2） 酒精燈：放在溫臺下加溫用。（3） 恒溫箱：透蠟和包埋都要在恒溫箱中進行。（4） 紙盒：作為包埋用的容器。（5） 鑷子：要放在恒溫箱中預熱，否則當移取材料時，鑷子尖端的石蠟容易凝固。（6） 面盆或水槽：內放入冷水作冷卻石蠟之用。2. 包埋的操作過程包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從恒溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用溫鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側的把手提起，慢慢地平

12、放在面盆或水槽中的水面上，待紙盒內石蠟的表面凝固，即可將紙盒向一側傾斜，使冷水從一邊浸入紙盒，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。 石蠟切片法（三） -切片、貼片一、 實驗原理切片就是把包埋好的材料塊用切片機切成所需要的厚度的切片帶。貼片是用粘貼劑把切片平鋪貼在載玻片上，以便于染色。二、 實驗用品（一） 器材切片機，切片刀，磨刀機或磨刀石，單面刀片，展片臺，酒精燈，溫度計，蠟鏟，臺木，毛筆，蠟帶盤，載玻片，鑷子。（二） 試劑粘片劑，氯仿。（三） 材料以包埋好的蠟塊。三、 實驗程序（一） 切片1. 切片前的準備工作包埋好的石蠟塊裝在切片機上進行

13、切片前還須做以下的準備工作。（1） 石蠟快的固著：石蠟塊要進行切片前，要先把它固著在臺木上，然后裝在切片機的夾持部分進行切片。石蠟塊的固著方法如下：先將蠟塊用單面刀片切成方形或長方形，然后四周留下23mm寬的石蠟。點燃酒精燈，然后用考熱的蠟鏟放在臺木和蠟塊之間，利用蠟鏟的溫度熔化兩者的蠟，抽出蠟鏟，在蠟塊上略加壓力，蠟塊就粘附在臺木上。（2） 整修：石蠟塊固著后稍放片刻，讓它完全凝固后就可以進行修快。修快就是用單面刀片將蠟塊四周修整平行。如果上下兩面不平行的話，則切出的蠟帶會彎曲。其次，如果組織的上下、左右的蠟留得太多，那么每一切片所占的位置大，在一張載玻片上只能貼幾個切片，既不經(jīng)濟，鏡檢時也

14、不方便。（3） 磨刀：切片刀鋒利與否對切片的質量有很大的關系，若切片刀遲鈍或有了缺口以后將會引起切片的斷裂、破碎、不完整或厚度不勻及皺折等現(xiàn)象。所以切片前一定要先把刀磨好。切片刀的刃磨一般有兩種：一種是機磨，另一種為手工磨。2. 切片機切片機的式樣很多，性能也不一樣，多數(shù)切片機除進行石蠟切片外，還可安裝冷凍裝置進行冷凍切片。一般常用的切片機為輪轉式切片機。3. 切片的方法現(xiàn)將輪轉式切片機切片的方法簡述如下：（1） 將以固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。（2） 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。（3） 搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。（4） 調整石蠟塊與刀口之間的角度與

15、位置，刀片與石蠟切片約成15°左右。（5） 調整厚度調節(jié)器到所需的切片厚度，一般410µm。（6） 一切調整好后就可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以4050r/min為宜。（7） 切成的蠟帶到2030cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。（8） 用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻片上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。（9） 切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。（二） 貼片1

16、. 取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻璃中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。2. 滴12滴的蒸餾水于已涂粘片劑的載玻片上。3. 用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。4. 把玻片置于預先加熱的展片臺上（溫度保持在4045）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。5. 展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37的溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。 石蠟切片法（四） -染色、封藏染色是生物制片中最重要的環(huán)節(jié)之一，只有通過染色，細胞和組織才顯得更清楚，微小的細胞結構才得以分辨。一、 實驗原理1. 染色

17、的一般原理細胞和組織的不同結構之所以能被染成各種不同顏色，是由于染料對它們所起的物理或化學的綜合作用。（1）物理作用 滲透作用：染料滲透到多孔的組織中，與組織沒有牢固的結合。 吸收作用：組織吸收染料中的色素粒子，與之牢固結合，組織著色與燃料的顏色相同，不一定與干燥燃料的顏色相同，如品紅在干燥狀態(tài)時為綠色，而其溶液呈紅色。組織在染色后也呈紅色，即使組織干燥后，其紅顏色仍不變。 吸附作用：染液中分散的色素粒子進入被染物質的粒子間隙內，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。也由于各種蛋白質或膠體有不同的吸附面，因此可以吸附不同的離子。也就是說對離子的吸附有選擇性，即有的容易被某些物質吸附，有的則

18、不容易吸附。（2）化學作用：生物細胞內含有酸性和堿性物質，分別可與燃料中的陽離子和陰離子互相結合，這種反應使組織細胞染上顏色。例如,細胞核含酸性物質，易與堿性染料蘇木精結合，細胞核被染上顏色。細胞質含堿性物質，易與酸性染料伊紅中有染色作用的陰離子結合，細胞質為伊紅所染。但是，嗜堿性和嗜酸性只是相對的，若標本在堿性染料液內留置過久，細胞質也可著上堿性燃料的顏色。 上述這兩個主要的染色理論，若單獨用一種學說來解釋所有的染色現(xiàn)象都是有困難的。染色的機制是很復雜的，目前了解得不很清楚。目前比較明確地認為，染色主要是由于物理作用與化學作用綜合發(fā)生作用的結果。2. 封藏的原理封藏是使已經(jīng)透明的材料，保存在

19、適合折光率的封藏劑中（如封藏劑加拿大樹膠的折光率為1.52，它與玻璃的折光率1.51很接近），使材料能在顯微鏡下清晰的顯示出來，并能長期保存。脂肪和類脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）統(tǒng)稱為脂類。它是構成人體組織的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶劑中。在化學組成上，脂類屬于脂肪酸的酯或與這些酯有關的物質。脂類的主要功能是氧化供能。脂肪主要存積于脂肪組織中，并以油滴狀的微粒存在脂肪細胞漿內。在病理檢驗中，脂類染色法最常用以證明脂肪變性，脂肪栓子以及腫瘤的鑒別。脂類染色使用最廣泛的染料是蘇丹染料，最常用的有蘇丹，蘇丹，蘇丹黑及油紅O 等。脂肪被染色，實際上是蘇丹染料被脂肪溶解吸附而呈現(xiàn)染料的顏色。經(jīng)研究認為組織中脂質在液態(tài)或半液態(tài)時，對蘇丹染料著色效果最好。根據(jù)這一原理，適當提高溫度（37-60）對組織切片染色效果是有好處的。脂類染色，用冰凍或石蠟切片，以水溶性封固劑封固，如甘油明膠和阿拉伯糖膠等。二、 實驗用品（一） 器材染色缸，酒精燈，樹膠瓶，鑷子，蓋玻片，顯微鏡。（二） 試劑 70酒精。染色液0.5蘇木精，蘇丹，甘油明膠，蒸餾水。（三） 材料已切好的石蠟切片。三、 實驗程序蘇丹(