蜂巢形棉布載體固定化米根霉產(chǎn)果膠酶的

1、蜂巢形棉布載體固定化米根霉產(chǎn)果膠酶的半連續(xù)化發(fā)酵研究摘 要天然纖維素（如橘皮、煙梗）是一種可再生生物質(zhì)資源，但由于纖維素、半纖維、木質(zhì)素和果膠等交織在一起形成緊密復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，造成微生物利用天然纖維素生產(chǎn)乳酸、乙醇等的困難。米根霉在一定培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生降解果膠質(zhì)的酶系。果膠酶被廣泛用于食品、紡織、生物技術(shù)等領(lǐng)域，其市場(chǎng)需求量日益增長(zhǎng)。本文采用一種研究較少但有產(chǎn)果膠酶能力且富有商業(yè)價(jià)值的安全菌種米根霉，結(jié)合棉布載體固定化細(xì)胞的技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)果膠酶。采用DNS法測(cè)定果膠酶（PEC）酶活力和用粘度法測(cè)定聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶（Endo-PG）酶活力。首先從純果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶出發(fā)，考察了固定化發(fā)酵與游離發(fā)酵

2、差別，優(yōu)化了純果膠培養(yǎng)基，優(yōu)化了培養(yǎng)條件并進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)，研究了發(fā)酵液部分果膠酶酶學(xué)性質(zhì)；然后優(yōu)化煙梗浸液培養(yǎng)基，優(yōu)化了培養(yǎng)條件并進(jìn)行半連續(xù)試驗(yàn)，還研究了發(fā)酵液中纖維素酶活力變化情況。首先，對(duì)純果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究。在優(yōu)化前培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，固定化和游離發(fā)酵相比，固定化發(fā)酵48h就達(dá)到最大產(chǎn)酶量，縮短發(fā)酵時(shí)間24h，提高產(chǎn)酶量115%。采用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基，結(jié)果表明影響產(chǎn)果膠酶的因素依次為：果膠>Tween80>Zn2+>硫酸銨。發(fā)酵培養(yǎng)基為：果膠2.5%，硫酸銨1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.15% ，K2HPO4 0.4

3、%，KH2PO4 0.4%；在此基礎(chǔ)上采用單因素法優(yōu)化培養(yǎng)條件，結(jié)果為：果膠2.5%，硫酸銨1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.15% ，K2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.4%，轉(zhuǎn)速190r/min、裝液量50ml/250ml、發(fā)酵溫度30ºC、發(fā)酵初始pH 5.0、初始孢子濃度0.75×106個(gè)/mL，培24h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力分別為973.47U/mL和165.08U/mL。通過(guò)對(duì)粗酶液作用pH和溫度的研究，得到PEC和Endo-PG為酸性果膠酶，最適pH為4.5，PEC和Endo-PG最適溫度分別為45 º

4、C和55 ºC。半連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，在第5批次出現(xiàn)最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分別為1253.95U/mL和181.94U/mL，分別比首次提高29.8%和18.3%。然后，對(duì)煙梗浸液發(fā)酵產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究。采用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基，結(jié)果表明影響產(chǎn)果膠酶的因素依次為：煙梗>硫酸銨>Zn2+>Tween80。發(fā)酵培養(yǎng)基為：煙梗10%，硫酸銨1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween80 0.05%，K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%。在此基礎(chǔ)上采用單因素法優(yōu)化培養(yǎng)條件，結(jié)果為：煙梗10%，硫酸銨1.5%，ZnSO40.6 m

5、mol/L，Tween80 0.05%，K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，發(fā)酵初始pH 5.0，初始孢子濃度0.5×106，30ºC，裝液量50mL，轉(zhuǎn)速170r/min，培養(yǎng)48h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分別為361.27U/mL和49.22U/mL。煙梗浸液發(fā)酵96h，出現(xiàn)纖維素酶活力高峰，濾紙酶活力和羧甲基纖維素鈉酶活力分別為33.25U/mL和83.13U/mL。半連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，在第2批次出現(xiàn)最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分別為430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高約22.8%。關(guān)鍵詞：米根

6、霉，果膠酶，聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶，固定化，半連續(xù)化發(fā)酵ABSTRCTNatural cellulose is one of the renewable resources, such as orange peel and tobacco stem, which are made of cellulose, half fiber, lignin and pectin. The intertwined combination among them leads to form a tight and complex structure, which is hard for microorganisms

7、 to digest. Hence, the production of lactic acid or ethanol through using natural cellulose by microorganisms is faced with problems. Rhizopus oryzae has the ability to produce pectinolytic enzymes to degrade pectin.The remove of pectin can make separation of fiber, fiber and lignin easier. There is

8、 a growing market demand of pectinolytic enzymes for the fact that pectinolytic enzymes are widely used in the filed of food, textile, pharmaceutical, paper making, biological technology and so on. Rhizopus oryzae, which owns the ability to degrade pectin and is rich in comercial value, is used to p

9、roduce pectinolytic enzymes in this research. The immobilized Rhizopus oryzae with matrix composed of asterisk-configuration fibrous matrices in a honeycomb-shaped, the production of pectinolytic enzymes were carried out from citrus pectin and tobacco stem pectin. Pectinolytic enzymes (PEC) activity

10、 was determined by DNS assay and endopolygalacturonase (Endo-PG) activity was measured by viscosity method. Fistly, the pure pectin was selected as the sbustrate for fermentation. Then, the coparison of enzymes production between immobilized cells and free cells was made. After that, optimization of

11、 culture medium and growth conditions was investigated through single factor variable analysis and so on. Also, some properties of the enzyme were under reasearch. Finally, optimization of culture medium made from tobacco stem was investigated through single factor variable analysis and orthogonal e

12、xperiment. Optimization of growth conditions was investigated through single factor variable analysis. Six batches of semi-continuous fermentation were carried out in shake flasks.First of all, the study of pure pectin was carried out. Immobilized cells had a higher production of PEC over free cells

13、. Immobilized cells had a max production in 48 hours, which saved 24 hours compared with free cells and improved production by 115%. Results of single factor and orthogonal experimental with immobilized showed the order of factors influencing the production of pectinase was: pectin> Tween80> Z

14、nSO4>(NH4)2SO4.The suitable culture media was composed of pectin2.5%, (NH4)2SO4 1.5%, ZnSO40.6 mmol/L ,Tween80 0.15%, K2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.4%，rotation speed 190 r/min, liquid volume 50 ml/250 ml, temperature 30ºC, initial pH 5.0, initial spore concentration 0.75×106 /mL. After 24 hours,

15、 the PEC activity and Endo-PG activity were 973.47U/mL and 165.08U/mL separately. Effects of pH and temperature on crude enzymes fluid were carried out.PEC and Endo-PG might be acidic pectinolytic enzymes. The optimum pH was 4.5 for PEC and Endo-PG, optimum temperature was 45°Cand 55°C res

16、pectively. The highest PEC activity and Endo-PG activity were 1253.95U/mL and 181.94U/mL in the 5th batch, about 29.8% and 18.3% higher than the 1st batch. Secondly, optimization of culture medium made from tobacco stem was investigated through single factor variable analysis and orthogonal experime

17、nt. Results showed the order of factors influencing the production of pectinase was: tobacco stem> (NH4)2SO4>ZnSO4>Tween80. The suitable culture media was composed of tobacco stem 10%, (NH4)2SO4 1.5%, ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.05%, K2HPO4 0.2%，KH2PO4 0.2%，rotation speed 170 r/min, liquid vo

18、lume 50 ml/250 ml, temperature 30ºC, initial pH 5.0, initial spore concentration 0.50×106 /mL. After 48 hours, the PEC activity and Endo-PG activity were 361.27U/mL and 49.22U/mL separately. After 96 hours, cellulose enzyme activity reached a peak with filter paper activity of 33.25U/mL an

19、d sodium carboxymethyl cellulose activity of 83.13U/mL.The highest PEC activity and Endo-PG activity were 430.83U/mL and 51.73U/mL in the 2nd batch. PEC activity was about 22.8% higher than the 1st batch.Keywords: Rhizopus oryzae, pectinolytic enzymes, endopolygalacturonase, immobilization, semi-con

20、tinuous fermentation目 錄摘 要IABSTRCTII1緒論11.1問(wèn)題的提出及研究意義11.1.1問(wèn)題的提出11.1.2研究意義21.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀21.2.1果膠分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)和分類21.2.2果膠酶分類和作用方式31.2.3果膠酶生產(chǎn)菌種41.2.4真菌果膠酶的表達(dá)調(diào)控61.2.5 微生物果膠酶條件優(yōu)化研究現(xiàn)狀71.2.6米根霉產(chǎn)果膠酶研究進(jìn)展71.2.7固定化細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的進(jìn)展81.2.8果膠酶生產(chǎn)過(guò)程中的影響因素91.2.9果膠酶的應(yīng)用111.2.10果膠質(zhì)原料的研究121.3本課題研究的目的及主要內(nèi)容121.3.1研究目的121.3.2本課題研究的主要內(nèi)容121

21、.3.3創(chuàng)新點(diǎn)132.棉布載體固定化發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究142.1前言142.2材料和方法142.2.1菌種142.2.2主要儀器和試劑142.2.3培養(yǎng)基152.2.4載體的制備152.2.5發(fā)酵培養(yǎng)方法152.2.6分析方法162.3結(jié)果分析182.3.1酶液稀釋倍數(shù)的確定182.3.2游離發(fā)酵與固定化發(fā)酵的比較192.4討論192.4.1酶液稀釋倍數(shù)對(duì)酶活力測(cè)定準(zhǔn)確性的影響192.4.2游離發(fā)酵與固定化發(fā)酵192.5小結(jié)193固定化發(fā)酵果膠酶純果膠培養(yǎng)基的優(yōu)化203.1前言203.2材料和方法203.2.1菌種203.2.2主要儀器和試劑203.2.3培養(yǎng)基213.2.4發(fā)酵培養(yǎng)方法213

22、.2.5分析方法213.3結(jié)果分析223.3.1碳源種類的選擇223.3.2果膠濃度選擇233.3.3氮源種類選擇233.3.4硫酸銨濃度選擇243.3.5 Tween80對(duì)產(chǎn)酶的影響253.3.6金屬離子的對(duì)產(chǎn)酶的影響253.3.7發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)263.4討論273.4.1碳源種類及果膠濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響273.4.2氮源種類及硫酸銨對(duì)產(chǎn)酶的影響283.4.3Tween80對(duì)產(chǎn)酶的影響283.4.4金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響283.4.5正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析293.5小結(jié)294純果膠培養(yǎng)基半連續(xù)發(fā)酵果膠酶304.1前言304.2材料和方法304.2.1菌種、主要儀器和試劑304.2.2培養(yǎng)基304

23、.2.4發(fā)酵培養(yǎng)方法314.2.5分析方法314.3結(jié)果分析314.3.1轉(zhuǎn)速的選擇314.3.2裝液量選擇324.3.3溫度選擇324.3.4初始pH的選擇334.3.5初始孢子濃度的選擇334.3.6生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的時(shí)間曲線344.3.7半連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)354.3.8粗酶液部分酶學(xué)性質(zhì)364.4討論374.4.1轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響374.4.2 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響374.4.3初始孢子濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響384.4.4產(chǎn)酶與pH變化的關(guān)系384.4.5半連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性384.4.6粗酶液部分酶學(xué)性質(zhì)384.5小結(jié)395. 固定化發(fā)酵果膠酶煙梗浸液培養(yǎng)基的優(yōu)化405.1前言405.2材料和方法4

24、05.2.1試劑和設(shè)備405.2.2煙梗浸液的制備415.2.3培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)方法415.2.4分析方法415.3結(jié)果分析415.3.1兩種制備煙梗浸液方法的比較415.3.2煙梗濃度的選擇425.3.3硫酸銨濃度的選擇425.3.4 Zn2+離子濃度的選擇435.3.5 Tween80濃度的選擇435.3.6發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)445.4討論455.4.1制備煙梗浸液方法455.4.2培養(yǎng)基的優(yōu)化455.5小結(jié)456. 煙梗浸液培養(yǎng)基半連續(xù)發(fā)酵果膠酶476.1前言476. 2材料和方法476.2.1試劑和設(shè)備476.2.2煙梗浸液的制備476.2.3培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)方法476.2.4分析方

25、法486.3結(jié)果分析496.3.1初始pH的選擇496.3.2初始孢子濃度的選擇496.3.3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的時(shí)間曲線506.3.4半連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)516.3.5最優(yōu)發(fā)酵條件下纖維素酶活力516.4討論526.4.1發(fā)酵條件的優(yōu)化526.4.2生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的時(shí)間曲線526.4.3半連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性536.4.4發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活力的變化536.5小結(jié)537.結(jié)論與展望547.1結(jié)論547.2對(duì)后續(xù)工作的展望55致 謝56參考文獻(xiàn)57附 錄62蜂巢形棉布載體固定化米根霉產(chǎn)果膠酶的半連續(xù)化發(fā)酵研究1緒論1.1問(wèn)題的提出及研究意義1.1.1問(wèn)題的提出天然纖維素原料如橘皮、煙梗、稻草、玉米秸稈等是被廢棄的資

26、源，同時(shí)由于其內(nèi)部纖維素與果膠之間緊密作用造成利用生物技術(shù)轉(zhuǎn)化天然纖維素原料時(shí)的困難。天然纖維素原料在進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，一般需要先進(jìn)行半纖維素和木質(zhì)素等預(yù)處理過(guò)程，然后進(jìn)行纖維素酶解和微生物發(fā)酵產(chǎn)乙醇、丙醇、丁醇、檸檬酸和乳酸等。預(yù)處理過(guò)程的好壞很大程度上決定了酶解的難易程度，如酶結(jié)合性和催化水解率1。果膠質(zhì)的存在對(duì)半纖維、木質(zhì)素去除的有一定程度的影響，主要表現(xiàn)在增加處理過(guò)程中溶液的粘度和溶劑的使用量。米根霉在微生物轉(zhuǎn)化纖維素的眾多研究中有著重要的地位。米根霉作為一種公認(rèn)的安全菌，能產(chǎn)生廣泛的代謝物，如酶類（如果膠酶等），有機(jī)酸（如乳酸等）以及生物乙醇等，有著極大商業(yè)價(jià)值2。果膠酶在食品、

27、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)、飼料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用3，這就使得果膠酶的需求量逐年遞增。果膠酶生產(chǎn)量占全部工業(yè)酶制劑的10%左右4，其中在食品酶的銷售額中約占到了25%5。固定化米根霉的形式可視為特殊的生物活性結(jié)構(gòu)單元，它可以將精制原料如淀粉、葡萄糖等或是天然纖維素原料如玉米秸稈、稻草等轉(zhuǎn)換為乳酸、乙醇等，但還未應(yīng)用于降解果膠質(zhì)產(chǎn)酶的研究。國(guó)內(nèi)外在米根霉利用果膠質(zhì)這一領(lǐng)域尚存在諸多空白，為數(shù)不多的研究6-12，主要著力在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶酶性質(zhì)上的研究，如聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶等的性質(zhì)，未涉及固定化米根霉降解果膠的研究，對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的研究也不足，因此降解果膠產(chǎn)果膠酶的能

28、力不高。細(xì)胞固定化與細(xì)胞游離培養(yǎng)相比有許多優(yōu)勢(shì)，如細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞產(chǎn)率的提高，細(xì)胞分離更加方便從而有利于半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵13-14。真菌細(xì)胞的固定可以通過(guò)吸附于聚合物載體或者包埋于天然聚合物(海藻酸鹽凝膠和合成凝膠)。凝膠顆粒包埋細(xì)胞易阻礙物質(zhì)傳輸，影響發(fā)酵能力，還需要耗費(fèi)時(shí)力制備大量凝膠顆粒。棉布載體固定化細(xì)胞的方式由于將細(xì)胞吸附于棉布表面，同時(shí)金屬網(wǎng)狀支撐骨架利于物質(zhì)傳輸，因此菌體形態(tài)和發(fā)酵效果好。此外，棉布載體還具有重復(fù)使用性好和工業(yè)組裝方便等特點(diǎn)，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力15。據(jù)此，本文設(shè)想將棉布載體固定化米根霉這一生物活性單元引入到降解果膠質(zhì)產(chǎn)酶的研究中，優(yōu)化生物活性單元產(chǎn)酶的培養(yǎng)基

29、和培養(yǎng)條件，并進(jìn)行半連續(xù)試驗(yàn)，考察載體的重復(fù)使用性和穩(wěn)定性。1.1.2研究意義本文試圖將一種研究較少但有產(chǎn)果膠酶能力且富有商業(yè)價(jià)值的安全菌種-米根霉，結(jié)合以棉布載體固定化細(xì)胞的技術(shù)，用于降解果膠質(zhì)的研究，有助于天然纖維素生物轉(zhuǎn)換為下游產(chǎn)品如乳酸和乙醇等，同時(shí)收獲果膠酶粗酶液。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1果膠分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)和分類果膠，最早由Bracennot在胡蘿卜中提取得到的16。果膠廣泛存在于高等植物的根、莖、葉和果實(shí)中，水果皮如柑橘、檸檬、柚子等含有約30%的果膠，商品天然果膠多用酸從這些果皮或果渣中提取制得。 果膠，分子式為(C6H10O6)n，相對(duì)分子質(zhì)量5萬(wàn)-30萬(wàn)。果膠在高等植物

30、初生壁和胞間層中存在，在初生壁中與木質(zhì)纖維的微纖絲以及某些伸展蛋白相互交聯(lián)作用下，使得細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)堅(jiān)固, 維持細(xì)胞固有的形態(tài)。它是以-1,4糖苷鍵鍵合D-半乳糖醛酸形成的多糖主鏈，同時(shí)與帶有鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等中性糖側(cè)鏈共價(jià)鍵合的聚合物。果膠骨架基本單位是D-半乳糖醛酸，同時(shí)還含有如甲醇、乙酸和阿魏酸等非糖成分，其中D-半乳糖醛酸上的羧基可被甲基不同程度的脂化。一般可將果膠的結(jié)構(gòu)分為光滑區(qū)和須狀區(qū), 主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即HGA、RG-I和RG-II，其中RG-II常為二聚體形式（如圖1.1 所示）。果膠有多分子、多分散、多結(jié)構(gòu)，高級(jí)空間構(gòu)象的特點(diǎn) 17。果膠質(zhì)可分三類，即原果膠（pr

31、otopectin）、果膠（pectin）和果膠酸（pectic acid）。1944年，果膠術(shù)語(yǔ)制定委員會(huì)對(duì)果膠物質(zhì)作出明確的定義，具體如表1.1所示18 。表1.1果膠物質(zhì)的定義Tab.1.1 The definition of pectic substances分類定義溶解性果膠酸(pectic acid, pectate)完全未甲酯化的聚半乳糖醛酸鏈，由D-半乳糖醛酸脫水縮合，以-1,4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物微溶于水果膠(pectin, pectinate)羧基不同程度甲酯化和中和的聚半乳糖醛鏈，分為低酯果膠(LM)和高酯果膠(HM)可溶于水原果膠(protopectin)存在于

32、未成熟果蔬的細(xì)胞壁中，與纖維和半纖維結(jié)合的甲酯化聚半乳糖醛酸鏈不溶于水圖1.1 果膠的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖Fig. 1.1 Schematic representation of the primary structure of pectin1.2.2果膠酶分類和作用方式果膠酶通常分為原果膠酶、酯酶和解聚酶三種類型：原果膠酶將不溶于水的原果膠降解為高度聚合的可溶性果膠；酯酶通過(guò)對(duì)甲基的去除，促使果膠酯水解；解聚酶打斷果膠質(zhì)中部分D-半乳糖醛酸的-1, 4-糖苷鍵，有水解酶和裂解酶之分19-20。果膠酶因其最適pH差異，又有酸性和堿性果膠酶之分21 。果膠酯酶（PE）以隨機(jī)切除甲酯化果膠中的甲基的方式，導(dǎo)致

33、甲醇和游離羧基的產(chǎn)生。這個(gè)過(guò)程遵循單鏈機(jī)制：即PE沿果膠分子線性切除果膠中的甲基，但去酯化作用不能進(jìn)行完全，在酯化度約10%時(shí)就會(huì)停止。PE對(duì)果膠的去酯化作用，有助于聚半乳糖醛酸酶（PG）等其它果膠酶對(duì)果膠的降解。果膠水解酶，如PG、PMG等均能水解果膠的糖苷鍵。果膠裂解酶通過(guò)消除反應(yīng)使糖苷鍵斷裂，它攻擊果膠的糖苷鍵并在鄰近羧基或酯化的羧基一邊發(fā)生消除，在半乳糖醛酸的非還原末端形成 C4和 C5不飽和鍵。解聚酶又分內(nèi)切酶和外切酶, 內(nèi)切解聚酶在長(zhǎng)鏈內(nèi)部隨機(jī)切斷糖苷鍵, 而外切解聚酶從鏈的非還原性末端依次切斷糖苷鍵 5,22 。果膠酶的分類和作用方式23，分別如表1.2和圖1.2所示。表1.2

34、果膠酶的分類Tab.1.2 The classification of pectinolytic enzymes分類組成1.原果膠酶protopectinases, PPase2.果膠酯酶pectin esterases, PE3.果膠解聚酶depolymerizing enzymes3.1水解酶pectin hydrolases聚半乳糖醛酸酶 PG內(nèi)切酶(endo-PG)polygalacturonases(PG) PG外切酶(exo-PG)聚甲基半乳糖醛酸酶 PMG內(nèi)切酶(endo-PMG)polymethylgalacturonases(PMG) PMG外切酶exo-PMG3.2裂解酶P

35、ectin lyases(PL)聚半乳糖醛酸裂解酶PGL PGL內(nèi)切酶endo-PGLpolygalacturonate lyases(PGL) PGL 外切酶exo-PGL聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 PMGL內(nèi)切酶endo-PMGLpolymethylgalacturonate lyases(PMGL) PMGL外切酶exo-PMGL圖1.2 果膠酶的作用方式Fig.1.2. Mode of action of pectinases注：(a) R =H為PG作用，R=CH3 為PMG作用；(b) R =H為PGL，R=CH3為PL。1.2.3果膠酶生產(chǎn)菌種微生物產(chǎn)果膠酶菌種，可分為真菌和細(xì)菌果膠

36、酶產(chǎn)生菌，如表1.3所示。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究最熱的產(chǎn)果膠酶菌種是黑曲霉，多把它當(dāng)作果膠酶主要來(lái)源。果膠酶是一種組合酶系，不同微生物產(chǎn)生的果膠酶種類和性質(zhì)不同，如表1.4所示21 。米根霉（Rhizopus oryzae）：為根霉屬，是接合菌亞門、接合菌綱、毛霉目、毛霉科真菌。它的菌落或疏松或稠密，開(kāi)始為白色，后變?yōu)榛液稚蚝诤稚＞z體匍匐爬行，有無(wú)色、無(wú)分隔、多核和分支狀的特點(diǎn)。它的假根十分發(fā)達(dá)，分枝呈指根或根狀，呈褐色，它的最適生長(zhǎng)溫度為37°C，因此可在基體表面大量存在，產(chǎn)生不定形菌落。米根霉廣泛存在于酒曲、腐爛的植物、動(dòng)物糞便和土壤等。米根霉利用農(nóng)業(yè)廢物，如大麥、木薯、玉米、土豆

37、漿、燕麥和水稻等時(shí)，代謝產(chǎn)物為：有機(jī)酸、乙醇、水解酶（如聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶等）等，有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。米根霉在一定條件下可分泌果膠酶代謝果膠質(zhì)產(chǎn)生聚半乳糖醛酸等小分子物質(zhì)。因在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，米根霉利用果膠物質(zhì)發(fā)酵生成的酶類大部分是果膠酶，所以米根霉是一種潛在的生產(chǎn)果膠酶的菌種。表1.3 產(chǎn)果膠酶微生物分類Tab.1.3 The classification of microbial pectinolytic enzymes分類成員組成真菌主要包括：曲霉屬(Aspergillus)：黑曲霉(Aspergiluts niger)米曲霉(Aspergillus oryzae) 黃曲

38、霉(Aspergillus flavus)日本曲霉(Aspergillusjaponica)、醬油曲霉(Aspergillussojae)青霉屬 (Penicilum)、鐮孢屬(Fusarium) 、克魯維氏酵母(Kluyvermyoes) 其它：灰霉菌(Botrytis cinerea)、鐮孢菌(Fusariumspp)青霉菌(Penicilliumaxalicum)、啤酒酵母(Saccharomyces ceroisiae)細(xì)菌假單孢菌屬(Pseudomonas)、黃單孢菌屬(Xanthomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridiu

39、m)表1.4 源自微生物的果膠酶的性質(zhì)Table.1.4 Characterization of microbial pectinolytic enzymes成員種類最適pH最適T(°C)來(lái)源產(chǎn)酸性果膠酶：Aspergillus niger CH4 Endo-pectinase,Exo-pectinase4.5-6.03.5-5.050Acuna-Arguelles et al.,1995Penicillium frequentans Endo-PG4.5-7.550Borin et al., 1996Sclerotium rolfsii Endo-PG 3.5 55Channe a

40、nd Shewal, 1995Rhizoctonia solani Endo-PG4.8 50Marcus et al., 1986Mucor pusilus PG 5.040 Al-Obaidi et al., 1987Cloctridium thermosaccharolyticum PG5.5-7.0 30-40Rijssel et al., 1993產(chǎn)堿性果膠酶：Bacillus sp. RK9 PGL 10.0 Fogarty and Kelly, 1983Bacillus sp. NT-33PG 10.5 75Cao et al., 1992Bacillus polymyxa PG

41、 8.4-9.4 45 Nagel and Vaughn, 1961Bacillus pumilis PATE8.0-8.5 60 Dave and Vaughn, 1971Amucola sp. PAL 10.25 70 Bruhlmann et al., 1994Xanthomonas compestris PATE9.5 25-30 Nasumo and Starr, 1967Bacillus No. P-4-N PG 10-10.5 65 Horikoshi, 1990Bacillus stearothermophillus PATE 9.0 70Karbassi and Vaughn

42、, 1980Penicillium italicum CECT 22941 PL 8.0 50Alana et al., 1990Bacillus sp. DT 7PL8.0 60 Kashyap et al., 2000Bacillus subtilis PAL 8.5 60-65 Chesson and Codner, 1978Pseudomonas syringae pv. Glycinea PAL 8.0 30-40 Magro et al., 19941.2.4真菌果膠酶的表達(dá)調(diào)控大多數(shù)真菌PG是分泌型胞外酶且需要底物誘導(dǎo)，同時(shí)菌株要在誘導(dǎo)物存在條件下才能分泌PG，誘導(dǎo)物包括：果膠、

43、聚半乳糖醛酸、低濃度半乳糖醛酸及其寡聚體，而速耗碳源（如葡萄糖等）、較高濃度果膠降解產(chǎn)物（如半乳糖醛酸等）、抗體以及植物PG抑制蛋白會(huì)抑制真菌表達(dá)PG24。Li 等25在核盤病菌( S1 sclerotiorum)的研究中發(fā)現(xiàn)：以1%橘皮果膠作為碳源的培養(yǎng)基中，隨著S1 sclerotiorum菌體量的增加，培養(yǎng)液中PG 活力逐步升高；在含有1%半乳糖醛酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，雖然能檢測(cè)到PG酶活力，但比在橘皮果膠的培養(yǎng)基中低，而在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，沒(méi)有檢測(cè)到明顯PG酶活力。Maldonado 等 26 發(fā)現(xiàn)Aspergiluts niger產(chǎn)生PG的過(guò)程可被葡萄糖完全抑制，但以

44、前的研究已表明葡萄糖并不抑制PG 活性，也就說(shuō)明培養(yǎng)基中葡萄糖的存在對(duì)PG 合成不利。在培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完時(shí)，菌株又可在底物的誘導(dǎo)作用下合成PG，這說(shuō)明葡萄糖對(duì)PG產(chǎn)生的抑制是可逆的，進(jìn)一步研究表明葡萄糖的抑制作用是發(fā)生在翻譯水平上。Piccol等27發(fā)現(xiàn)蔗糖的存在對(duì)P . expansum 產(chǎn)生PG 有抑制，該抑制作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上且可逆。Aguilar 等28 則在曲霉研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對(duì)PG 合成的影響與葡萄糖濃度以及加入培養(yǎng)基的時(shí)間有很大關(guān)系。為解釋不同碳源對(duì)合成果膠酶的影響，Ros等29 探究了碳源的不同類型對(duì)Rhizopus nigricans產(chǎn)果膠酶的影響，Nair 等30

45、 則研究了不同碳源對(duì)6種曲霉產(chǎn)果膠酶的影響。 Stratilova 等31 對(duì)Aspergiluts niger的研究表明, 培養(yǎng)基pH和碳源種類可明顯影響PG的合成。Geoecze 等32 對(duì)P. expansum 的研究表明，培養(yǎng)基中酵母提取物的存在對(duì)PG的產(chǎn)生有著不利的影響，PG 酶活力與培養(yǎng)基的pH有一定的關(guān)系 ，產(chǎn)酶的高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)基顯酸性時(shí)。在PL的研究中，也發(fā)現(xiàn)受到類似調(diào)控的情況。真菌PL的產(chǎn)生受到低濃度的半乳糖醛酸誘導(dǎo)。在穩(wěn)定期，高濃度果膠（5%）產(chǎn)酶較低，表明高濃度的半乳糖醛酸或某一代謝物會(huì)產(chǎn)生自我降解物阻遏。在葡萄糖存在的情況下，產(chǎn)酶會(huì)降低到基礎(chǔ)水平33-35。綜上，可認(rèn)為

46、作為真菌成員之一的米根霉，產(chǎn)果膠酶的過(guò)程如下：在果膠、聚半乳糖醛酸、低濃度的半乳糖醛酸及其寡聚體的誘導(dǎo)下，米根霉能較多的分泌胞外果膠酶；在快速消耗碳源如葡萄糖、蔗糖等存在的情況下，可能會(huì)抑制米根霉果膠酶的表達(dá)，該抑制作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平且可逆，同時(shí)添加快速消耗碳源的時(shí)間點(diǎn)不同，對(duì)果膠酶產(chǎn)生有著不同影響，若在先有果膠底物存在的情況下后加入快速消耗碳源，會(huì)使產(chǎn)酶出現(xiàn)停滯和降低，反之，可能受到的影響較??；較高濃度半乳糖醛酸或果膠其它的代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生自我降解物阻遏，從而影響產(chǎn)酶；此外抗體、植物PG抑制蛋白等可以抑制米根霉表達(dá)PG。1.2.5 微生物果膠酶條件優(yōu)化研究現(xiàn)狀從上個(gè)世紀(jì) 60 年代起，我國(guó)開(kāi)始

47、從事產(chǎn)果膠酶的微生物篩選、酶學(xué)性質(zhì)、生產(chǎn)工藝及工業(yè)應(yīng)用等方面進(jìn)行研究，研究主要集中在曲霉屬，其中又以黑曲霉為主。在選育菌株工作的同時(shí)，進(jìn)行培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化，以期提高果膠酶酶活力。一些國(guó)內(nèi)外在培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面的研究，如表 1.5 中所示。表1.5 微生物產(chǎn)果膠酶條件優(yōu)化Table.1.5 Optimization of pectinolytic enzymes production菌種優(yōu)化方法結(jié)果來(lái)源嗜堿菌AL-103碳源果膠為碳源時(shí)酶活達(dá)最高 張鴻雁36霉菌As2接種量接種量為30%時(shí)酶活較高全桂靜等37曲霉培養(yǎng)基Tween-80 0.15%酶活提高 鄔敏辰等38HDDM

48、G05培養(yǎng)基最大產(chǎn)酶量8100 U/mL 蔡柏巖等39Peacilomyces.clavisporus 2A.UMIDA.1溫度液體培養(yǎng)產(chǎn)酶溫度為30°CSouza JVB 等40吉氏芽孢桿菌S-2無(wú)機(jī)鹽離子Ca2+對(duì)該酶有明顯的激活作用，Mn2+、Cu2+、Zn2+對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用張保國(guó)等41MHZP-01、MHZP-02pH最適 pH 值均為 5.0 葛菁萍等42Alkalibacterium sp.F26培養(yǎng)基培養(yǎng)條件酶活達(dá) 1015 U/mL 李建洲等43黑曲霉培養(yǎng)基培養(yǎng)條件比優(yōu)化前提高8.7 倍陳勇強(qiáng)44黑曲霉P-6021細(xì)胞固定化產(chǎn)酶上升，酶活達(dá)664U/mL鐘衛(wèi)鴻

49、等45草酸青霉 L5培養(yǎng)基培養(yǎng)條件是初始酶活的3倍藍(lán)麗精等46黑曲霉 (MTCC: 281).培養(yǎng)基培養(yǎng)條件酶活達(dá)6.1U/mLPalaniyappan M等471.2.6米根霉產(chǎn)果膠酶研究進(jìn)展米根霉的果膠酶基因組的研究表明，富含GH28，13個(gè)基因編碼Endo-PG和3個(gè)基因編碼Exo-PG，6個(gè)基因編碼PME。因此，米根霉降解果膠分泌的最主要酶是PG。Endo-PG作用于果膠光滑區(qū)，即同型半乳糖醛酸（HG）長(zhǎng)鏈上，隨機(jī)水解-1,4-D-半乳糖醛酸；Exo-PG從HG鏈非還原末端開(kāi)始水解HG鏈。豐富的主鏈降解酶和少量的輔酶存在，導(dǎo)致傾向于降解無(wú)支鏈果膠。PME的數(shù)量較多可以表明PG對(duì)沒(méi)有酯化

50、的果膠的親和力高48。 Saito等7在米根霉利用土豆?jié){發(fā)酵產(chǎn)乳酸和乙醇的研究中，發(fā)現(xiàn)米根霉NBRC 4707的PG活力比NRRL 395高1倍，導(dǎo)致NBRC 4707產(chǎn)乳酸和乙醇更加高效，得到在發(fā)酵過(guò)程中添加果膠酶能提高乳酸和乙醇的產(chǎn)量的結(jié)論。經(jīng)過(guò)純化和分析，測(cè)得PG相對(duì)分子質(zhì)量為31kDa，最適pH為4.5，最適溫度為45°C。Hamdy8-9在米根霉利用橘皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的研究中，在浸離液中發(fā)現(xiàn)高纖維素酶活力和高果膠酶活力，經(jīng)過(guò)純化和分析，認(rèn)定該果膠酶為PL：Km為3.87mg/mL，Vmax為297U/mL，Kcat為5.94mgU/min，相對(duì)分子質(zhì)量為37kDa。Karee

51、m等10在米根霉利用橘皮（35%w/v）固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究中，得到粗酶液酶活力為1360U/mL，并把其應(yīng)用于橘子果汁的澄清。Hart等11在米根霉利用橘汁加工過(guò)程中的副產(chǎn)物橘子漿固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究中，發(fā)現(xiàn)其主要產(chǎn)物為PG，極少有PE和PL產(chǎn)生，因此在柑橘工業(yè)中顯示出潛力。Yoshida等12在米根霉利用果膠液培養(yǎng)基發(fā)酵的同時(shí)浸漬桑樹(shù)根，發(fā)現(xiàn)只有PG、PGL和PL這三種果膠酶，其中PG在浸漬中發(fā)揮主要作用。 綜上所述，米根霉的果膠酶基因組的研究表明，米根霉有大量產(chǎn)果膠酶的潛力；米根霉發(fā)酵分泌果膠酶的研究表明，研究多集中在酶性質(zhì)上，缺少對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)的優(yōu)化，因此酶活力不高。1.2.7固定

52、化細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的進(jìn)展固定化細(xì)胞（Immobilized cells）是指固定于非水溶性載體上的細(xì)胞，固定后的細(xì)胞只能在有限的空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)。這項(xiàng)技術(shù)源自20世紀(jì)70年代，它是一種獲得酶和代謝產(chǎn)物的方法，是在固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)之上發(fā)展起來(lái)的。固定化的細(xì)胞能仍能正常的進(jìn)行生命活動(dòng)，所以又被稱為固定化增殖細(xì)胞。微生物（如真菌等）固定化細(xì)胞方式依據(jù)對(duì)細(xì)胞作用原理不同，主要有包埋法和吸附法。包埋法是通過(guò)多空載體將細(xì)胞包埋在其內(nèi)部的方法，可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法，前者的應(yīng)用較廣泛。吸附法是依據(jù)細(xì)胞（帶負(fù)電）與吸附劑之間的多種作用如靜電、表面張力和粘附力等，從而將其固定在吸附劑表面或內(nèi)部最終形成

53、生物膜的方法，吸附劑有硅藻土、多孔材料（如陶瓷、玻璃和塑料等）、金屬細(xì)網(wǎng)、微小載體以及中空纖維等。用于固定化細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的研究已經(jīng)設(shè)計(jì)了眾多的載體和方式。表1.6總結(jié)可具有代表性的一些研究發(fā)現(xiàn)。聚氨酯泡沫(PUF）由于具有化學(xué)的穩(wěn)定性和機(jī)械可塑性，故在生物處理過(guò)程中的應(yīng)用較多49。海藻酸鹽凝膠珠由于具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無(wú)毒性、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、包埋細(xì)胞效率高和原料價(jià)格便宜等特點(diǎn)，所以常用它固定化細(xì)胞。纖維類材料具有許多適于固定化細(xì)胞的物理化學(xué)性質(zhì)，來(lái)源廣泛且價(jià)格便宜。鐘衛(wèi)鴻等45用PFU（0.7g/50ml培養(yǎng)基）固定化Aspergillus niger P-6021發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，重復(fù)5 批次，發(fā)酵

54、液酶活達(dá)到664U/mL，比游離提高約2.3倍。Kuhad等50在用PUF固定化Streptomyces sp. RCK-SC的研究中，將1gPUF微粒（1cm2/個(gè)，密度32 kg/m3，粒徑100-500m）放入裝有50mL優(yōu)化后培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，并接入種子培養(yǎng)基，每間隔24h換入新鮮的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10天，在第5批次酶活達(dá)到最大101U/mL，比游離發(fā)酵產(chǎn)果膠酶酶活力提高33%。Kapoor等51的研究表明，利用PFU作為基質(zhì)固定化Bacillussp.MG-cp-2生產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶，重復(fù)發(fā)酵30天，比游離發(fā)酵提高1.5倍（147U/mL）。Edwil等52用海藻酸鈣凝膠珠

55、（直徑3.5-4.5mm）固定化Aspergillus sp.CC1發(fā)酵產(chǎn)PG，經(jīng)6批次半連續(xù)發(fā)酵，PG酶活力有所提高，在第4批次達(dá)到10.8 U/mL，比游離的提高約1.2倍。Nighojkar等53在對(duì)海藻酸鈉凝膠珠、戊二醛處理的海藻酸鹽凝膠珠和聚乙烯醇-海藻酸鹽凝膠珠包埋Aspergillus niger產(chǎn)PG的研究中，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉凝膠珠（接入比1:4）效果較好，首批次PG活力為953±15U/L，半連續(xù)發(fā)酵使用6個(gè)周期內(nèi)PG下降不大。林紹輝等54以卡拉膠為載體的固定化Aspergillus niger 9. 203產(chǎn)果膠酶，進(jìn)行5批次的重復(fù)產(chǎn)酶，穩(wěn)定性良好，酶活最高為86.7

56、0U/mL。Catarina等55在循環(huán)流動(dòng)的填充床反應(yīng)器中，用經(jīng)過(guò)堿處理的谷物纖維素為載體固定Kluyveromyces marxianus CCT 3172 細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)不間斷產(chǎn)果膠酶，產(chǎn)率可達(dá)0.98UmL-1h-1。Marília等56在用橘皮固定化Aspergillus niger URM 5162產(chǎn)PG的研究中，得到此橘皮固定床反應(yīng)器產(chǎn)endo- PG酶活力和 exo-PG 酶活力分別為1.18U/mL和4.11U/mL。Darah等57的研究表明，在100mL優(yōu)化過(guò)的培養(yǎng)基中，加入6個(gè)經(jīng)預(yù)處理過(guò)的百潔布(scouring pad)方塊（1cm3）固定化Aspergillus niger HFD5A-1，在第6天果膠酶活為11.05 U/mL，