DNA提取原理和方法

1、 DNA extraction ZJL2014.05.09細胞內的核酸包括DNA與RNA兩種分子，均與蛋白質結合成核蛋白。真核生物的DNA又有染色體DNA與細胞器DNA之分。前者為雙鏈線性分子；后者為雙鏈環(huán)狀分子。除此之外，在原核生物中還有雙鏈環(huán)狀的質粒DNA；在非細胞型病毒顆粒內，DNA的存在形式多種多樣。 DNA extraction 極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，鈉鹽比游離核酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。核酸的理化性質核酸的理化性質提取提取DNADNA總的原則

2、總的原則 : :1 保證核酸一級結構的完整性；2 其他生物大分子的污染應降低到最低程度；3 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4 其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。q 基因組基因組DNADNA的提取的提取q 非基因組非基因組DNA的提取的提取質粒質粒DNA的提取的提取斷裂成為線狀共價閉合環(huán)狀結構q基因組基因組DNA的提取的提取細胞破碎方法 應用 機械法1勻漿法機體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細菌、酵母 物理法1超聲法細胞混懸液2反復凍融法培養(yǎng)細胞3冷熱交替法細菌、病毒4低滲裂解紅細胞 化學法1有機溶劑細菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細胞3酶解法細菌、酵母根據

3、裂解方式的不同有：根據裂解方式的不同有：吸附材料結合法：吸附材料結合法：根據核酸分離純化方式的不同有：根據核酸分離純化方式的不同有：硅質材料硅質材料 陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂 磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結合核酸，低鹽高值結合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫?？旖莞咝?。快捷高效。低鹽高低鹽高pHpH值結合核酸，高鹽低值結合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實驗。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。物，從而達到分離目的。q基因組基因組DNA的提取的提取濃鹽法濃鹽法：有機溶劑抽提法：有機溶

4、劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物q基因組基因組DNA的提取的提取q SDS SDS法流程圖法流程圖 （以動物組織為例）（以動物組織為例） 動物組織動物組織細胞裂解細胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液lApproximately 1 cm of ta

5、il is cut and put into an microfuge tube;lAdd 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;lAdd 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at

6、RT;lSpin at 13,000 rpm for 30 min at RT;lTransfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;lTransfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100%

7、 ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;lWash pellet once with 70% ethanol, air dry;lResuspend DNA i

8、n ddH2O.lUse 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR. Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA1.SDS ：十二烷基硫酸鈉2.Tris：緩沖液3.EDTA 2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;作用：細胞裂解時PH值也能穩(wěn)定作用：a. 溶解細胞

9、膜、核膜上脂質成分 b.使蛋白質變性 作用：是二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細胞膜的穩(wěn)定性。Tail solution:3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;Proteinase K :作用：廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質，將DNA游離。4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT;5. Spin at 13,000 rpm for 30 min

10、at RT;優(yōu)點：1. 有效變性蛋白質； 2. 抑制了DNase的降解作用。缺點：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分DNAPhenol：Chloroform：1.加速有機相與液相分層。2.去除DNA水溶液中殘留的微量酚。減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。Isoamyl alcohol： 7.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for

11、min at RT;9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;經酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。Chloroform：10.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;11.Spin at 13,000 rpm for 5 mi

12、n at RT;NaOAc (pH=6.0) :1. 沉淀核酸，縮短乙醇沉淀的時間2. 提供單價陽離子。減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀， 100% ethanol任意比和水相混溶，奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。但是加其他比例的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。12. If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C;13.

13、 Wash pellet once with 70% ethanol, air dry;14. Resuspend DNA in ddH2O.DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。2. 基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。 DNA的保存 ：q非基因組非基因組DNA的提取的提取堿裂解法密度梯度離心法煮沸法質粒質粒DNA的提取的提取1、培養(yǎng)細菌使質粒擴增 -對數生長后期2、收集和裂解細菌3、質粒DNA的純化質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法1、培養(yǎng)細菌使質粒擴增 -對數生長后期 在含有相應抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉化質粒的細菌(單克隆)，使細菌快速增殖

14、的同時質粒DNA得到大量擴增。37oC振蕩過夜振蕩過夜質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法2、收集和裂解細菌 非離子型/離子型去污劑 裂解 有機溶劑/堿 加熱 質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法3 、質粒DNA的純化 - CsCl-溴化乙錠梯度密度離心 取決于線狀DNA與閉環(huán)DNA與溴化乙錠結合的量質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法原理原理 染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象； 變性染色體DNA片段與

15、變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法離心洗滌離心洗滌對數期菌體對數期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質粒質粒DNA溶液溶液質粒質粒DNA的提取的提取-堿裂解法堿裂解法SDS堿裂解法提取質粒堿裂解法提取質粒DNA中溶液的成分及作用中溶液的成分及作用 溶液溶液 Resuspension Buffer 成分：成分：50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HC

16、l， pH=8.0 葡萄糖葡萄糖: 增稠。維持滲透壓，防止DNA受機械切力作用降解。 EDTA : 二價金屬離子的螯合劑，抑制DNase的活性。 有利于溶菌酶的作用。 這一步溶液中還可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。當溶液中PH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。 溶液溶液 Lysis Buffer 成分成分 ：0.2M NaOH / 1% SDS NaOH ：溶解細胞，DNA變性 SDS ： (1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。 (2)解聚細胞中的核蛋白。 (3)SDS能與蛋白質結合成為復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。 SDS與與NaOH聯用：聯用：增強NaOH的強堿

17、性 SDS堿裂解法提取質粒堿裂解法提取質粒DNA中溶液的成分及作用中溶液的成分及作用 SDS堿裂解法提取質粒堿裂解法提取質粒DNA中溶液的成分及作用中溶液的成分及作用 溶液溶液 Neutralization Buffer 成分成分 ： 3M KAc / 2M HAc KAc : K+置換了SDS中的Na+，得到PDS沉淀 HAc : 中和NaOH,使DNA復性 吸附柱 Spin Column with Collection Tubesl結構： 特殊硅基質吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質穿過。 高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值洗脫。 大提大提&小提小提 區(qū)別：區(qū)別： 1.

18、大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特異性去除RNA）、含一定量PEG的氯化物（回收質粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利于細菌的裂解和質粒的純化，所以大提的產物比小提的量多很多，而且純度很高。 3.小提一般用于質粒鑒定和對純度要求不是很高的實驗，大提用于質粒的大量提取和轉染等純度要求很高的實驗。* 內毒素的去除內毒素的去除內毒性也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性胞膜上一種成分，細菌外膜的外部脂質完全由內毒素分子組成。包含疏水區(qū)域也包含了親水和帶電區(qū)域，從而賦予其與其它分子相互作用的獨特性質。細菌在其活躍生長時表面的內毒素成分較少，而一旦其死亡則會釋放大量內毒素。在質粒提取的裂解過程中，內毒素會從細菌的外膜釋放到裂解液中。內毒素會對原代細胞的DNA轉染產生嚴重影響，同樣也會影響培養(yǎng)細胞的敏感性