自學(xué)內(nèi)容分子雜交技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1自學(xué)自學(xué)(zxu)內(nèi)容分子雜交技術(shù)內(nèi)容分子雜交技術(shù)第一頁(yè)，共39頁(yè)。核酸分子核酸分子(fnz)雜交雜交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子單鏈分子(fnz)放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一起放在一起，只要在，只要在DNA或或RNA的單鏈分子的單鏈分子(fnz)之間有一定之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子(fnz)之間形之間形成雜交雙鏈成雜交雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡一、分子雜交與印跡(yn j

2、)(yn j)技術(shù)的原技術(shù)的原理理第1頁(yè)/共39頁(yè)第二頁(yè)，共39頁(yè)。復(fù)性復(fù)性(f xn)RNADNA第2頁(yè)/共39頁(yè)第三頁(yè)，共39頁(yè)。（一）印漬技術(shù)(jsh) Blotting 首先由首先由Edwen Southern在在1975年提出。年提出。Blotting即即“印漬印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析(fnx)的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋、和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。白質(zhì)的檢測(cè)。 第3頁(yè)/共39頁(yè)第四頁(yè)，共39頁(yè)。二、印漬技術(shù)(jsh)的類別及應(yīng)用 DNA

3、印跡技術(shù)(jsh) Southern blottingRNA印跡技術(shù)(jsh) Northern blotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(jsh) Western blotting 斑點(diǎn)印跡 Dot blotting原位雜交 in situ hybridization DNA點(diǎn)陣 DNA array DNA芯片技術(shù)(jsh) DNA chip 第4頁(yè)/共39頁(yè)第五頁(yè)，共39頁(yè)。（一）DNA印跡(yn j)技術(shù) Southern blotting 又稱為又稱為Southern雜交，即雜交，即DNA-DNA雜雜交分析，是研究交分析，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，圖譜的基本技術(shù)，主要主要(zhyo)用于基因組

4、用于基因組DNA的分析，的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，在遺傳診斷，在遺傳診斷DNA圖譜分析及圖譜分析及PCR產(chǎn)物產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。分析等方面有重要價(jià)值。第5頁(yè)/共39頁(yè)第六頁(yè)，共39頁(yè)。第6頁(yè)/共39頁(yè)第七頁(yè)，共39頁(yè)。Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿(l fn)無(wú)水乙醇離心(lxn)第7頁(yè)/共39頁(yè)第八頁(yè)，共39頁(yè)。（二）RNA印漬技術(shù)(jsh) Northern blotting又稱為又稱為Northern雜交，即雜交，即RNA-DNA雜交分析雜交分析。是一種將。是一種將RN

5、A從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。維素膜上的方法。主要主要(zhyo)用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。第8頁(yè)/共39頁(yè)第九頁(yè)，共39頁(yè)。（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)(jsh)Western blotting又稱為又稱為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用應(yīng)用(yngyng

6、)：用于檢測(cè)樣品中特異性：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。 第9頁(yè)/共39頁(yè)第十頁(yè)，共39頁(yè)。三種三種(sn zhn)印跡技術(shù)的比較印跡技術(shù)的比較第10頁(yè)/共39頁(yè)第十一頁(yè)，共39頁(yè)。（一）（一）DNA印跡印跡(yn j)技術(shù)技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）（二）RNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于用于RNA的定性的定性(dng xn

7、g)定量分析。定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡(yn j)分析分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。第11頁(yè)/共39頁(yè)第十二頁(yè)，共39頁(yè)。第12頁(yè)/共39頁(yè)第十三頁(yè)，共39頁(yè)。第13頁(yè)/共39頁(yè)第十四頁(yè)，共39頁(yè)。n與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)反應(yīng)n顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)第14頁(yè)/共39頁(yè)第十五頁(yè)，共39頁(yè)。斑點(diǎn)印跡Dot blotting 斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤本直接點(diǎn)到膜上，烘烤(hn ko)

8、固定固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。品。 第15頁(yè)/共39頁(yè)第十六頁(yè)，共39頁(yè)。原位雜交in situ hybridization 即組織原位雜交即組織原位雜交(zjio)，指組織切片或，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交細(xì)胞涂片直接用于雜交(zjio)分析。先分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或或RNA雜交雜交(zjio)。 因此原位雜交因此原位雜交(zjio)可以確定探針的互可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空

9、間位置，這一點(diǎn)具有補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要生物學(xué)和病理學(xué)意義。重要生物學(xué)和病理學(xué)意義。第16頁(yè)/共39頁(yè)第十七頁(yè)，共39頁(yè)。第17頁(yè)/共39頁(yè)第十八頁(yè)，共39頁(yè)。第18頁(yè)/共39頁(yè)第十九頁(yè)，共39頁(yè)。第19頁(yè)/共39頁(yè)第二十頁(yè)，共39頁(yè)。學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析?；蛳鄬?duì)定位分析。第20頁(yè)/共39頁(yè)第二十一頁(yè)，共39頁(yè)。探針探針(tn zhn)技術(shù)技術(shù) probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對(duì)它的末端或全位素、生物素或熒光染料

10、對(duì)它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱為鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱為“探針探針”然后用于然后用于分子雜交，雜交后通過(guò)分子雜交，雜交后通過(guò)(tnggu)(tnggu)放射自顯放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)現(xiàn)出來(lái)第21頁(yè)/共39頁(yè)第二十二頁(yè)，共39頁(yè)。第22頁(yè)/共39頁(yè)第二十三頁(yè)，共39頁(yè)。第23頁(yè)/共39頁(yè)第二十四頁(yè)，共39頁(yè)。第24頁(yè)/共39頁(yè)第二十五頁(yè)，共39頁(yè)。第25頁(yè)/共39頁(yè)第二十六頁(yè)，共39頁(yè)。第26頁(yè)/共39頁(yè)第二十七頁(yè)，共39頁(yè)。第27頁(yè)/共39頁(yè)第二十八頁(yè)，共39頁(yè)。第28頁(yè)/共39頁(yè)第二十九頁(yè)，共39頁(yè)。第29頁(yè)/共39頁(yè)第三十頁(yè)，共

11、39頁(yè)。第30頁(yè)/共39頁(yè)第三十一頁(yè)，共39頁(yè)。蛋白質(zhì)相互作用研究蛋白質(zhì)相互作用研究(ynji)(ynji)技術(shù)技術(shù) Research Technology of Interaction of Protein第31頁(yè)/共39頁(yè)第三十二頁(yè)，共39頁(yè)。蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的復(fù)制的復(fù)制(fzh)與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。代謝等等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。 蛋白質(zhì)之間相互作用研究蛋白質(zhì)之間相互作用研究(ynji)(ynji)的重的重要性要性第32頁(yè)/共39頁(yè)第三十三頁(yè)，共39頁(yè)。酵母雙雜交酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換熒光共振能量轉(zhuǎn)換(zhunhun)效應(yīng)分析