生物信息學(xué)Bioinformatics第2講 生物信息學(xué)研究內(nèi)容【精選-】

1、生 物 信 息 學(xué)Bioinformatics第2講 生物信息學(xué)研究內(nèi)容主講教師： 劉 吉 平2004年3月生 物 信 息 學(xué)主要介紹的內(nèi)容：什么是生物信息學(xué)？國內(nèi)外生物信息學(xué)的研究歷史和現(xiàn)狀。生物信息學(xué)的研究內(nèi)容和科學(xué)目標(biāo)。分別解讀生物分子的三大核心數(shù)據(jù)庫：GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫、SWISS-PORT 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、PDF生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。介紹國內(nèi)外有關(guān)生物信息學(xué)的網(wǎng)站和網(wǎng)址。生物信息學(xué)在yahoo 上找有關(guān)生物信息學(xué)的網(wǎng)站或網(wǎng)頁 BiologyProteinPhenotypeDNA(Genotype)基因結(jié)構(gòu) The 4 basescNNCCCCCCCCCNNNNNHooHH

2、HHHHHHAdenineThyminecNNCCCCCCCCNNNNHoHHoNNHHHHHGuanineCytosineA-TG-CNote: this is flat!Uracil replaces Tin RNAPurine ringPyrimidine ring三 研究內(nèi)容生物信息學(xué)與計算生物學(xué)或生物計算有著密切的關(guān)系，但又不盡相同.目前歸入生物信息學(xué)研究領(lǐng)域的大致有以下七個方面：Bioinfomatics七個方面研究內(nèi)容建立和管理各種生物數(shù)據(jù)庫生物信息數(shù)據(jù)庫使用生物信息學(xué)中的數(shù)學(xué)模式和算法研究數(shù)據(jù)庫接口和檢索工具的研制HGP的實(shí)施，對信息采集和處理提出的要求生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，

3、是從大量數(shù)據(jù)中提取新知識DNA芯片和微陣列的開展1 建立和管理各種生物數(shù)據(jù)庫各種生物數(shù)據(jù)庫的建立和管理。如核酸序列數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、各種專業(yè)的數(shù)據(jù)庫等。這是一切生物信息學(xué)工作的根底，通常要有計算機(jī)科學(xué)背景的專業(yè)人員與生物學(xué)家密切合作。2、生物信息數(shù)據(jù)庫使用 近些年來隨著快速序列測定、基因重組、多維核磁共振等技術(shù)的應(yīng)用，基因組與蛋白質(zhì)的實(shí)驗數(shù)據(jù)呈爆炸性趨勢增長;建立數(shù)據(jù)庫再結(jié)合有關(guān)的分析軟件使大規(guī)模數(shù)據(jù)的貯存、處理和分析成為可能，并已開展成為包括基因組信息與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬在內(nèi)的生物信息學(xué)研究的重要根底。核酸序列數(shù)據(jù)庫Genbank，美國國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫 。EMBL，建立在歐洲分子

4、生物實(shí)驗室的數(shù)據(jù)庫 ( :/ embl-heidelberg.de)。DDBJ，是DNA Data Bank of Japan的簡稱，又叫日本的DNA數(shù)據(jù)庫銀行available at :/ nig.ac.jp )。Genbank美國國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫原中山醫(yī)科大學(xué)的網(wǎng)頁有鏈接：該數(shù)據(jù)庫提供Entrez檢索工具、BLAST序列搜索、生物信息學(xué)學(xué)習(xí)等效勞內(nèi)容其他重要數(shù)據(jù)庫真菌如釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫SGD擬南芥數(shù)據(jù)庫AtDB( :/genome- /Arabidopsis/)線蟲綜合數(shù)據(jù)庫ACEDBftp:/sanger.ac.uk(/pub/acedb) (自由

5、下載,建立二次數(shù)據(jù)庫)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM) /其他重要生物數(shù)據(jù)庫魚類的 斑馬魚 ://昆蟲類的果蠅(Drosophila melanogaster, fruitfly)脊椎動物如小鼠(Mus musculus細(xì)菌如大腸桿菌( :/ /pub/sequence/)原生動物如人類一種寄生性的原蟲(Plasmodium falciparum): :/PlasmoDB.org/三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB Protein Data Bank , :/

6、 /npdb 等。與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)的數(shù)據(jù)庫還有：SCOPavailable at / 等。80-99年 Helix-turn-helix motif of protein binding to DNA結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)基序Motif數(shù)據(jù)庫-PROSITEPROSITE( :/ /prosite/)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)生物信息數(shù)據(jù)庫的主要效勞借助特定的算法模型提供同源性分析是目前各種生物信息數(shù)據(jù)庫的最重要內(nèi)容之一。分子生物學(xué)的中心法那么DNAmRNA結(jié)構(gòu)翻譯轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)/酶cDNADNA功能反轉(zhuǎn)錄相互作用折疊3、生物信息學(xué)中的數(shù)學(xué)模式和重要算法研究 迄今已有相當(dāng)多的數(shù)學(xué)方

7、法應(yīng)用于生物信息學(xué)的研究。而且一種算法本身就是一門學(xué)問，例如：機(jī)器學(xué)習(xí)法人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分形理論密碼學(xué)全息論高維分布的統(tǒng)計方法生物信息學(xué)中的重要算法-聚類分析生物信息學(xué)問題許多可歸為聚類問題。聚類分析：聚類是宏觀與微觀生物學(xué)研究中最常用的一種數(shù)學(xué)方法，它的根本目的是將n個樣本劃分為m個類，從而使同類樣本較為相似而不同類間樣本差異較大。其中支撐矢量機(jī)算法可從網(wǎng)上學(xué)習(xí)：尋找轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)生物信息學(xué)中的重要算法遺傳算法：遺傳算法的提出，本身就是借鑒生物界中的適者生存、優(yōu)勝劣汰的遺傳機(jī)制所提出來的隨機(jī)化搜索方法，其最主要的特點(diǎn)就是面向結(jié)構(gòu)對象、不受求導(dǎo)和函數(shù)連續(xù)性的限定、具有內(nèi)在的隱并行性和良好的全局

8、尋優(yōu)能力。生物信息學(xué)中的重要算法-遺傳算法過去20多年的開展，已使得遺傳算法成為現(xiàn)代智能計算中的關(guān)鍵技術(shù)之一，并已應(yīng)用于生物信息學(xué)的研究：基于蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈構(gòu)象計算蛋白質(zhì)折疊的算法模型與模擬圖像匹配中的遺傳算法結(jié)構(gòu)圖的同態(tài)研究目前較流行的數(shù)學(xué)方法和算法1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)Neural Networks 1982年，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)首次被應(yīng)用到生物學(xué)的研究中來，接著Stormo等人應(yīng)用類似的算法在預(yù)測大腸桿菌體內(nèi)的一些蛋白質(zhì)翻譯的起始部位取得了成功。1988年，隨著Qian and Sejnowski發(fā)表的一篇關(guān)于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的文章，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的算法已成為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析預(yù)測的主流算法。另外，神經(jīng)網(wǎng)

9、絡(luò)在預(yù)測信號肽，研究遺傳密碼的結(jié)構(gòu)和起源等方面也有較多應(yīng)用。目前較流行的數(shù)學(xué)方法和算法2 Threading方法Threading方法或稱折疊類型的識別方法。根本思想是：預(yù)測的蛋白的折疊類型與某一結(jié)構(gòu)的蛋白的折疊類型相同，這樣蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測問題就轉(zhuǎn)變?yōu)樵诳臻g結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，選取一種最有可能的折疊類型，從而大大減小預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的難度。4 數(shù)據(jù)庫接口和檢索工具的研制數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容來自萬千生物學(xué)者的日積月累，最終又為生物學(xué)者們所用。但不能要求一般生物學(xué)工作者具有高深的計算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)知識，因此，必須開展查詢數(shù)據(jù)庫和向庫里提供數(shù)據(jù)的方便接口。這是專業(yè)人員才能勝任的工作，通常在生物信息中心里進(jìn)行。5 HGP

10、的實(shí)施，對信息采集和處理提出的要求人類基因組方案(HGP)的實(shí)施，配合大規(guī)模的DNA自動測序，對信息的采集和處理提出了空前的要求。從各種圖譜的分析，大量序列片段的拼接組裝，尋找基因和預(yù)測結(jié)構(gòu)與功能，到數(shù)據(jù)和研究結(jié)果的視像化，無不需要高效率的算法和程序。因此，研究新算法、開展方便適用的程序，是生物信息學(xué)的日常任務(wù)。與HGP相關(guān)研究的幾個方面表現(xiàn)：由于當(dāng)前生物信息學(xué)開展的主要推動力來自HGP，所以生物信息學(xué)與HGP的關(guān)系就顯得更為密切，其與HGP相關(guān)的研究主要表現(xiàn)在如下幾個方面：1高度自動化的實(shí)驗數(shù)據(jù)的獲得、加工和整理如何將實(shí)驗室中得到的生物學(xué)信息轉(zhuǎn)化為計算機(jī)能夠處理的數(shù)字信息，是生物學(xué)的一個重要

11、課題。表達(dá)在各種自動化分子生物學(xué)儀器應(yīng)用上，如DNA測序儀，PCR儀等。這類儀器將實(shí)驗所得的物理化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，并對其作簡單分析，再將分析結(jié)果用于實(shí)驗條件的控制，完成高度自動化的實(shí)驗過程。2序列片段的拼接目前DNA自動測序儀每個反響只能測序500bp左右。如何將這些序列片段拼接成完整的DNA順序就成為接下來 的一個重要工作。傳統(tǒng)的測序技術(shù)通常將克隆進(jìn)行亞克隆并對亞克隆進(jìn)行排序。這些工作需要大量的人力物力。現(xiàn)在生物信息學(xué)提供了自動而高速地拼接序列的算法，不僅防止了亞克隆排序所需的大量繁瑣的工作，還能使序列具有一定的冗余性redundancy，即一定數(shù)量的重復(fù)以保證序列中每個堿基的準(zhǔn)確性。

12、3基因區(qū)域的預(yù)測在完成序列的拼接后，我們得到的是很長的DNA序列，甚至可能是整個基因組的序列。這些序列中包含著許多未知的基因，下一步就是將基因區(qū)域從這些長序列中找出來。所謂基因區(qū)域的預(yù)測，一般是指預(yù)測DNA順序中編碼蛋白質(zhì)的局部，即外顯子局部。不過目前基因區(qū)域的預(yù)測已從單純外顯子預(yù)測開展到整個基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測。這些預(yù)測綜合各種外顯子預(yù)測的算法和人們對基因結(jié)構(gòu)信號(如TATA box和加尾信號)的認(rèn)識，預(yù)測出可能的完整基因。4基因或蛋白質(zhì)功能預(yù)測用實(shí)驗手段證實(shí)一個預(yù)測的新基因后，下一步要做的就是尋找這個基因的功能。-即功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)功能預(yù)測分析，主要是分析目的蛋白質(zhì)是否與具有功能信息的蛋白質(zhì)相

13、似。策略有二：同源序列分析功能區(qū)相關(guān)的保守序列特點(diǎn)分析。5分子進(jìn)化的研究通過上述種種方法我們可以預(yù)測出一個新基因可能具有的功能。然而預(yù)測新基因只是生物信息學(xué)研究的一個方面，這門學(xué)科的根本目標(biāo)是探究隱藏在生物數(shù)據(jù)后面的生物學(xué)知識。對于基因組研究來說，一個重要的研究方向就是分子序列的進(jìn)化。通過比較不同生物基因組中各種結(jié)構(gòu)成分的異同，可以大大加深我們對生物進(jìn)化的認(rèn)識。這方面的研究已逐步形成一個稱為比較基因組學(xué)Comparative Genomics的新學(xué)科。Human genome shares 223 genes with bacteria-genes that do not exist in t

14、he worm, fly, or yeast. A reticulated tree, or net, which might more appropriately represent lifes history. 6 生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，是從大量數(shù)據(jù)中提取新知識生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，是從海量數(shù)據(jù)中提取新知識。這首先是從DNA序列中識別編碼蛋白質(zhì)的基因，以及調(diào)控基因表達(dá)的各種信號。其次，從基因組編碼序列翻譯出的蛋白質(zhì)序列的數(shù)目急劇增加，根本不可能用實(shí)驗方法一一確定它們的結(jié)構(gòu)和功能。從已經(jīng)積累的數(shù)據(jù)和知識出發(fā)，預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，成為常規(guī)的研究任務(wù)。7 DNA芯片和微陣列的開展DNA芯

15、片和微陣列的開展，把一定組織或生物體內(nèi)萬千基因時空表達(dá)的研究提上日程研究基因表達(dá)過程中的聚群關(guān)系，從中提取調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑的知識，進(jìn)而從整體上模擬細(xì)胞內(nèi)的全部互相輔合的生化反響，在亞細(xì)胞層次理解生命活動。基因芯片檢測系統(tǒng)Bioinfomatics七個方面研究內(nèi)容建立和管理各種生物數(shù)據(jù)庫生物信息數(shù)據(jù)庫使用生物信息學(xué)中的數(shù)學(xué)模式和方法研究數(shù)據(jù)庫接口和檢索工具的研制HGP的實(shí)施，對信息采集和處理提出的要求生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，是從大量數(shù)據(jù)中提取新知識DNA芯片和微陣列的開展此外，專業(yè)人材的培養(yǎng)，也是一個重要內(nèi)容。四、展望作為計算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)應(yīng)用于分子生物學(xué)而形成的交叉學(xué)科，生物信息學(xué)已經(jīng)成為基因

16、組研究中必不可少的有力研究手段。為了能夠更好地效勞于基因組研究，生物信息學(xué)在將來的開展中需要做以下幾方面的努力：1理論研究任何學(xué)科的開展都離不開根底理論的研究，生物信息學(xué)也不例外。它對許多學(xué)科都提出了巨大的挑戰(zhàn)。這些學(xué)科包括分子進(jìn)化遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)、統(tǒng)計生物學(xué)、基因組學(xué)以及計算機(jī)科學(xué)和應(yīng)用數(shù)學(xué)的相關(guān)學(xué)科。如果根底理論研究得不到應(yīng)有的開展，生物信息學(xué)的開展將受到嚴(yán)重的阻礙。2生物數(shù)據(jù)的質(zhì)量監(jiān)控監(jiān)控已有的生物數(shù)據(jù)究竟具有多大的可信度，對于物理圖譜的構(gòu)建工作將有十分重大的意義。3加強(qiáng)生物學(xué)家和計算機(jī)科學(xué)家以及數(shù)學(xué)家之間的溝通長期以來，這三類科學(xué)家都是埋頭于各自的研究領(lǐng)域，而不關(guān)心其他學(xué)科的開展和要

17、求。這種狀況在我國尤為突出。生物信息學(xué)的開展要求三者之間加強(qiáng)溝通。其意義不僅在于推動生物信息學(xué)自身的開展，而且將形成促進(jìn)整個生物學(xué)開展的強(qiáng)大動力。生物信息學(xué)作為基因組研究的有力武器，被廣泛地用來加快新基因的尋找過程，以到達(dá)將有用新基因搶先注冊專利的目的。在這場世界范圍內(nèi)的競爭中，中國科學(xué)家以及科研資金投向的決策部門如何結(jié)合我國科研水平的現(xiàn)狀、優(yōu)勢領(lǐng)域等客觀情況，將有限的投資投入以求獲得最大可能的科學(xué)研究以及商業(yè)回報，是一個無法回避的新課題。我國科學(xué)家展望我國科學(xué)家認(rèn)為，在克隆新基因的思路方面，我國不應(yīng)該照搬國外克隆新基因所用的方法，而應(yīng)該走生物信息學(xué)和定位克隆相結(jié)合的道路。具體地說就是一方面進(jìn)

18、行各種遺傳疾病家系的采集，從家系分析入手，尋找致病基因在染色體上的位置，然后對這個區(qū)域進(jìn)行測序，再利用生物信息學(xué)的手段預(yù)測候選基因和它的功能并用實(shí)驗加以證實(shí)；另一方面直接從現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中的EST出發(fā)，用生物信息學(xué)的方法尋找可能有研究價值的新基因，并用實(shí)驗方法來研究證實(shí)。這種雙管齊下克隆新基因的方法可能更適合我國人類基因組研究在財力、物力和研究人才資源等方面的客觀條件。在生物信息學(xué)學(xué)科建設(shè)方面在生物信息學(xué)學(xué)科建設(shè)方面，政府應(yīng)注意加強(qiáng)生物信息學(xué)學(xué)科建設(shè)的延續(xù)性，克服青年科技人員流動性大等困難，有重點(diǎn)地把工作長久地開展起來，盡快設(shè)立相關(guān)的學(xué)位，以利于對后繼人才的培養(yǎng)；適當(dāng)?shù)刂С謸碛形覈灾髦R產(chǎn)權(quán)

19、的算法、軟件的后繼開發(fā)、包裝工作，這不僅僅因為其潛在的商業(yè)利潤，更要逐漸確立中國在世界生物信息學(xué)領(lǐng)域的地位。在生物信息系統(tǒng)的構(gòu)建方面國家應(yīng)當(dāng)集中創(chuàng)立一兩個具有一定規(guī)模的生物信息中心，建立面向全國的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。這個系統(tǒng)的建立可以分兩步走。第一步我們要將國外公共數(shù)據(jù)庫中的內(nèi)容和相關(guān)軟件收集和集中起來，提供檢索和下載。第二步是將這些資源有機(jī)地組合，建立一個統(tǒng)一的生物信息平臺。通過這個平臺用戶可以將各種格式的數(shù)據(jù)提交給設(shè)在生物信息中心的效勞器，在效勞器上進(jìn)行一系列的檢索和數(shù)據(jù)分析。用戶不必關(guān)心各種數(shù)據(jù)庫和軟件的輸入輸出格式，只需一個簡單的客戶端軟件甚至只需一個WWW瀏覽器就能完成全

20、部工作。整個生物信息平臺不僅是一個集成的數(shù)據(jù)庫，而且是一個集成的軟件工具。在生物信息學(xué)理論研究方面發(fā)揮國人的聰明才智，加強(qiáng)數(shù)學(xué)算法研究應(yīng)用系統(tǒng)論、信息論，開展生物信息學(xué)理論研究開展生物信息學(xué)的倫理道德研究。結(jié)語相信在HGP和即將開始的中國人類基因組研究方案中，生物信息學(xué)將發(fā)揮越來越大的作用，并推動生物學(xué)進(jìn)入一個全新的境界。5、相關(guān)資源： European Bioinformatics Institute EBI) SBDS (Southampton Bioinformatics Data Server) U.S. Department of Energy - Bioinformatics In

21、frastructure The NASA Ames Center for Bioinformatics The National Center for Biotechnology Information Protein Data Bank (PDB)Mirror Site 北京大學(xué)生物信息學(xué)中心 生物信息學(xué)專業(yè)網(wǎng) BioSino中國生物信息 6.參考鏈接:生物信息學(xué) 生物技術(shù)的核心 (2000-04-03 ) 西安成立生物信息研究中心 (2000-05-16 ) 海峽兩岸理論生命科學(xué)交流逐步深入 (2000-05-17 ) 人類基因組測序能力中國超法德名列第四 (2000-06-29 ) 我

22、國首家DNA序列公共數(shù)據(jù)庫開通 (2000-07-04 ) 我國科學(xué)家“強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合勇攀生命科學(xué)制高點(diǎn) (2000-07-04) 德國欲在人類基因組研究中取得領(lǐng)先地位 (2000-07-05 ) 德通過基因研究戰(zhàn)略文件 (2000-07-16 ) 增強(qiáng)我國基因組研究整體實(shí)力的八點(diǎn)建議 (2000-07-19 ) 2000年北京市生物信息學(xué)工程評審會議召開 (2000-08-10) 根據(jù)“新生命網(wǎng)站編輯整理，2000年10月31日 生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)課件介紹五、WWW上提供的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫工具軟件介紹軟件的使用和說明目前開發(fā)的大量軟件工具，大多數(shù)缺乏技術(shù)細(xì)節(jié)的描述，使得新軟件編制時不能很好地利用已有的

23、軟件資源，不得不從頭開始，造成各種軟件都有自己的輸入輸出格式，相互之間互不通用。同時，大量軟件的出現(xiàn)帶來一個新問題，即生物學(xué)家面對數(shù)量眾多的軟件無從選擇。這兩個問題的解決需要對各種軟件的功能特性和技術(shù)細(xì)節(jié)進(jìn)行詳盡的介紹，并進(jìn)行比較。這樣的話，新軟件的編制者可以防止一些編程的重復(fù)勞動，甚至直接利用已有的程序模塊，并且可以編制已有軟件輸出格式的接口，統(tǒng)一輸入輸出的格式，用戶也可以方便地選擇適宜的軟件。六、生物數(shù)據(jù)庫常用的查詢方法介紹下周一思考題：請獨(dú)立完成以下思考題：1、請分別列出動物、真菌、細(xì)菌、魚類、病毒、原生動物、植物等一種模式生物的名稱和相關(guān)的網(wǎng)址。2、請在網(wǎng)上找到一種有關(guān)算法的介紹。3、

24、請在網(wǎng)絡(luò)上找到有關(guān)SARs病毒或禽流感病毒的基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址。注意：下星期自己網(wǎng)上實(shí)習(xí)。沒有計算機(jī)的同學(xué)，憑學(xué)生證可以到網(wǎng)絡(luò)課室上機(jī)。謝謝各位!2VEn6YHq9$Ktc*Owf-RAi1UDl4XGp7#Jsb%Mve)Pyh0TBk3WEn6ZIq9$Luc*Oxg-RAj2UDm5YGp8!Jsb&Nve)Qzh0TCl3WFo7ZIra$Lud(Oxg+SAj2VEm5YHq8!Ktc&Nwf)Qzi1TCl4XFo7#Jra%Mvd(Pyg+SBk2VEn6YHq9$Ktc*Owf-RAi1UDl4XGp7#Jsb%Mve)Pyh0TBk3WEn6ZIq9$Luc*Oxg-RAj2U

25、Dm5YGp8!Jsb&Nve)Qzh0TCl3WFo7ZIra$Lud(Oxg+SAj2VEm5YHq8!Ktb&Nwf)Qzi1TCl4XFo7#Jra%Mvd(Pyg+SBk2VEn6YHq9$Ktc*Owf-Rzi1UDl4XGp7#Jsb%Mve)Pyh0TBk3WEn6ZIq9$Luc*Oxg-RAj2UDm5XGp8!Jsb&Nve)Qzh0TCl3WFo7ZIra$Lud(Oxg+SAj2VEm5YHq8!Ktb&Nwf)Qzi1TCl4XFo7#Jra%Mvd(Pyg+SBk2VEn6YHq9$Ktc*Owf-Rzi1UDl4XGp7#Jsb%Mve)Pyh0TBk3WEn6

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