常用分析化學(xué)技術(shù) 色譜法

1、色譜分析法 1906年，俄國植物學(xué)家 茨維特發(fā)表了他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：為了別離植物色素，他將含有植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗。俄國植物學(xué)家茨維特一、概論別離過程 茨維特植物色素別離實(shí)驗(yàn)圖示：樣 品：植物色素固定相：CaCO3顆粒流動相：石油醚 流動相石油醚混合色素葉綠素葉黃素胡蘿卜素分離組分色譜柱固定相碳酸鈣 由于不同的色素在碳酸鈣顆粒外表的吸附力不同，隨著淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動的速度不同，從而形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了別離。 茨維特將這種別離方法命名為色譜法。色譜法 色譜法又稱色層法或?qū)游龇?，是一種根據(jù)物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)不

2、同而進(jìn)行的別離分析方法。 色譜分析包括兩個過程： 1.別離過程； 2.分析過程。 更注重別離過程。 色譜法主要關(guān)注別離相關(guān)理論及方法。 實(shí)現(xiàn)色譜操作的根本條件是必須具備相對運(yùn)動的兩相，固定相和流動相。 固定相：在色譜別離中固定不動，對組分產(chǎn)生保存作用的一相。 流動相：攜帶試樣混合物流過固定相的氣體或液體。 擔(dān)體：又稱載體，是一種多孔性化學(xué)惰性固體，在色譜中用于承載液體固定相。1.色譜別離過程 保存作用：組分與固定相作用而被固定稱之。 遷移作用：組分溶解在流動相中，隨流動相移動稱之。 差速遷移：不同組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有差異，導(dǎo)致各組分與固定相作用能力不同，在流動相中的溶解度不同，移動速度產(chǎn)生差異的

3、現(xiàn)象。 組分在色譜別離過程中有兩種行為： a.保存作用：與固定相作用，被固定相作用。 b.遷移作用: 溶解在流動相中，隨流動相移動。 不同的組分，由于組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，與固定相作用能力不同，在流動相中的溶解度不同，移動速度不同： 與固定相作用能力強(qiáng)，在流動相中的溶解度小的組分，移動速度慢： 反之，與固定相作用能力弱，在流動相中的溶解度大的組分，移動速度快。 將小差異累積數(shù)千乃至數(shù)百萬次，產(chǎn)生大差異，從而將各組分別離。 組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異 與固定相作用有微小差異 隨流動相移動的速度不同 差速遷移 將小差異重復(fù)屢次 產(chǎn)生大差異 色譜別離。例：紙色譜, 以正丁醇:甲酸:水混合溶液作流動相

4、，用0.1%茚三酮溶液顯色，混合物中有賴氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸。 移動最快：亮氨酸。 移動最慢：賴氨酸。例：紙色譜, 以1mol/lHAc作流動相，混合物中有水楊酸、苯酚、鄰苯二酚。 移動最快：水楊酸。 移動最慢：苯酚。 流動相HAc為強(qiáng)極性溶劑。 在水楊酸、苯酚、鄰苯二酚三種化合物中，水楊酸極性最強(qiáng)，鄰苯二酚次之，苯酚最弱。 根據(jù)“相似相溶原那么，水楊酸在HAc中溶解度最大，移動最快。苯酚在HAc中溶解度最小，移動最慢。例：薄層色譜, 以硅膠作吸附劑，用乙醇作流動相，混合物中有苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯。 移動最快：苯甲酸苯甲酯。 移動最慢：苯甲酸。 在苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯三種化

5、合物中，苯甲酸極性最強(qiáng)，苯甲醇次之，苯甲酸苯甲酯最弱。 分子極性越強(qiáng)，與吸附劑的作用力越大，越易被吸附，移動速度越慢； 反之，分子極性越弱，與吸附劑的作用力越小，移動速度越快。 苯甲酸苯甲酯極性弱，與硅膠的吸附力小，移動速度快； 苯甲酸極性強(qiáng)，與硅膠的吸附力大，移動速度慢。2. 色譜法的分類 根據(jù)流動相的狀態(tài)將色譜法分成四大類。表 色譜法以流動相種類的分類色譜類型流動相主要分析對象氣相色譜法氣體揮發(fā)性有機(jī)化合物液相色譜法液體溶于水或有機(jī)溶劑的各種物質(zhì)超臨界色譜法超臨界流體各種有機(jī)化合物電色譜法緩沖溶液、電場離子和各種有機(jī)化合物1按兩相分子的聚集狀態(tài)分類2 按固定相的固定方式分類平面色譜 紙色譜

6、薄層色譜高分子薄膜色譜柱 色 譜 填充柱色譜 毛細(xì)管柱色譜 分配色譜： 利用分配系數(shù)的不同吸附色譜： 利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同3按別離機(jī)制分類流動相 固定相 類型液體 固體 液-固色譜液體 液體 液-液色譜氣體 固體 氣-固色譜氣體 液體 氣-液色譜液相色譜 氣相色譜 3.色譜法的特點(diǎn)(1)別離效率高 復(fù)雜混合物，同系物、異構(gòu)體、手性異構(gòu)體。(2) 靈敏度高 可以檢測出-1(10-6)級甚至-1(10-9)級的物質(zhì)量。(3) 分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。 色譜別離是所有的別離方式中，別離效率最高的。

7、常見的別離方式：沉淀過濾、重結(jié)晶、分液、萃取、蒸餾、升華、離心、電泳等二、色譜別離原理 沉淀過濾用于別離溶液和固體不溶物。 重結(jié)晶用于溶液中一種物質(zhì)溶解度隨溫度變化較大而另一種物質(zhì)溶解度隨溫度變化較小的情況。 例如：硝酸鉀溶解度隨溫度變化大，氯化鈉溶解度隨溫度變化小，可用重結(jié)晶從混合液中提純硝酸鉀。 分液用于別離兩種不同密度且不相混溶的液體。 例如：水和植物油的別離。 萃取用于溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑里溶解度不同。 蒸餾用于別離各組分沸點(diǎn)不同的液態(tài)混合物。 升華適用于有升華特性的物質(zhì)。 離心別離用于不溶性微粒與液體，或兩種密度不同且不相混溶的液體混合物，借助離心力不同的而到達(dá)別離。 電泳別離是

8、利用帶電粒子在電場中移動速度不同而到達(dá)別離。 不同帶電粒子因所帶電荷不同，或雖所帶電荷相同但荷質(zhì)比不同而移動速度不同，在電場中電泳一段時間后，由于移動距離不同而相互別離。 色譜主要是一種別離方式。 色譜別離是利用不同組分與固定相和流動相之間作用的差異： 吸附色譜，利用吸附劑外表的活性吸附中心對不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)別離。 分配色譜，利用被別離組分在固定相和流動相中的溶解度差異而實(shí)現(xiàn)別離。 離子交換色譜，利用被別離離子與固定相之間親合力差異實(shí)現(xiàn)別離。 空間排阻色譜，利用被別離組分分子尺寸大小不同而滲透能力差異進(jìn)行別離。 吸附色譜的固定相為固體吸附劑，因外表存在許多吸附中心而具有吸附作用。

9、被別離組分與固定相的外表吸附，是別離組分分子與吸附劑外表分子的分子間里的相互作用所引起的 。 分子間里的相互作用與分子結(jié)構(gòu)、極性等因素有關(guān)。 1.吸附色譜 母核相同化合物，官能團(tuán)極性越大，整個分子極性越大，越易被吸附 。 常見官能團(tuán)極性順序：羧基 酚羥基羥基氨基醛基酮基酯基 醚基 雙鍵相應(yīng)的有機(jī)物類別羧酸 酚 醇 胺 醛 酮 酯 醚 烯 烷烴 強(qiáng)極性基團(tuán)如羧基、羥基、氨基越多，極性越大。 烷烴類非極性化合物，不易被吸附； 形成分子內(nèi)氫鍵時，吸附力減弱； 分子內(nèi)烷基含碳數(shù)越多，極性越弱，吸附力減弱； 同系物中，分子量越大，極性越小，吸附力越弱。 分子極性大，易被吸附 ，后流出色譜柱； 反之, 分

10、子極性小，吸附力弱，先流出色譜柱。相似相溶原那么 “相似相溶原那么，即非極性物質(zhì)易溶解在非極性溶劑中(例如碘溶于四氯化碳中)，極性物質(zhì)和離子型晶體易溶于極性溶劑(如水)中。主要表現(xiàn)在： a. 溶質(zhì)分子和溶劑分子的結(jié)構(gòu)越相似，相互溶解越容易； 2.分配色譜 b. 溶質(zhì)分子與溶劑極性越相似，越易互溶。 c. 溶質(zhì)分子與溶劑分子的分子間力越相似，越易互溶。 根據(jù)流動相和固定相相對極性不同，液-液色譜有正相和反相之分。固定相的極性比流動相強(qiáng)的, 稱正相色譜。反之，流動相極性大于固定相極性的，稱為反相色譜。正相色譜中流動相的極性比固定相小，根據(jù)相似相溶原那么，極性小組分在流動相溶解度較大，移動速度較快。

11、反相色譜中流動相的極性比固定相大，根據(jù)相似相溶原那么，極性大組分在流動相溶解度較大，移動速度較快。 正相色譜的流出順序是：極性小的先流出，極性大的后流出；反相色譜的流出順序正好相反：極性大的先流出，極性小的后流出。 3.離子交換色譜 固定相為離子交換樹脂。 離子交換樹脂具有固定離子基團(tuán)及可交換離子基團(tuán)。 離子交換樹脂上分子骨架上連接著活性基團(tuán)，如SO3，N(CH3)3+等。 為了保持離子交換樹脂的電中性，活性基團(tuán)上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號相反的離子，此即為可交換的離子基團(tuán)。陽離子交換劑:對陽離子具有交換能力。 按活性基團(tuán)分類，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陰離子交換劑:對陰

12、離子具有交換能力。陰離子交換4.空間排阻色譜 又稱凝膠色譜、尺寸排阻色譜。 固定相為凝膠。凝膠是有機(jī)物制成的分子篩，其中常用的是葡聚糖凝膠，它是多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。 凝膠具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。 各組分在固定相、流動相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行別離，而是按分子大小進(jìn)行別離。 各組分在凝膠中的滯留時間取決于分子大小,分子小的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；分子大的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。 依次按大分子、中等分子、小分子順序流出，從而到達(dá)別離目的。空間排阻別離原理圖三、色譜技術(shù) 柱色譜又稱柱層析。將色譜填

13、料裝填在色譜柱管內(nèi)作固定相的色譜方法。 操作過程：裝柱 加樣 洗脫。 將固定相注入下端塞有棉花或?yàn)V紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉末攤鋪在玻璃管頂端，用流動相洗脫。1.柱色譜 常見的洗脫方式有兩種，一種是自上而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠毛細(xì)作用洗脫。 收集別離后的純潔組分也有兩種不同的方法，一種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘干固定相后用機(jī)械方法分開各個色帶，以適宜的溶劑浸泡固定相提取組分分子。 2. 薄層色譜又叫薄板層析。通常將固定相均勻地涂鋪在外表潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板，進(jìn)行樣品別離。操作過程：薄層板的制備點(diǎn)樣展開顯色 a.薄層板的制

14、備 薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。 薄層應(yīng)盡量均勻且厚度要固定。 b. 點(diǎn)樣 先用鉛筆在距薄層板一端1cm處輕輕劃一橫線作為起始線，然后用毛細(xì)管吸取樣品，在起始線上小心點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑一般不超過2mm。 假設(shè)因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)前方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響別離效果。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層。 c.展開 薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進(jìn)行。 在層析缸中參加配好的展開溶劑，使其高度不超過1cm。 將點(diǎn)好的薄層板小心放入層析缸中。點(diǎn)樣一端朝下，浸入展開劑中。蓋好瓶蓋，觀察展開劑前沿上升到一定高度時取出， 在板上標(biāo)上展開劑前沿位置。晾干

15、，觀察斑點(diǎn)位置。 d.顯色 當(dāng)組分無色時，需噴灑顯色劑使斑點(diǎn)顯色。 對于含有熒光劑的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機(jī)化合物在亮的熒光背景上呈有色斑點(diǎn)。薄層色譜3. 紙色譜 又叫紙層析。以濾紙為載體的色譜法，別離原理屬分配色譜法。 固定相：紙纖維上吸附的水 流動相：與水不相混溶的溶劑。 紙色譜以濾紙作載體。濾紙是由纖維素組成，纖維素上有多個OH，能吸附水。 這些吸附水就構(gòu)成了色譜過程的固定相，展開劑(與水不相混溶的有機(jī)溶劑)為流動相，濾紙只起到支持固定相的作用。 當(dāng)樣品點(diǎn)在濾紙一端，放在一密閉器中，讓流動相通過毛細(xì)管作用從濾紙一端，經(jīng)過點(diǎn)樣點(diǎn)流向另一端，樣品中溶質(zhì)在固定相水、流動相有機(jī)溶劑中進(jìn)

16、行分配。 易溶于有機(jī)溶劑而難溶于水的組份，隨流動相往前移動速度快些，而易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑的組份，隨流動相向前移動速度慢些，從而到達(dá)將不同組份別離的目的。 紙色譜的操作，除不需要制備薄層板外，其他點(diǎn)樣、展開、顯色與薄層色譜相似。 紙層析4.氣相色譜 氣相色譜是機(jī)械化程度很高的色譜方法，氣相色譜系統(tǒng)由氣源、色譜柱和柱箱、檢測器和記錄器等局部組成。 氣源負(fù)責(zé)提供色譜分析所需要的載氣，即流動相，載氣需要經(jīng)過純化和恒壓的處理。 氣相色譜的色譜柱一般直徑很細(xì)長度很長，柱內(nèi)或者填充填料或者涂布液相的固定相。 檢測器是氣相色譜帶給色譜分析法的新裝置，在經(jīng)典的柱色譜和薄層色譜中，對樣品的別離和檢測是分別進(jìn)

17、行的，而氣相色譜那么實(shí)現(xiàn)了別離與檢測的結(jié)合。 氣相色譜檢測器種類很多。最常用的有熱導(dǎo)檢測器、氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器等。 熱導(dǎo)檢測器是基于不同組分與載氣有不同的熱導(dǎo)率的原理而工作的熱傳導(dǎo)檢測器。敏感元件為熱絲，如鎢絲，并由熱絲組成電橋。 當(dāng)被測組分與載氣一起進(jìn)入熱導(dǎo)池時，由于混合氣的熱導(dǎo)率與純載氣不同，致使鎢絲溫度發(fā)生改變，其電阻也隨之改變，進(jìn)而使電橋輸出端產(chǎn)生不平衡電位而作為信號輸出。 氫火焰離子化檢測器適合痕量有機(jī)物的分析。 氫焰檢測器由離子室、離子頭及氣體供給三局部組成。微量有機(jī)物被載氣帶入檢測器，在氫火焰的作用下離子化。 產(chǎn)生的離子在發(fā)射極和收集極的外電場作用下定向移動而形成

18、微弱的電流。微電流經(jīng)放大，由記錄儀記錄下來。 火焰光度檢測器是氣相色譜儀用的一種對含磷、含硫化合物有高選擇型、高靈敏度的檢測器。 試樣在富氫火焰燃燒時，含磷有機(jī)化合物主要是以HPO碎片的形式發(fā)射出波長為526nm的光，含硫化合物那么以S2分子的形式發(fā)射出波長為394nm的特征光。 光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，微電流經(jīng)放大，由記錄儀記錄下來。5.高效液相色譜 高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜。 由于液體流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓，高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。 氣相色譜僅能分析在操作溫度

19、下能汽化而不分解的物質(zhì)。據(jù)估計，在化合物中能直接進(jìn)行氣相色譜分析的化合物約占15%。 對于高沸點(diǎn)化合物；難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定的化合物、離子型化合物等，難以用氣相色譜法進(jìn)行分析。為解決這個問題，開展了高效液相色譜。 高效液相色譜的原理與經(jīng)典液相色譜相同，但是它采用高壓泵和高靈敏度檢測器。 高效液相色譜的檢測器很多，最常用的有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器等。 紫外檢測器的工作原理如下：由光源產(chǎn)生的紫外光或可見光， 經(jīng)過透鏡變成兩束平行光，無樣品通過時，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度相等，光電管輸出相同，無信號產(chǎn)生；有樣品通過時，由于樣品對光的吸收，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度不相等，有信號產(chǎn)生。 示差折光檢測器是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折射率來進(jìn)行組分檢測的。 光通過僅有流動相的參比池時，由于流動相組成不變，故其折射率是固定的；光通過工作池時，由于存在待測組分而使折射率改變，從而引起光強(qiáng)度的變化，測量光強(qiáng)度的變化，即可測出該組分濃度的變化。 熒光檢測器適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定。 熒光物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級，這些電子從高能級躍至低能級時，物質(zhì)會發(fā)出比入射光波長較 長的光，這種光稱為熒光。 在其他條件一定的情況下，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。在紫外光激發(fā)下，熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，由光電倍增管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴Ｋ?、色譜應(yīng)用