-利用生物合成原理尋找微生物新藥（精品）

1、第三章 利用生物合成原理尋找微生物新藥根據(jù)微生物藥物的生物合成原理發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑通過(guò)非基因定向改變、基因定向改變，以及組合生物催化的技術(shù)，或是改變?cè)形⑸锼幬锏纳锖铣赏緩?，或是?duì)原有的微生物藥物或先導(dǎo)化合物和中間體進(jìn)行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥 .產(chǎn)生菌前體物質(zhì)(1) 誘變處理化學(xué)修飾天然產(chǎn)物衍生物天然產(chǎn)物天然中間物天然產(chǎn)物衍生物 阻斷或非阻斷菌株定向與雜交生物轉(zhuǎn)化與 組合生物轉(zhuǎn)化 微生物或酶轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物類似物雜合工程菌突變生物合成組合生物合成(2) 基因操作天然產(chǎn)物類似物(1)(2)天然產(chǎn)物類似物定向與雜交生物合成化學(xué)修飾微生物藥物生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn)的根本途徑 通過(guò)非基

2、因定向改變的方法包括：定向生物合成、雜交生物合成、突變生物合成，以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化；基因定向改變，即為組合生物合成。 第一節(jié)生物合成途徑的非基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)一、非遺傳操作的定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)已有的研究說(shuō)明，在抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成中酶底物的特異性足以使結(jié)構(gòu)相關(guān)的代謝產(chǎn)物在其發(fā)酵液中積累；但由于生物合成酶的底物專一性較低寬泛性，其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過(guò)程中添加一些結(jié)構(gòu)類似物作為前體物質(zhì)，可以產(chǎn)生含有與這種結(jié)構(gòu)類似的新衍生物；這種獲得新次級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑，可以被稱之為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前體pr

3、ecursor即在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，外源添加的某一化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)微生物的代謝，能夠?qū)⑵湔w地或局部地整合到某一特定的次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等。非遺傳操作的定向生物合成這種在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加某種特定的前體物質(zhì)，使微生物的生物合成朝著將這些前體物質(zhì)摻入到產(chǎn)物分子的某一特定部位而產(chǎn)生過(guò)量的含有這種前體的產(chǎn)物的方法，即為非遺傳操作的定向生物合成。其根本原理是由于參與這些反響的生物合成酶的底物專一性較差，而能使外源添加的某些前體物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性地?fù)饺氲教囟óa(chǎn)物的分子中去。 定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶的特點(diǎn)：是一個(gè)由一系列酶參與催化的多酶體系。參與催

4、化反響的酶的底物專一性比初級(jí)代謝合成酶要差。應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的有：青霉素G和V；培羅霉素；四環(huán)素和金霉素等。 青霉素定向生物合成序號(hào)側(cè) 鏈 R學(xué) 名俗 名1對(duì)羥基芐青霉素青霉素X2芐青霉素青霉素G3戊烯2青霉素青霉素F4戊青霉素青霉素二氫F5庚青霉素青霉素K6丙烯巰甲基青霉素青霉素O7苯氧甲基青霉素青霉素V84氨基4羧基丁基青霉素青霉素N青霉素和6APA分子結(jié)構(gòu)及各種天然青霉素的結(jié)構(gòu)與名稱青霉素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)6APA的化學(xué)結(jié)構(gòu)各種天然青霉素具有的側(cè)鏈和名稱培羅霉素定向生物合成.培羅霉素定向生物合成可結(jié)合進(jìn)入BLM的末端

5、胺基局部的非天然胺基化合物.* PEP的末端胺基四環(huán)類抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四環(huán)素HHH(1)7氯6去甲基四環(huán)素HHCl(2)四環(huán)素HCH3H(3)5羥基四環(huán)素（土霉素）OHCH3H(4)7氯四環(huán)素（金霉素）HCH3Cl(5)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一些四環(huán)素類抗生素四環(huán)類抗生素的定向生物合成 在生產(chǎn)金霉素時(shí)需添加氯化物作為前體，而當(dāng)生產(chǎn)四環(huán)素時(shí)，那么必須要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或M-促進(jìn)劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四環(huán)素產(chǎn)物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過(guò)程中添加適量的甲基化反響抑制劑如磺胺嘧啶鈉，能夠獲得去甲基金霉素。 非基因改變定向生物合成的研究進(jìn)展

6、 盡管近年來(lái)基因改變的定向生物合成開(kāi)展很快，但利用非遺傳操作定向生物合成原理尋找新的生理活性物質(zhì)的研究還在不少實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)進(jìn)行，特別是對(duì)一些肽類如環(huán)孢菌素A、aureobasidins及糖肽類如替考拉寧產(chǎn)生菌的定向生物合成研究取得了很大的進(jìn)展。二、添加外源酶抑制劑的雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 雜交生物合成hybrid biosynthesis似乎可以理解為是一種“強(qiáng)化的非遺傳定向生物合成，如在苦霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵過(guò)程中添加聚乙酰途徑中-酮酯?；铣擅敢种苿┚€蘭菌素(cerulenin)，使其失去合成苦霉素大環(huán)內(nèi)酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中添加泰樂(lè)菌素大環(huán)

7、內(nèi)酯苷元(protylonolide)，使其與苦霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)生的糖基結(jié)合，得到一種被稱之為M4365G1的雜合抗生素(hybrid antibiotic)。 雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2COOH2CH3COOH5CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideDesosaminePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在淺藍(lán)菌素存在下，用苦味霉素產(chǎn)生菌（S.sp.AM4900） 與protylonolide 雜交生物合

8、成M4365G雜交生物合成產(chǎn)物工業(yè)化的可能性 盡管通過(guò)雜交生物合成能夠得到一些新的抗生素，但由于所添加的淺藍(lán)菌素本身就是一種昂貴的抗生素，再那么所添加的苷元的結(jié)構(gòu)受到限制，所以這種方法似乎沒(méi)有很大的實(shí)際意義。 三、非定向誘變的突變生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)突變生物合成mutational biosynthesis：突變生物合成是指野生型產(chǎn)生菌經(jīng)化學(xué)或物理等因素誘變處理后，喪失合成原來(lái)次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突變株時(shí)添加某種外源物質(zhì)，參與生物合成以獲得新的次級(jí)代謝產(chǎn)物的過(guò)程。另外，突變生物合成也包括由于突變而引起產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。突變生物合成原理阻斷突變株的類型

9、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株： 由于編碼菌體生長(zhǎng)之必須的酶的基因發(fā)生了突變，而使菌體不能生長(zhǎng)，導(dǎo)致不能合成次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，這類突變株也可以稱為初級(jí)代謝阻斷突變株。獨(dú)需型突變株： 這種突變株的生長(zhǎng)和初級(jí)代謝正常，但由于編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的某一基因發(fā)生突變，而使喪失了合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。這是突變生物合成所需要的突變株。雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級(jí)代謝酶的基因上，也發(fā)生在編碼次級(jí)代謝酶的基因上。突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn).野生型產(chǎn)生菌獨(dú)需型突變株AB正常途徑某抗生素阻斷變株A阻斷變株BAB+BA+ABABA，B為某一抗生素分子結(jié)構(gòu)的兩個(gè)部分AB為發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)阻斷變株的代謝產(chǎn)物BA為發(fā)酵培

10、養(yǎng)時(shí)添加的的結(jié)構(gòu)類似物ABAB即為新的雜合抗生素利用獨(dú)需型突變株合成產(chǎn)生新抗生素的根本原理AB突變生物合成的根本流程.出發(fā)菌株的選擇誘變處理阻斷突變株篩選瓊脂塊法選擇有生理活力的突變株無(wú)生理活力的突變株搖瓶復(fù)篩有生理活力的突變株無(wú)生理活力的突變株區(qū)段合成產(chǎn)物，連接酶等生化特性的研究有區(qū)段合成產(chǎn)物、無(wú)連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物A有連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物B有連接酶等活性的突變株發(fā)酵培養(yǎng)添加結(jié)構(gòu)類似物A或B樣品收集TLC、HPLC檢測(cè)及制備結(jié)構(gòu)檢測(cè)突變生物合成產(chǎn)生的新抗生素.菌種抗生素特殊營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)物新抗生素伊尼奧小單孢菌西梭霉素DOS鏈霉胺等突變霉素1等絳紅小單孢菌慶大霉素DOS鏈霉胺等

11、2羥基GM等紅霉素鏈霉菌紅霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鑒別弗氏鏈霉菌新霉素DOS鏈霉胍等雜交霉素A，B加利利鏈霉菌阿克拉霉素阿克拉酮紫紅霉酮等11羥基阿克拉霉素A灰色鏈霉菌鏈霉素紫紅霉酮等2脫氧鏈霉胍streptomutin A卡那霉素鏈霉菌卡那霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基GM等雪白鏈霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鑒明核糖苷鏈霉菌核糖霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基RSMC等普拉特鏈霉菌普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Omycaminosyl narbonolide龜裂鏈霉菌巴龍霉素DOS鏈霉胍雜交霉素C巴龍鏈霉菌

12、尼可霉素尿嘧啶嘧啶尼可霉素Z等唐德鏈霉菌紅霉素生物合成途徑.丙酰CoA丙酰SACP甲基丙二酰CoA甲基丙二酰SACP丙酰丙酰SACP聚酮體途徑6脫氧紅霉內(nèi)脂B紅霉內(nèi)脂BTDPL碳霉糖 葡萄糖TDPD葡萄糖3O碳霉糖基紅霉內(nèi)脂TDP脫氧氨基己糖 紅霉素D紅霉素C紅霉素A紅霉素E紅霉素B縮合酶突變株產(chǎn)生的新蒽環(huán)類抗生素.RR1R2道若霉素（原株產(chǎn)生）OCH3COCH3OH亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生）OCH3COCH2OHOH13雙氫道若霉素（變株產(chǎn)生）OCH3CHOHCH3OH13雙氫洋紅霉素OHCOCH3OH11去氧道若霉素（變株產(chǎn)生）OCH3COCH2OHH11去氧亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生）OCH3

13、CH2CH3HBaumycinA*（原株產(chǎn)生）OCH3CH2COCH3OHFeudomycin A（變株產(chǎn)生）OCH3CH2CH3OHFeudomycin BOCH3CH2COCH3OH突變株產(chǎn)生的一些新的次級(jí)代謝產(chǎn)物.原菌種原抗生素突變株產(chǎn)生的新抗生素普拉特鏈霉菌普拉特霉素demycarosyl普拉特霉素9dehydromycarosyle普拉特霉素波賽鏈霉菌紫產(chǎn)色鏈霉菌柔紅霉素燼灰紅菌素阿霉素燼灰紅菌素X波賽鏈霉菌baumycinoxaunomycin棘孢小單孢菌慶大霉素小諾霉素生金鏈霉菌四環(huán)素去甲基四環(huán)素生金鏈霉菌金霉素去甲基金霉素龜裂鏈霉菌土霉素去甲基土霉素吸水鏈霉菌carriomyc

14、incarromycinA我國(guó)應(yīng)用突變生物合成原理找到的小諾霉素.2H2SO4慶大霉素和小諾霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)抗生素R1R2分子式硫酸慶大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4硫酸慶大霉素C1aHNH2C19H39N5O72H2SO4硫酸慶大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4小諾霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)微生物原生質(zhì)體融合，即是指將雙新株的微生物細(xì)胞分別通過(guò)酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲溶液的條件下混合，并參加物理的如電融合或化學(xué)的(如聚乙二醇)或生物的如仙臺(tái)病毒助融條件，使雙親株的原生質(zhì)發(fā)生相互凝

15、集，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)融合，核融合，此后發(fā)生基因組間的交換，重組，進(jìn)而可以在適宜的條件下再生出微生物細(xì)胞壁，獲得重組子的過(guò)程。利用微生物原生質(zhì)融合尋找新抗生素的根本原理是來(lái)源于兩種產(chǎn)生不同抗生素的產(chǎn)生菌的融合子，有可能將它們的局部生物合成基因整合在一起而產(chǎn)生新的雜合抗生素；另一個(gè)原理是由于抗生素產(chǎn)生菌中存在著沉默基因，當(dāng)這些沉默基因受到外源物質(zhì)刺激后，有可能被激活而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)與親株完全不同的新的抗生素。 應(yīng)用這種方法獲得的第一個(gè)新抗生素是吲哚佐霉素indloizomycin：其親株為鏈霉素產(chǎn)生菌灰色霉菌和天神霉素istamycin產(chǎn)生菌天神鏈霉菌S. tenjimariensis。第二節(jié)生物合成途徑的基

16、因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)組合生物合成Combinatorial biosynthesis 是一種通過(guò)對(duì)天然產(chǎn)物生物合成途徑中的基因進(jìn)行中斷、置換及重組等操作，改變?cè)瓉?lái)抗生素產(chǎn)生菌或其他天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌生物合成代謝產(chǎn)物的途徑，產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)的“非天然的天然雜合產(chǎn)物unnatural natural hybrid compounds的技術(shù)或方法。 組合生物合成的潛能 potential重組、組合、互補(bǔ)、替換 R=可利用的基因 n=基因的等位形式化合物數(shù)Rn R=4, n=4 Compounds=44=256組合生物合成的原理 生物合成酶基因的結(jié)構(gòu)和組成 生物合成酶基因的特異性及底物寬容性 生物

17、合成酶基因之間的相互作用 生物合成途徑的研究根底一、具有聚酮體生物合成途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 一些具有聚酮體生物合成polyketide synthases，PKSs途徑的“天然產(chǎn)物，如紅霉素、阿維菌素、泰樂(lè)菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司和利福霉素等可采用組合生物合成。 具PKS途徑的抗生素藥物類別 化 合 物 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素四環(huán)類抗生素 四環(huán)素、金霉素、土霉素抗腫瘤抗生素 柔紅霉素，阿克拉霉素、enediynes 抗寄生蟲(chóng)藥 avermectin，nemadectin 免疫抑制劑 FK506, rapamycin 抗真菌藥 兩性霉素，制霉菌素

18、心血管藥物 lovastatin,，compactin獸藥莫能星（monensin），泰樂(lè)菌素 (tylosin)，鹽霉素1、紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成 通過(guò)操作PKS的模塊中單個(gè)基因的組合生物合成； 在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過(guò)量表達(dá)組合生物合成產(chǎn)物； 通過(guò)操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 ； 通過(guò)操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成。紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成的可能性參與紅霉素生物合成的PKSs，或6脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS有6個(gè)模塊組成，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)合成聚酮體中的一局部。由于各模塊之間的協(xié)調(diào)性，以及每個(gè)模塊延伸單位的選擇、功能和

19、立體化學(xué)性質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域，因此，就有可能通過(guò)對(duì)PKSs結(jié)構(gòu)域或模塊的操作獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物。由于具有聚酮體結(jié)構(gòu)的化合物其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和具有眾多的立體異構(gòu)體，因而，難以用常規(guī)的化學(xué)方法來(lái)獲得。 紅霉素的生物合成途徑 PKS中的每一個(gè)模塊的組成酮基合成酶ketosynthase，KS?；D(zhuǎn)移酶acyl transferase，AT?；d體蛋白acyl carrier protein，ACP-酮基修飾酶：包括酮基復(fù)原酶ketoreductase，KR、脫氫酶dehydrogenase，DH和烯酰復(fù)原酶enoylreductase，ERDEBS含有編碼三個(gè)獨(dú)立的多肽亞單位的6個(gè)模塊大多數(shù)典型的聚

20、酮體合成途徑的產(chǎn)物包括對(duì)PKS產(chǎn)物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進(jìn)行糖苷化以及通過(guò)細(xì)胞色素P450進(jìn)行氧化。圖中所示的LD為裝載域loading domains，TE為硫酯酶esterases。 1通過(guò)操作PKS的模塊中單個(gè)基因的組合生物合成 一是用利福霉素PKS模塊2中的DH/ER/KR結(jié)構(gòu)域取代紅霉素PKS模塊2中的KR；二是將模塊5中的KR缺失；三是用利福霉素模塊2中的丙二酰特異性AT取代模塊6中的甲基丙二酰特異性的AT，將得到一個(gè)發(fā)生三重突變的PKS產(chǎn)物。 2在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過(guò)量表達(dá)組合生物合成產(chǎn)物 將 開(kāi)發(fā)成能夠表達(dá)PKS產(chǎn)物需要解決的問(wèn)題主要有三個(gè)方面：一是能夠功能性表達(dá)巨大的蛋白

21、330kDa；二是PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺酰化；三是聚酮體途徑中的前體物質(zhì)，特別是2S甲基丙二酰CoA在中不存在。 Pfeifer等的工作包括：運(yùn)用來(lái)源于枯草芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶NRPS基因簇的磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶phosphopantetheinyl transferase基因sfp，以對(duì)PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺?；贿^(guò)量表達(dá)中的丙酰CoA合成酶基因prpE，擾亂丙酰CoA代謝途徑，以及過(guò)量表達(dá)來(lái)自的丙酰CoA羧化酶基因pcc，使丙酰CoA轉(zhuǎn)化為2S甲基丙二酰CoA 3通過(guò)操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 通過(guò)對(duì)DEBS模塊在

22、和體外的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)在PKS裝配過(guò)程中那些短的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的“連接件是至關(guān)重要的成分。研究發(fā)現(xiàn)在相繼非共價(jià)連接的模塊中，其氨基和羧基末端存在有多肽內(nèi)連接件，這種連接件與單個(gè)多肽內(nèi)的模塊之間的連接件不同。因此，使用一種適宜的連接件就有可能允許雜合的模塊之間進(jìn)行功能性連接。 a：已經(jīng)鑒定了不同的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的連接件，并由此指導(dǎo)合成模塊之間的聚酮體中間體，這里需要適宜的氨基和羧基末端連接配對(duì)，以產(chǎn)生功能性連接模塊；b：在構(gòu)建功能性互補(bǔ)體時(shí)，可以使用編碼來(lái)源于不同微生物多個(gè)模塊的全亞基；如下圖：來(lái)源于苦霉素picromycin的PKSPikAI和PikAII，與來(lái)源于竹桃霉素oleandomyc

23、in的PKSOleA3相結(jié)合。 4通過(guò)操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由自然界中植物、真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的很多具有生理活性的糖苷類化合物的分析發(fā)現(xiàn)，連接在苷元上的糖基的結(jié)構(gòu)大多為6-脫氧己糖6-deoxyhexoses, 6DOHs。據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些具有生理活性的糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)上含有70多種不同的6-脫氧己糖。6-脫氧己糖的種類具有生理活性的化合物產(chǎn)生菌*D-Desosamine紅霉素竹桃霉素苦霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光輝霉素烏達(dá)霉素Landomycin S.argillac

24、eusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose光輝霉素S.argillaceusD-Mycarose光輝霉素S.argillaceusD-Mycaminose泰樂(lè)星S.fradiaeD-Mycinose泰樂(lè)星S.fradiaeD-Mycosamine制霉菌素S.nourseiL-Dihydrostreptose鏈霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose紅霉素巨大霉素泰樂(lè)星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素S.sphe

25、roidesL-Rhodinose烏達(dá)霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceoruberL-Daunosamine柔紅霉素S.peucetiusL-NogaloseNogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素S.galilaeusL-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素S.galilaeus由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的結(jié)構(gòu)特

26、性具有單糖殘基的化合物：烏達(dá)霉素A、柔紅霉素、urdamycin A和rebeccamycin；具有雙糖殘基的化合物：光輝霉素mithramycin；具有三糖殘基的化合物：烏達(dá)霉素Aurdamycin A和光輝霉素前者同時(shí)具有單糖和三糖殘基，后者同時(shí)具有雙糖和三糖殘基；以O(shè)-糖苷鍵連接的化合物：紅霉素A、光輝霉素、柔紅霉素和烏達(dá)霉素A；以C-糖苷鍵連接的化合物：烏達(dá)霉素A；以N-糖苷鍵連接的化合物：rebeccamycin。由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) a通過(guò)將竹桃霉素產(chǎn)生菌中齊墩果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在不同的中的表達(dá)，得到了3O鼠李糖基紅霉素和6dEB衍生物，以及一個(gè)des

27、osaminylated tylactone；b改造來(lái)源于刺孢霉素calicheamicin產(chǎn)生菌的基因，可以得到一個(gè)新的脫氧氨基糖，并將其附著在產(chǎn)生的苷元上； c在產(chǎn)生菌中構(gòu)建desosamine的途徑，然后導(dǎo)入通過(guò)遺傳操作的DEBS，可以得到具有新穎結(jié)構(gòu)的desosaminylated大環(huán)內(nèi)酯類文庫(kù)。 將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈霉菌中編碼竹桃霉素oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基因oleGII，該酶負(fù)責(zé)將相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移到8，8a-脫氧竹桃內(nèi)酯8，8a-deoxyoleandolide的4位羥基上，整合到紅霉素產(chǎn)生菌eryBV缺失突變株中，eryBV基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將L-mycarose

28、糖基轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯6-deoxyerythronolide甙元的相同位置，并進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果得到了將天然糖基L-rhamnose轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯4位的新紅霉素衍生物，其具有抗菌活性， 將泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編碼mycaminose糖基轉(zhuǎn)移酶基因tylM2整合到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株SGT2，分別缺失聚酮體合成酶基因、mycarose和desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具有合成L-mycarose和D-desosamine的能力，并使之表達(dá)，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中外源參加16-元環(huán)的泰樂(lè)酮tylactone，結(jié)果得到一種新的泰樂(lè)星衍生物5-O-desosaminyl-tyl

29、actone，如圖所示。說(shuō)明泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶TylM2能夠識(shí)別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。這兩個(gè)例子同時(shí)也說(shuō)明抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶具有較寬的底物專一性。5通過(guò)表達(dá)雜合基因方法的組合生物合成 第一個(gè)例子是應(yīng)用有些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素3位或糖基4位的羥基?；富颍鼓承┐蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素在相應(yīng)的位置?；?異戊酰螺旋霉素來(lái)自碳霉素的4異戊酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的carE基因 ；2丙酰螺旋霉素來(lái)自麥迪霉素的4丙?；傅膍pt基因；3乙酰泰樂(lè)菌素等來(lái)自碳霉素的3O乙酰轉(zhuǎn)移酶的acyA基因。 引入外源酶基因產(chǎn)生雜合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu)R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3

30、 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH32、蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生菌的 組合生物合成略 蒽環(huán)類抗生素是一類臨床上非常重要的抗腫瘤抗生素，它們同樣是PKS生物合成途徑，因此，通過(guò)以下集中組合生物合成的方法，可以得到一系列“非天然的天然雜合化合物。1通過(guò)破壞靶基因的組合生物合成 通過(guò)基因框內(nèi)的誘變或缺失，或插入抗生素耐藥基因盒的方法，可以將所選擇的靶基因特異性地鈍化； 盡管靶基因的破壞可以得到新的化合物，但會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果，這是因?yàn)橐环矫嬗捎跇O性效應(yīng)影響下游基因的表達(dá)，另一方面受到由于外源DNA片斷的插入造成的反義RNA合成影響上游基因。 1通過(guò)破壞靶基因的組合生物合成

31、在光神霉素mithramycin產(chǎn)生菌中，破壞編碼葡萄糖1磷酸胸苷5三磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的基因mtmD后，獲得了兩個(gè)四環(huán)類的光神霉素衍生物：premithramycinone和4脫甲基premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗腫瘤生物活性與光神霉素相似，且有趣的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)與來(lái)源于黑曲霉的神經(jīng)肽受體抑制劑BMS非常相似，如下圖。 通過(guò)基因破壞后得到的兩個(gè)光神霉素衍生物和BMS-192548 2通過(guò)表達(dá)雜合基因方法的組合生物合成 來(lái)源于的urdE基因，編碼一種氧化酶，其可能涉及到將1分子氧引入到烏達(dá)霉素結(jié)構(gòu)中； 在控制啟動(dòng)子ermE的條件下，將其在丁省霉素C產(chǎn)

32、生菌中表達(dá)，產(chǎn)生一種新的雜合化合物，6羥基丁省霉素C，如下圖。 通過(guò)將烏達(dá)霉素產(chǎn)生菌的urdE基因在丁省霉素C產(chǎn)生菌 中表達(dá)，得到一種雜合產(chǎn)物6羥基丁省霉素C2通過(guò)表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 另外一個(gè)實(shí)例是，將柔紅霉素產(chǎn)生菌中編碼11-aklavinone-羥化酶的基因dnrF，在阿克拉霉素產(chǎn)生菌中表達(dá)，結(jié)果得到了一種新的雜合化合物，11羥基阿克拉霉素A，如下圖。 這種羥基化的產(chǎn)物，其對(duì)白血病細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的生物活性比阿克拉霉素要強(qiáng)。 雜合化合物11羥基阿克拉霉素A的組合生物合成 2通過(guò)表達(dá)雜合基因方法 的組合生物合成 通過(guò)這種組合生物合成的方法，已經(jīng)獲得了數(shù)個(gè)雜合糖苷化的丁省霉素，

33、如用含有一個(gè)完整埃羅霉素elloramycin基因簇具有產(chǎn)生8去甲基丁省霉素C的能力的黏粒轉(zhuǎn)化烏達(dá)霉素產(chǎn)生菌或光神霉素產(chǎn)生菌，可以得到四種新的糖苷化合物：齊墩果糖基、鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和雙齊墩果糖基丁省霉素C，如下圖。 有趣的是，這些脫氧糖在烏達(dá)霉素和光神霉素苷元上的附著位置，與在埃羅霉素的附著位置不同。說(shuō)明，這些聚酮體的糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物寬泛性。 雜合糖苷化丁省霉素的組合生物合成 能夠被ElmGT糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的一些 糖基和elloramycin甙元的結(jié)構(gòu) 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 通過(guò)鈍化dnmV基因，得到一個(gè)柔紅霉素和

34、阿霉素產(chǎn)生菌的阻斷突變株，dnmV基因編碼4酮基復(fù)原酶，其與合成這類抗生素結(jié)構(gòu)中的脫氧糖，柔毛霉胺的合成有關(guān)。 分別將阿維菌素產(chǎn)生菌中編碼合成齊墩果糖的基因avrE，以及紅霉素產(chǎn)生菌中編碼合成mycarose的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻斷突變株中。 由于重組工程菌中的外源基因表達(dá)的4-酮基復(fù)原酶的特性與柔紅霉素產(chǎn)生菌中的4-酮基復(fù)原酶不同，前者具有非對(duì)映立體催化特性而能夠形成L-epidaunosamine表柔毛霉氨。而突變株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基轉(zhuǎn)移酶的能力仍然保持，且由于糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性較差而不影響將表柔毛霉氨連接在原來(lái)的蒽環(huán)酮上，從而得到4-表柔紅霉素和4

35、-表阿霉素，如下圖。表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建二、具有非核糖體生物合成肽類途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 具有非核糖體生物合成途徑none ribosomal peptide synthases，NRPSs的環(huán)肽或糖肽類“天然產(chǎn)物，如萬(wàn)古霉素、博萊霉素、環(huán)孢菌素A和埃坡霉素等進(jìn)行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。Chloroeremomycin 生物合成 1小分子準(zhǔn)備 在酶的催化下生成裝配過(guò)程中需要的小分子化合物，對(duì)于萬(wàn)古霉素族糖肽類抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L-b-epivancosamine；2裝配 上步準(zhǔn)備好的氨基酸通過(guò)腺苷化反響adenylation

36、轉(zhuǎn)換成為腺苷酸，而后與鄰近肽載體蛋白peptide carrier protein, PCP上的巰基形成硫酯thiolation，PCP之間的縮合功能域condensation催化肽鍵形成。經(jīng)過(guò)幾個(gè)延伸過(guò)程，最后TE域?qū)⑼瓿傻碾那邢?。有時(shí)過(guò)程中還會(huì)有差向異構(gòu)作用(epimerisation)。3裝配后修飾 在這步反響中通常進(jìn)行氧化反響和糖基化，對(duì)于有的化合物還存在N端甲基化反響。萬(wàn)古霉素的生物合成 另?yè)?jù)研究，天然的萬(wàn)古霉素生物合成共有35步，其先以五種自由的氨基酸單體合成一線形的七肽，然后芳基側(cè)鏈在交聯(lián)酶的催化下適時(shí)地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-ep

37、i-vancosamine在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下連接到七肽骨架上。萬(wàn)古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體 萬(wàn)古霉素生物合成的逆向合成分析圖 在萬(wàn)古霉素家族中發(fā)現(xiàn)的糖基 GtfE糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并將UDP-glucose轉(zhuǎn)移至七肽骨架上 GtfD糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并將4epivancosamine連接至萬(wàn)古霉素骨架上 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀糖肽類抗生素的組合生物合成主要有4條途經(jīng):第一，提供新的氨基酸單體，或者是利用生物合成途經(jīng)中的酶來(lái)催化生成新的我們所需要的氨基酸單體，使合成新的七肽骨架;第二，改變七肽NRPS裝配線上的基因，從而到達(dá)重新設(shè)計(jì)生物合成途經(jīng)的目的;第三，在七肽裝配之后

38、，干預(yù)修飾酶tailoring作用的步驟，包括N甲基化、酪氨酸的羥化等;第四，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將不同結(jié)構(gòu)的糖基與不同苷元連接以及連接不同的個(gè)數(shù)，從而產(chǎn)生具有不同生理活性的最終產(chǎn)物。因此糖苷化酶可以作為一種制備各種不同糖苷化合物的催化劑，有可能從中找到具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新活性物質(zhì)。2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Solenberg等從萬(wàn)古霉素產(chǎn)生菌東方擬無(wú)枝酸菌中克隆到了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE和gtfD，并從chloroeremomycin產(chǎn)生菌中克隆到了3個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfA、gtfB和gtfC;將gtfB和gtfE在大腸埃希氏菌中表達(dá)，研究了其體外活性。結(jié)果說(shuō)明當(dāng)TDP-葡萄糖

39、存在時(shí)，從大腸埃希氏菌中表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB和GtfE能夠在體外將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素糖苷上，從而得到中間體DVVdesvancosaminyl vancomycin;當(dāng)?shù)孜飺Q為UDP葡萄糖，UDP-D-木糖時(shí)，仍然能夠轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素糖苷上;GtfE也能夠?qū)DP/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到無(wú)糖基化的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能將化合物A47934糖基化，說(shuō)明GtfE相對(duì)于GtfB底物特異性差。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀在Matsushima等建立地?zé)o糖基化合物A47934產(chǎn)生菌豐加鏈霉菌Streptomyces toyocanesis基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的根底上，

40、Solenberg等還成功地將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE的質(zhì)粒導(dǎo)入到豐加鏈霉菌中，得到了糖基化的A47934衍生物。GtfE和GtfB在體內(nèi)進(jìn)行的糖苷化反響 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Losey等采用化學(xué)和酶法合成了很多NDP-葡萄糖的類似物來(lái)研究GtfD和GtfE的催化活性。結(jié)果說(shuō)明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖類似物，TDP-葡萄糖類似物作為糖基供體，同時(shí)還可以采用脫氧葡萄糖類似物以及氨基在2、3、4、或6位的TDP/UDP-葡萄糖類似物作為糖基供體;更值得注意的是，一般來(lái)講GtfD將vancosamine連接至萬(wàn)古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GtfD還可以將4

41、-epi-vancosamine連接至GtfE以不同的糖基供體為底物所催化生成的衍生物上糖基化位點(diǎn)在2-脫氧的除外。這樣產(chǎn)生的帶有兩個(gè)氨基糖的萬(wàn)古霉素衍生物就提供了一種新的結(jié)構(gòu)，以便于繼續(xù)進(jìn)行類似于oritavancin的烷基化從而提高生物活性。2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Chen等從chloroeremomycin 的生物合成基因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，在大腸埃希氏菌中表達(dá)，并成功地在體外重建了從TDP-4-酮基-6-脫氧D-葡萄糖經(jīng)過(guò)C-2脫氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化(amination)、甲基化(methylation)、C-4酮基復(fù)原、C-5表構(gòu)異化等步驟得到了TDP-L epivancosami