TU1901紫外可見(jiàn)分光光度培訓(xùn)

1、1TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)使用與維護(hù)2一、紫外可見(jiàn)分光光度法l1、檢測(cè)原理 紫外可見(jiàn)分光光度法是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見(jiàn)光譜區(qū)的輻射的吸收來(lái)進(jìn)行分析的一種儀器分析方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電子在電子能級(jí)間的躍遷，可用于定性分析，廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定量分析。 3光電比色法目視比色法分光光度法紫外分光光度法可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法2、紫外可見(jiàn)分光光度法分類(lèi)比色分析法：利用比較待測(cè)溶液本身的顏色或加入試劑后呈現(xiàn)的顏色深淺來(lái) 測(cè)定溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度的方法按檢測(cè)器不同分:目視比色法和光電比色法。以人的眼睛來(lái)檢測(cè)顏色深淺的方法稱(chēng)目視比色法；以光電轉(zhuǎn)換器為檢測(cè)器

2、來(lái)區(qū)別顏色深淺的方法稱(chēng)光電比色法；根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的單色光的吸收程度不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法稱(chēng)為分光光度法。4 紫外可見(jiàn)分光光度法特點(diǎn)q 靈敏度高，可用于測(cè)定試樣中1%0.001%的微量組分，甚至可測(cè)定低至10-610-7的痕量成分；q準(zhǔn)確度較高，測(cè)定的相對(duì)誤差為2%5%，采用精密的分光光度計(jì)測(cè)量，相對(duì)誤差可減少到1%2%；q 分析速度快，操作簡(jiǎn)便；q 價(jià)格低廉，應(yīng)用廣泛。 紫外可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用q 紫外吸收光譜可用于芳香化合物及含共軛體系化合物的鑒定與結(jié)構(gòu)分析q 紫外與可見(jiàn)分光光度法均可用于定量分析。q紫外與可見(jiàn)分光光度法還可用于化學(xué)反應(yīng)平衡的研究。5q 按波長(zhǎng)范圍劃分： 可見(jiàn)分光光

3、度計(jì)（400-780nm） 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(200-1000nm) 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)類(lèi)型類(lèi)型q 按光路劃分： 單光束分光光度計(jì) 雙光束分光光度計(jì) 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)6光的吸收程度與光程長(zhǎng)的關(guān)系？ 朗伯定律7 比爾定律光的吸收程度與濃度的關(guān)系？8l2、朗伯比耳定律l 朗伯比耳定律是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)。l 當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，溶液的吸光度A是吸物質(zhì)的濃度C及吸收介質(zhì)厚度（吸收光程）的函數(shù)。其常用表達(dá)式為，式中為系數(shù)：l A = C9二、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)l一、基本結(jié)構(gòu) 光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器及信號(hào)指示系統(tǒng)五個(gè)結(jié)成部分。10分光光度計(jì)的主要部件和工作原理：0.57

4、5光源光源單色單色器器吸收吸收池池檢測(cè)檢測(cè)器器顯顯示示11TU-1901單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)比比值值光源光源單色單色器器吸收池吸收池檢測(cè)器檢測(cè)器顯顯示示光束分裂器光束分裂器12（一）光源 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)理想的光源應(yīng)具有整個(gè)紫外可見(jiàn)光域的連續(xù)輻射，強(qiáng)度應(yīng)高，且隨波長(zhǎng)變化能量變化不大。在可見(jiàn)光區(qū)，常用鎢絲燈（鹵鎢燈）為光源，波長(zhǎng)范圍為3202500nm。在紫外光區(qū)，常用氫燈、氘燈為光源，波長(zhǎng)范圍為200375nm。 TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)光源：鹵鎢燈與氘燈。 以下圖片是該儀器的光源室及光源燈： 13TU-1901光源室圖片光源室聚光鏡14TU-1901光源燈圖

5、片鎢燈氘燈15l （二）單色器l 單色器是將光源發(fā)射的復(fù)合光分解為單色光的光學(xué)裝置。l 單色器一般由五部分組成：入光狹縫，準(zhǔn)光器，色散器，投影器，出光狹縫。l 色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡和光柵。TU-1901采用全息光柵，進(jìn)一步降低儀器的雜散光，使儀器分析更加準(zhǔn)確。l 單色器的狹縫設(shè)計(jì)一定的寬度，經(jīng)過(guò)狹縫的單色光是一個(gè)具有一定光譜寬度的譜帶，稱(chēng)為光譜帶寬。從理論上講，狹縫的寬度愈小，波長(zhǎng)愈接近單色光，但帶寬太小，將使單色光的強(qiáng)度減小，使光電流信號(hào)減弱，降低信噪比。 16l 由于分子吸收光譜的吸收峰比較寬和平滑，一般情況下光譜帶寬26nm對(duì)分析結(jié)果影響不大。TU-1901配置

6、為固定狹縫，光譜帶寬為2nm。17l （三）吸收池l 吸收池是盛放樣品溶液的容器，它具有兩個(gè)相互平行、透光且具有精確厚度的平面。q 主要有石英吸收池和玻璃吸收池兩種。q 在紫外區(qū)須采用石英吸收池，可見(jiàn)區(qū)一般用玻璃吸收池。q 主要規(guī)格0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm和5.0cm注意事項(xiàng)：使用比色皿時(shí)，手執(zhí)比色皿兩側(cè)的毛面，嚴(yán)禁拿比色注意事項(xiàng)：使用比色皿時(shí)，手執(zhí)比色皿兩側(cè)的毛面，嚴(yán)禁拿比色 皿的透光面，盛放液體不能超過(guò)容積四分之三高度。皿的透光面，盛放液體不能超過(guò)容積四分之三高度。18l （四）檢測(cè)器l 檢測(cè)器是利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)。 常用的檢測(cè)器有光電池

7、、光電管及光電倍增管。 光電池 光電管 光電倍增管 TU-1810所用19三、分光光度計(jì)的檢驗(yàn)和維護(hù)l（一）分光光度計(jì)的檢驗(yàn)l 為保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，新制造、使用中和修理后的分光光度計(jì)都應(yīng)定期進(jìn)行檢定。單光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的檢定周期為1年，在此期間內(nèi)，儀器經(jīng)修理或?qū)y(cè)量結(jié)果有懷疑時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行檢定。20紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)主要檢驗(yàn)的幾項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)l 1、穩(wěn)定度l 2、波長(zhǎng)準(zhǔn)確度l 3、透射比準(zhǔn)確度l 4、基線(xiàn)平直度l 5、噪聲l 6、吸收池配套性l 現(xiàn)購(gòu)買(mǎi)儀器因配置不定，檢驗(yàn)技術(shù)指標(biāo)參數(shù)有所不一，用戶(hù)檢驗(yàn)時(shí)用依據(jù)廠家提供的指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。21吸收池的配套方法l 在同一光徑的石英吸收池裝

8、蒸餾水在220nm、700nm處測(cè)定；玻璃池收池裝30mg/L的重鉻酸鉀溶液在440nm處測(cè)定，裝蒸餾水在700nm處測(cè)定。l 實(shí)際工作中，可采用如下校準(zhǔn)方法：在測(cè)定波長(zhǎng)下，將吸收池磨砂面用鉛筆編號(hào)，于干凈的吸收池中裝入測(cè)定用溶劑，以其中一個(gè)為參比，測(cè)定其它吸收池的吸光度，若測(cè)定的吸光度為零或兩個(gè)吸收池的吸光度相等，即為配對(duì)吸收池。若不能配對(duì)，可選出吸光度最小的吸收池為參比，測(cè)定其它吸收池的吸光度，求出修正值。22l（二）TU-1901分光光度計(jì)測(cè)量條件的選擇l1、測(cè)量波長(zhǎng)的選擇l 通常都是選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)max作為測(cè)量波長(zhǎng)，稱(chēng)為最大吸收原則，以獲得最高的分析靈敏度。l2、適宜吸光

9、度范圍的選擇l 任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，這是由于測(cè)量過(guò)程中光源的不穩(wěn)定、讀數(shù)的不準(zhǔn)確或?qū)嶒?yàn)條件的偶然變動(dòng)造成的。23l 一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)透射比為15%65%（吸光度0.20.8)時(shí),濃度測(cè)量的相對(duì)誤差較小,當(dāng)A=0.434時(shí),濃度的相對(duì)誤差最小。在實(shí)際工作中，可通過(guò)調(diào)節(jié)待測(cè)溶液的濃度或選用適當(dāng)厚度的吸收池的方法，使測(cè)得的吸光度落在所要求的范圍內(nèi)。l 3、儀器狹縫寬度的選擇l 狹縫的寬度會(huì)直接影響到測(cè)定的靈敏度和校準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍。l 狹縫寬度過(guò)大時(shí)，入射光的單色光降低，校準(zhǔn)曲線(xiàn)偏離比耳定律，靈敏度降低；狹縫寬度過(guò)窄時(shí)，光強(qiáng)變?nèi)?，?shì)必要提高儀器的增益，隨之而來(lái)的是儀器噪聲增大，于測(cè)量不利。24

10、l 選擇狹縫寬度的方法是：測(cè)量吸光度隨狹縫寬度的變化。狹縫的寬度在一個(gè)范圍內(nèi)，吸光度是不變的，當(dāng)狹縫寬度大到某一程度時(shí)，吸光度開(kāi)始減小。因此，在不減小吸光度時(shí)的最大狹縫寬度，即是所欲選取的合適的狹縫寬度。25（三）分光光度計(jì)的保養(yǎng)和維護(hù)l 分光光度計(jì)是精密光學(xué)儀器，正確安裝、使用和保養(yǎng)對(duì)保持儀器良好的性能和保證測(cè)試的準(zhǔn)確度有重要作用。l 1、對(duì)儀器工作環(huán)境的要求：l （1）儀器應(yīng)安放在干燥的房間內(nèi)，使用溫度為1535，相對(duì)濕度不超過(guò)80%。l （2）儀器應(yīng)放置在堅(jiān)固的平穩(wěn)的工作臺(tái)上，且避免強(qiáng)烈的震動(dòng)或持續(xù)的震動(dòng)。l （3）室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)，且應(yīng)避免直射日光的照射。26l （4）電扇不宜直接向儀

11、器吹風(fēng)，以防止光源燈因發(fā)光不穩(wěn)定而影響儀器的正常使用。l （5）盡量遠(yuǎn)離高強(qiáng)度的磁場(chǎng)、電場(chǎng)及發(fā)生高頻波的電器設(shè)備。l （6）供給儀器的電壓AC220V10%，頻率50HZ1HZ單向交流電，最好配置交流穩(wěn)壓器，功率不小于500VA,室內(nèi)應(yīng)有地線(xiàn)并保證儀器良好接地。l （7）避免在有硫化氫等腐蝕性氣體的場(chǎng)所使用。27l 2、儀器保養(yǎng)和維護(hù)方法l （1）光源 光源的壽命是有限的，為了延長(zhǎng)光源使用壽命，在不使用儀器時(shí)不要開(kāi)光源燈，應(yīng)盡量減少開(kāi)關(guān)次數(shù)。在短時(shí)間的工作間隔內(nèi)可以不關(guān)燈。剛關(guān)閉的光源燈不能立即重新開(kāi)啟。l 儀器連續(xù)使用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)3h。若需長(zhǎng)時(shí)間使用，最好間歇30min。l 如果光源燈亮度明

12、顯減弱或不穩(wěn)定，應(yīng)及時(shí)更換新燈。更換后要調(diào)節(jié)好燈絲位置，不要用手直接接觸窗口或燈泡，避免油污沾附。若不小心接觸過(guò)，要用無(wú)水乙醇擦試。28TU-1901分光光度計(jì)對(duì)光源的使用要求：l 1、分光光度計(jì)安裝調(diào)試正常后，如無(wú)特殊情況不能隨意搬動(dòng)儀器機(jī)體，避免帶來(lái)的震動(dòng)引起光源燈及聚光鏡等螺絲松動(dòng)，導(dǎo)致光斑偏離。l 2、正常情況下嚴(yán)禁分析人員打開(kāi)光源室頂蓋，避免灰塵及其他物質(zhì)進(jìn)入影響聚光鏡面。l 3、儀器開(kāi)機(jī)在自檢過(guò)程中如提示鎢燈或氘燈檢測(cè)錯(cuò)誤，聯(lián)機(jī)使用時(shí)工作站初始化可能提示鎢燈強(qiáng)度弱等現(xiàn)象，可關(guān)機(jī)后兩分鐘重新啟動(dòng)，若仍是此現(xiàn)象報(bào)告相關(guān)技術(shù)人員等待處理或直接聯(lián)系廠家工程師到現(xiàn)場(chǎng)處理。29l 4、該儀器配

13、備的氘燈屬日本進(jìn)口，使用壽命在5000小時(shí)左右，因現(xiàn)有檢測(cè)項(xiàng)目使用光源均來(lái)自鎢燈光源，為延長(zhǎng)氘燈的使用期限，請(qǐng)?jiān)趦x器開(kāi)機(jī)自檢完成后進(jìn)入系統(tǒng)應(yīng)用將其關(guān)閉。30l 5、如光源燈需要更換，請(qǐng)技術(shù)人員按照說(shuō)明書(shū)上光源的更換方法進(jìn)行更換。l （2）單色器 單色器是儀器的核心部分，裝在密封盒內(nèi)，不能拆開(kāi)。選擇波長(zhǎng)應(yīng)平衡地轉(zhuǎn)動(dòng)不可用力過(guò)猛。為防止色散元件受潮生霉，必須定期更換單色器盒干燥劑（硅膠）。若發(fā)現(xiàn)干燥劑變色，應(yīng)立即更換。l （3）吸收池 必須正確使用吸收池，在使用后應(yīng)立即洗凈應(yīng)特別注意保護(hù)吸收池的兩個(gè)光學(xué)面。生物樣品、膠體或其它在池窗上形成薄膜的物質(zhì)要用適當(dāng)?shù)娜軇┫礈?。有色物質(zhì)污染，可用3mol/L

14、HCl和等體積乙醇的混合液洗滌。31l （4）檢測(cè)器 光電轉(zhuǎn)換元件不能長(zhǎng)時(shí)間曝光，且應(yīng)避免強(qiáng)光照射或受潮積塵。l （5）當(dāng)儀器停止工作時(shí)，必須切斷電源。l （6）為了避免儀器積灰和玷污，在停止工作時(shí)，應(yīng)蓋上防塵罩，可在樣品室及光源室內(nèi)放置硅膠袋防潮，但開(kāi)機(jī)時(shí)一定要取出。l （7）儀器若暫時(shí)不用要定期通電，每次不少于2030min，以保持整機(jī)呈干燥狀態(tài)，并且維持電子元器件的性能。l （8）每次使用后應(yīng)檢查樣品室是否積存有溢出溶液，經(jīng)常擦試樣品室，以防廢液對(duì)部件或光路系統(tǒng)的腐蝕。32 （9）定期進(jìn)行性能指標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題即與廠家或銷(xiāo)售部門(mén)聯(lián)系解決。33(四)TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的故障診

15、斷與維修34現(xiàn) 象原 因判 斷解 決接通電源儀器不動(dòng)作A.電源線(xiàn)接觸不良A.檢查電源線(xiàn)A.接好電源線(xiàn)B.保險(xiǎn)管熔斷B.檢查保險(xiǎn)管B.換保險(xiǎn)管(2A)C.電路故障C.整機(jī)檢查C.請(qǐng)與廠家聯(lián)系不能打印譜圖A.打印機(jī)故障A.檢查打印機(jī)A-B.請(qǐng)與廠家聯(lián)系B.儀器CPU板故障B.查CPU板故障C.儀器打印機(jī)連線(xiàn)松動(dòng)C.檢查打印連線(xiàn)是否松動(dòng)C.將連線(xiàn)插緊初始化異常ROM檢查A.內(nèi)存程序故障A.再次開(kāi)機(jī)檢查A.請(qǐng)與廠家聯(lián)系波長(zhǎng)原點(diǎn)A.波長(zhǎng)原點(diǎn)異常A.再次開(kāi)機(jī)檢查樣品池原點(diǎn)A.樣品池架驅(qū)動(dòng)原點(diǎn)異常A.移動(dòng)池架檢查A.取出妨礙物狹縫定位(TU-1901/TU-1810SPC)A.狹縫機(jī)構(gòu)故障B.機(jī)械連接松脫A

16、.擰緊連接機(jī)構(gòu)濾色片定位A.濾色片機(jī)構(gòu)故障A.再次開(kāi)機(jī)檢查A.請(qǐng)與廠家聯(lián)系鎢燈定位樣品室有擋光物A.再次開(kāi)機(jī)檢查A.請(qǐng)與廠家聯(lián)系A(chǔ).打開(kāi)樣品室A.取出擋光物A.鎢燈不亮B.打開(kāi)光源室B.換鎢燈氘燈定位A.樣品室有擋光物A.打開(kāi)樣品室A.取出擋光物氘燈不亮B.打開(kāi)光源室B.換氘燈C.打開(kāi)食品外殼C.換氘燈保險(xiǎn)管(0.5A)波長(zhǎng)檢查A.樣品室有擋光物A.打開(kāi)樣品室A.取出擋光物B.氘燈定位錯(cuò)B.打開(kāi)光源室B.解決氘燈錯(cuò)噪聲指標(biāo)異常A.光源老化A.能量方式測(cè)量A.更換光源B.樣品室不正B.550nm處觀察B.對(duì)正樣品室C.電壓低/強(qiáng)磁場(chǎng)C.檢查電壓/磁場(chǎng)源C.加穩(wěn)壓器/消除干擾D.接收器老化D.能量

17、方式測(cè)量D-F.請(qǐng)與廠家聯(lián)系E.前放板故障E.查前放板故障F.AD轉(zhuǎn)換器異常F.查驅(qū)動(dòng)板故障35四、可見(jiàn)分光光度法l 分光光度分析有兩種，一種是利用物質(zhì)本身對(duì)紫外及可見(jiàn)光的吸收進(jìn)行測(cè)定，另一種是生成有色化合物即“顯色”以后測(cè)定。36（一）顯色反應(yīng)l 在光度分析中，將試樣中被測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。l 能與被測(cè)組分生成有色物質(zhì)的試劑稱(chēng)為顯色劑。l 顯色反應(yīng)分為兩類(lèi)：絡(luò)合反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)。其中絡(luò)合反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。37l 對(duì)顯色反應(yīng)的要求：l（1）選擇性好l（2）靈敏度高l（3）有色絡(luò)合物的離解常數(shù)要小l（4）有色絡(luò)合物的組成要恒定，化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定。l（5）如果顯色劑有顏色

18、，則要求有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，以減小試劑空白。l（6）顯色反應(yīng)的條件要易于控制。38（二）、顯色劑l （1）、無(wú)機(jī)顯色劑l 許多無(wú)機(jī)試劑能與金屬離子發(fā)生顯色反應(yīng)用于光度分析，但由于靈敏度等原因，具有實(shí)用價(jià)值的僅有幾類(lèi)。l （2）有機(jī)顯色劑l 大多數(shù)有機(jī)顯色劑本身為有色化合物，與金屬離子反應(yīng)生成的化合物一般是穩(wěn)定的螯合物。顯色反應(yīng)的選擇性和靈敏度都較高，有些有色螯合物易溶于有機(jī)溶劑，可進(jìn)行萃取光度法。39質(zhì)檢中心分析中所用顯色劑：l（1）水中鐵含量的測(cè)定l 鄰菲啰啉l（2）磷酸鹽的測(cè)定l 鉬酸銨40（三）反應(yīng)條件的選擇l1、顯色劑用量l 為使顯色反應(yīng)更完全，加入過(guò)量的顯色劑是必要

19、的，但是顯色劑過(guò)量太多，有時(shí)會(huì)引起副反應(yīng)，當(dāng)顯色劑本身有色時(shí)會(huì)增大試劑空白。l 顯色劑的適宜用量可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。其方法是固定被測(cè)組分濃度和其它條件，取數(shù)份溶液，加入不同量的顯色劑測(cè)定其吸光度，繪制吸度光度（A）-濃度（c）關(guān)系曲線(xiàn)，一般可得下圖所示三種情況。41cRAAA000cRcRabba圖示 吸光度與顯色劑濃度的關(guān)系曲線(xiàn)（a）（b）（c）42l 上圖（a）曲線(xiàn)表明，在濃度ab范圍內(nèi)，吸光度出現(xiàn)穩(wěn)定值，可在ab間選擇合適的顯色劑用量。圖（b）曲線(xiàn)表明，顯色劑濃度在a b這一較窄的范圍內(nèi)，吸光度值比較穩(wěn)定，必須嚴(yán)格控制顯色劑濃度。圖（c）曲線(xiàn)表明，隨著顯色劑濃度增大，吸光度不斷增大，必須十

20、分嚴(yán)格地控制顯色劑用量。432、溶液酸度l 溶液的酸度對(duì)光度測(cè)定有顯著影響，它影響待測(cè)組分的吸收光譜、顯色劑的形態(tài)、待測(cè)組分的化合狀態(tài)及顯色化合物的組成。l 第一，酸度不同時(shí)，顯色化合物的組成和顏色可能不同。l 第二，溶液酸度變化，顯色劑的顏色可能發(fā)生變化，原因是很多有機(jī)顯色劑是酸堿指標(biāo)劑，其顏色隨pH值變化而變化。l 第三，溶液酸度過(guò)高會(huì)降低配合物穩(wěn)定性，特別是對(duì)弱酸型有機(jī)顯色劑和金屬離子形成的配合物影響較大。l 第四，溶液酸度過(guò)低會(huì)引起金屬離子水解生成氫氧化物沉淀。l 由于酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響很大，因此，某一顯色反應(yīng)最適宜的酸度必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。其方法是通過(guò)實(shí)驗(yàn)做吸光度A-pH關(guān)系曲線(xiàn)，

21、選擇曲線(xiàn)平坦部分對(duì)應(yīng)的pH值作為應(yīng)該控制的酸度范圍。443、溫度的影響l 大多數(shù)的顯色反應(yīng)在室溫下即可進(jìn)行，有些顯色反應(yīng)加熱至一定的溫度才能完成，而有些有色配合物在較高溫度下容易分解，因此，對(duì)不同的顯色反應(yīng)應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇其適宜的顯色溫度。l 由于溫度對(duì)光的吸收及顏色的深淺都有影響，因此在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，應(yīng)使溫度保持一致。454、顯色時(shí)間l 所謂顯色時(shí)間指的是溶液顏色達(dá)到穩(wěn)定時(shí)的時(shí)間。不少顯色反應(yīng)需要一定時(shí)間才能完成，而且形成的有色配合物的穩(wěn)定性也不一樣。因此必須在顯色后一定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行比色測(cè)定。通常有以下幾種情況：l 加入顯色劑后，有色配合物立即生成，并且生成的有色配合物很穩(wěn)定。

22、此時(shí)可在顯色后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。l 加入顯色劑后，有色配合物的形成需要一定時(shí)間，但生成的有色配合物也很穩(wěn)定。對(duì)這類(lèi)反應(yīng)可在完成顯色后旋轉(zhuǎn)一些時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。l 加入顯色劑后，有色溶液立即生成，但在放置后又逐漸褪色，對(duì)這類(lèi)反應(yīng)，應(yīng)在顯色后立即進(jìn)行測(cè)定。l 適宜的顯色時(shí)間和有色溶液的穩(wěn)定程度可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑起計(jì)算時(shí)間，每隔幾分鐘、幾十分鐘或數(shù)小時(shí)測(cè)定一次吸光度，繪制吸光度A-時(shí)間t曲線(xiàn)，從曲線(xiàn)確定適宜的顯色時(shí)間。465、溶劑l 有機(jī)溶劑常降低有色化合物的離解度從而提高顯色反應(yīng)的靈敏度。此外，有機(jī)溶劑還可能提高顯色反應(yīng)的速度，影響有色配合物的溶解度和組成等。

23、利用有色化合物在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性好，溶解度大的特點(diǎn)，可以選擇合適的有機(jī)溶劑，采用萃取光度法來(lái)提高方法的靈敏度和選擇性。47（三）參比溶液的選擇l 用參比溶液調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的吸光度為0，然后測(cè)定試樣溶液或標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。參比溶液的作用除了消除吸收池壁對(duì)入射光的反射和散射等影響外，合理選用時(shí)還可消除其它干擾，使測(cè)得的吸光度正確反映被測(cè)物的濃度，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。l 選擇參比溶液可分為以下幾種情況： 48l 溶劑參比 顯色劑及其它試劑均無(wú)色，被測(cè)溶液中又無(wú)其它有色離子時(shí)，可用溶劑（如蒸餾水或其它有機(jī)溶劑）作參比溶液。l 試劑參比 顯色劑本身有顏色，可用不加試樣的其它試劑作參比溶液。l 試液參比

24、顯色劑無(wú)色，被測(cè)溶液中有其它有色離子，可采用不加顯色劑的被測(cè)溶液作參比溶液。l 其它參比 當(dāng)顯色劑有色，試液中的有色成分干擾測(cè)定的可在一份試液中加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，然后加入顯色劑和其它試劑，以此作為參比溶液。另一種方法是用不含被測(cè)組分的試樣，與被測(cè)試樣同時(shí)進(jìn)行相同的處理得到平行操作參比溶液。49（四）定量分析l 工作曲線(xiàn)法l 對(duì)于單一組分的測(cè)定，工作曲線(xiàn)是實(shí)際工作中用得最多的一種定量方法。l 工作曲線(xiàn)的制作方法為：根據(jù)待測(cè)溶液的大概濃度，配制一系列濃度不等的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度范圍覆蓋待測(cè)溶液的濃度，以空白溶液為參比溶液，在選定的波長(zhǎng)下，分別測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫從標(biāo)，

25、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(xiàn)。l 在測(cè)定樣品時(shí)按同樣方法制備待測(cè)樣品溶液，測(cè)定其吸光度，在工作曲線(xiàn)上即可查出待測(cè)物的濃度。待測(cè)物濃度應(yīng)在工作曲線(xiàn)范圍內(nèi)（且使待測(cè)溶液濃度在曲線(xiàn)范圍中部最佳）。l 雜質(zhì)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度0.1g/L可在1525溫度下保存2個(gè)月， 濃度0.1g/L的雜質(zhì)用標(biāo)準(zhǔn)溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。50l 在一定條件下，工作曲線(xiàn)是一條直線(xiàn)，直線(xiàn)的斜率和截距可以用最小二乘法求得。l 工作曲線(xiàn)可以用一元線(xiàn)性方程表示：l y = a bl 式中，為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， y為相應(yīng)的吸光度。l 使用最小二乘法確定的直線(xiàn)稱(chēng)為回歸線(xiàn)，a、b稱(chēng)為回歸系數(shù)。l b是直線(xiàn)的斜率l a是直線(xiàn)的截距51圖示 工作曲線(xiàn)=5

26、10nm 可以用相關(guān)系數(shù)來(lái)表示線(xiàn)性關(guān)系的好壞。 相關(guān)系數(shù)越接近于1線(xiàn)性關(guān)系越好。一般的光度方法r0.999 工作曲線(xiàn)應(yīng)定期校準(zhǔn)。當(dāng)條件有變動(dòng)時(shí)，例如儀器經(jīng)過(guò)修理、更換光源、更換標(biāo)準(zhǔn)溶液、試劑（如顯色劑）重新配，都應(yīng)重新制作工作曲線(xiàn)。 質(zhì)檢產(chǎn)品分析的所有比色工作曲線(xiàn)制作周期為一年，校驗(yàn)周期三個(gè)月。校驗(yàn)方法采用單點(diǎn)對(duì)照法：配制兩組與所需校正的曲線(xiàn)相符合的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在工作波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，利用該工作曲線(xiàn)計(jì)算出相應(yīng)濃度，與配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度相比較，測(cè)得其回收率在95105%之間，說(shuō)明該工作曲線(xiàn)可繼續(xù)使用，如不符合需重新制作曲線(xiàn)。52（五）分光光度法的誤差l 1、方法誤差l 方法誤差是指分光光度法本身所產(chǎn)

27、生的誤差。誤差主要由溶液偏離比耳定律及溶液中干擾物質(zhì)影響所引起。l （1）溶液偏離比耳定律 分光光度法的理論基礎(chǔ)是朗伯-比耳定律l A=c bl 但在工作中常會(huì)碰到工作曲線(xiàn)發(fā)生彎曲的現(xiàn)象。大多是由于化學(xué)變化所引起的，使有色溶液的濃度與被測(cè)物的總濃度不成正比。53l （2）反應(yīng)條件的改變 顯色反應(yīng)多是分步進(jìn)行。溶液酸度、溫度、及顯色時(shí)間等反應(yīng)條件的改變，都會(huì)引起有色配合物的組成發(fā)生變化，從而使溶液顏色的深淺度發(fā)生變化，因而產(chǎn)生誤差。l 2、儀器誤差l 儀器誤差是指由使用分光光度計(jì)所引入的誤差。l （1）儀器的非理想性引起的誤差 復(fù)色光引起對(duì)比耳定律的偏離;波長(zhǎng)標(biāo)度尺未作校正時(shí)引起光譜測(cè)量的誤差,吸光度測(cè)量受吸光度標(biāo)度尺的誤差影響。l （2）儀器噪聲的影響 光度測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度受儀器噪聲的限制，測(cè)量樣品的