SDS-PAGE電泳

1、實驗四實驗四 蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子量的測定量的測定 SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳法v聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）是根據(jù)）是根據(jù)被分被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀的不同，的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的移動在電場的作用下，產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。它具有速度而分離的方法。它具有電泳和分子篩電泳和分子篩的的雙重作用。雙重作用。 一、實驗原理一、實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸

2、鈉）。（十二烷基硫酸鈉）。SDS是陽離子去污劑，作用有四：去是陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。（空間構(gòu)象破壞）折疊。（空間構(gòu)象破壞） 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)與SDS分子按比例分子按比例(1.4gSDS/g蛋蛋白質(zhì)白質(zhì))結(jié)合，形成結(jié)合，形成帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷的的SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷原有的電荷,因而因而降低或消除降低或消除了各種蛋白了各種蛋白質(zhì)分子之間質(zhì)分子之間天然的電荷差異天然的電荷差異，由于，

3、由于SDS與與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決遷移速度取決于分子大小于分子大小。 帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷的的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15KD到到200KD之間時，蛋白質(zhì)的之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：符合下式： logMW=K-bX，式中：式中：MW為分子量，為分子量，X為遷移率，為遷移率，k、b均為均為常數(shù)。常數(shù)。若將若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對的遷移率對分子分子量對數(shù)作圖量對數(shù)作圖

4、，可獲得一條，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS-PAGE SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線相相對對分分子子量量相對遷移率相對遷移率二、凝膠的原理二、凝膠的原理v聚丙烯酰胺（Acr）單體和交聯(lián)劑 N ， N 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis 在催化劑的作用下聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈。相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯(lián)起來就形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。 v雙丙烯酸銨決定交聯(lián)形成的程度，丙烯酰胺決定決定交聯(lián)的長度常用的催化劑（包括催化劑和加

5、速劑）常用的催化劑（包括催化劑和加速劑）（1）過硫酸銨）過硫酸銨 (AP) TEMED （四甲基乙二（四甲基乙二胺）系統(tǒng)胺）系統(tǒng)在 Acr 和 Bis 的溶液中放入這個催化系統(tǒng)后，過硫酸銨 （NH4）2S2O8 產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行（pH8.8)。 （ 2 ）核黃素）核黃素 TEMED 系統(tǒng)系統(tǒng)v 這是一個光激發(fā)的催化反應(yīng)。核黃素在光照下分解，被還原成無色型，但在有氧條件下，無色型又被氧化成有游離基的黃素環(huán)，使聚合作用開始。 凝膠的濃度：凝膠的濃度：v常用的所謂標(biāo)準(zhǔn)膠是指濃度為

6、7.5 的凝膠，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在此膠中電泳都能得到滿意的結(jié)果。當(dāng)分析一個未知樣品時，常常先用 7.5 的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用4 10的凝膠梯度來試測，選出適宜的凝膠濃度。 SDS-PAGE電泳系統(tǒng)有兩種電泳系統(tǒng)有兩種：（1）連續(xù)聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：）連續(xù)聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：凝膠全部有分離膠組成，凝膠全部有分離膠組成，不具備濃縮效應(yīng)。不具備濃縮效應(yīng)。（2）不連續(xù)的聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：）不連續(xù)的聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)： 有濃縮膠和分離膠組成。有濃縮膠和分離膠組成。 通過濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)通過濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) ，使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前，快、慢離使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前，快、慢

7、離子之間子之間濃縮成一薄層濃縮成一薄層，有利于提高電泳，有利于提高電泳的分辨率。的分辨率。三、三、 所用試劑：所用試劑： vAcr（acrylamide）/Bis 儲備液儲備液v10% (w/v) SDS ：vTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)v過硫酸銨過硫酸銨 (AP):10%現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用vTrisHCL緩沖系統(tǒng)，緩沖系統(tǒng)，v分離膠緩沖液分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）v濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8v電極泳緩沖液：電極泳緩沖液：使用的使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)：甘氨酸緩沖系統(tǒng)：pH 8.3內(nèi)含內(nèi)含

8、SDSv樣品緩沖液（樣品緩沖液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）v染色液（考馬斯亮藍(lán)染色液（考馬斯亮藍(lán) R-250）v脫色液：（脫色液：（ 甲醇：冰醋酸：水甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）v溴粉蘭：溴粉蘭：0.1%四、實驗步驟四、實驗步驟l. 貯液配制：貯液配制： v應(yīng)注意：應(yīng)注意：（1）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內(nèi)保存，）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內(nèi)保存，可放可放 l 2 個月。個月。 （2）過硫酸銨應(yīng)當(dāng)天配制。）過硫酸銨應(yīng)當(dāng)天配制。 （3）如有不溶物要過濾。）如有不溶物要過濾。 （4）顯色液用前再混和。）顯色液用前再混和。 （5）電極緩沖液用時稀釋）電極緩沖液

9、用時稀釋 10 倍。倍。 2. 安裝夾心式垂直板電泳槽安裝夾心式垂直板電泳槽 3.配膠：配膠：采用不連續(xù)系統(tǒng)采用不連續(xù)系統(tǒng)（1）分離膠的制備（）分離膠的制備（10ml，12%）：）： 蒸餾水蒸餾水 3.4ml Acr/Bis儲備液儲備液 4.0ml 分離膠緩沖液分離膠緩沖液 2.5ml 10% SDS 100l 10% APS 50l TEMED 5l按上述配方依次加入各種溶液，充分搖勻后灌按上述配方依次加入各種溶液，充分搖勻后灌入制膠架中。入制膠架中。 （2）濃縮膠的制備（）濃縮膠的制備（5ml，5%） 蒸餾水蒸餾水 2.85mlAcr/Bis儲備液儲備液 0.85ml濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖

10、液 1.25ml10% SDS 50l10% APS 25lTEMED 5l在灌入濃縮膠后插入樣品梳。在灌入濃縮膠后插入樣品梳。 4. 樣品的處理及點(diǎn)樣：樣品的處理及點(diǎn)樣： 將提取的蛋白質(zhì)（或標(biāo)準(zhǔn)蛋白）中加入等體將提取的蛋白質(zhì)（或標(biāo)準(zhǔn)蛋白）中加入等體積的上樣緩沖液，混勻，置于沸水浴中加熱積的上樣緩沖液，混勻，置于沸水浴中加熱5min，冷卻后經(jīng)，冷卻后經(jīng)10000rpm離心離心15min，取，取上清液點(diǎn)樣。上清液點(diǎn)樣。5.電泳：電泳：將制好膠的電泳槽放入底座中，加入電極緩沖將制好膠的電泳槽放入底座中，加入電極緩沖液，上層液中加入溴粉蘭指示劑，連接好電泳液，上層液中加入溴粉蘭指示劑，連接好電泳儀，

11、開始電泳。儀，開始電泳。濃縮膠恒壓濃縮膠恒壓75V，分離膠恒壓，分離膠恒壓120V，電泳時間，電泳時間約約90min。6.染色和脫色：染色和脫色：v當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣 1 cm 時，時，電泳結(jié)束。電泳結(jié)束。v將膠剝離，放入容器中，用蒸餾水清洗將膠剝離，放入容器中，用蒸餾水清洗2-3遍，倒入染色液染色遍，倒入染色液染色2-3h或靜置或靜置過夜。過夜。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗膠染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗膠2-3遍，以清除遍，以清除多余的染料，倒入多余的染料，倒入脫色液脫色液，置于脫色搖床上，置于脫色搖床上脫色，中間換脫色，中間換1-2次脫色液，直至背景色完全次脫色液，直至背景色完全脫掉。脫掉。v附：附： 樣品的制備樣品的制備 v稱取植物材料稱取植物材料 1 g ，放入研缽內(nèi)，加，放入研缽內(nèi)，加 pH8.0 提取液提取液 1 mL ，于冷水浴中研成勻漿，然后，于冷水浴中研成勻漿，然后