熒光定量PCR之絕對定量分析——標準曲線的繪制參考模板

1、熒光定量PCR之絕對定量分析標準曲線的繪制1. 絕對定量定義 絕對定量是用已知濃度的標準品繪制標準曲線來推算未知樣品的量。 將標準品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的CT值為縱坐標，繪制標準曲線，對未知樣品進行定量時，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。 * Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，即得到該擴增反應存在的線性關系 * 由樣品CT值，就可以計算出樣品中所含的模板量2. 絕對定量標準品標準品的一些標準* 必須用與擴增目的基因相同的引物進行擴增，并且擴增效率相同 * 標準品必須是

2、經過準確定量的（我們通常用的是ASP-3700紫外光/可見光微量分光光度計） * 標準品必須是標準化的（例如，同一化的細胞數(shù)） * 在每組實驗時，必須用相同的閾值設定來確定CT值 標準品可以是含有目的基因的線性化的質粒DNA，也可以是比擴增片段長的純化后的PCR產物，當然也可以是基因組DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標準品的核酸都必須保證穩(wěn)定。3. 標準品的制備 1 / 6 一般一條標準曲線取四到五個點，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的準確性。一般一個點重復三至五次，對于常期穩(wěn)定使用的標準品可以適當減少重復的次數(shù)。 倍比梯度稀釋方法：1v原液（標準品i）+9v稀釋緩沖液，得

3、標準品ii 1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii 1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv 1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v依次倍比稀釋拷貝數(shù)的計算：詳見核酸拷貝數(shù)的計算4. 實例標準品的制作：將標準品依次進行10倍稀釋，ASP-3700 測得其拷貝數(shù)1.55×108copy /ul 標準曲線的繪制（1cycle=1min） 設置對照：濃度為1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的標準樣品各一個，設空白對

4、照PCR反應：以不同濃度標準品作為模板 標準品的擴增曲線 標準品的溶解曲線 標準品的標準曲線圖 X Log 7 6 5 4 3 2 1 Y CT值 12.01 14.89 17.92 21.18 24.56 27.89 31.25擴增效率（E）計算：E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知樣本的CT值為19.11，將CT值代入線性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7=50118 copies核酸拷貝數(shù)的計算一、分步推理如

5、何計算核酸拷貝數(shù)1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml 核酸濃度(OD260)×(dilution factor)×33或40或50=ng/ulMW代表 克/摩爾，單位dolton：1dolton即表示1g/mol 1摩爾=6.02x1023摩爾分子(拷貝數(shù))平均分子量(MW)：dsDNA=(堿基數(shù))×(660道爾頓/堿基)ssDNA = (堿基數(shù))×(330道爾頓/堿基) ssRNA=(堿基數(shù))×(340道爾頓/堿基)得到拷貝數(shù)計算公式：(6.02x1023拷貝數(shù)/摩爾)

6、5;(濃度)/(MW g/mol)= copies/ml.即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml. 或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例：3000堿基質粒，濃度100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g (100ng×10-9)g/1.98×106摩爾數(shù) copy數(shù)摩爾數(shù)×6.02×10233×1010copies/ul.二、這是一個小小的計算器，使你計算更加方便快捷，免去算數(shù)之苦http:/www.bioask.me/html/541.html什么是拷貝數(shù)？ 如何計算拷貝數(shù)？計算方法：(6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾) × (濃度g/ml) / (MW g/mol) = copies/