生物化學(xué)PPT蛋白質(zhì)下word版本

1、生物化學(xué)PPT蛋白質(zhì)下v構(gòu)型：指一個(gè)分子中各原子在空間構(gòu)型：指一個(gè)分子中各原子在空間的相對(duì)分布或排列，構(gòu)型的改變涉的相對(duì)分布或排列，構(gòu)型的改變涉及到共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。及到共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。1.肽平面：肽平面：酰胺平面，參與肽鍵的參與肽鍵的6個(gè)原子個(gè)原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面。位于同一平面。 （一）肽平面（一）肽平面ccccc2.肽鍵鍵長(zhǎng)為肽鍵鍵長(zhǎng)為0.133nm具有部分雙鍵性質(zhì)，不具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。能自由旋轉(zhuǎn)。3.3.酰胺平面中肽鍵一般是酰胺平面中肽鍵一般是反式構(gòu)型。反式構(gòu)型。扭角變，主鏈構(gòu)象變，扭角變，主鏈構(gòu)象變，當(dāng)扭角為固定值時(shí)，主當(dāng)扭角為固定

2、值時(shí)，主鏈為有規(guī)律的構(gòu)象。鏈為有規(guī)律的構(gòu)象。多肽鏈可以看成由多肽鏈可以看成由C串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成C 1C 2C 1C 2（二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 早在1951年，Pauling和Corey根據(jù)對(duì)一些簡(jiǎn)單化合物，如氨基酸、二肽以及三肽的X-射線晶體圖的研究數(shù)據(jù)，提出了兩個(gè)周期性的多肽結(jié)構(gòu)： -螺旋（-helix）和-折疊（-sheet）結(jié)構(gòu)，它們是許多纖維蛋白和球蛋白的主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈質(zhì)多肽鏈主鏈上原子的上原子的局部局部空間結(jié)構(gòu)，即空間結(jié)構(gòu)，即多肽鏈多肽鏈中有規(guī)中有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象。則的重復(fù)構(gòu)象。并不涉

3、及氨基并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。構(gòu)象。主要有主要有-螺旋、折疊、-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲。q -螺旋v-螺旋：是多肽鏈主鏈圍繞螺旋中心軸而成的螺旋式構(gòu)象。v-螺旋的特點(diǎn)：大都為右手螺旋，每3.6個(gè)AA殘基旋轉(zhuǎn)一周，沿縱軸的間距為0.54nm；螺旋的穩(wěn)定性靠鏈內(nèi)氫鍵維持，每隔3個(gè)AA殘基可形成一個(gè)氫鍵。在-螺旋中，AA殘基的R側(cè)鏈分布在螺旋的外側(cè)，其形狀、大小及電荷等均影響螺旋的形成和穩(wěn)定性。3.6殘基殘基0.54nm-角蛋白角蛋白原纖絲初原纖維中間纖維燙發(fā)的生化原理燙發(fā)的生化原理膠原蛋白膠原蛋白原膠原分子原膠原分子膠原纖維膠原纖維q-折疊v-折疊折疊：若干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平若

4、干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平行排列，相鄰肽鏈之間靠氫鍵維持。行排列，相鄰肽鏈之間靠氫鍵維持。v-折疊結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)折疊結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)：（1）-折疊結(jié)構(gòu)中肽鏈處于幾乎完全伸展?fàn)顟B(tài)完全伸展?fàn)顟B(tài), 兩個(gè)AA殘基之間的距離由R基決定。（2）肽鏈按層排列,靠鏈間氫鍵鏈間氫鍵維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。（3）相鄰肽鏈走向可以是平行的(=-119，=+113)，也可以是反平行的(=-139，=+135)。（4）肽鏈中的AA殘基的R基團(tuán)分布在片層的上下。 折疊平行的平行的-折疊折疊反平行的反平行的-折疊折疊-螺旋螺旋-折疊折疊棒狀棒狀片狀片狀多肽鏈緊緊盤繞多肽鏈緊緊盤繞多肽鏈幾乎完全伸展多肽鏈幾乎完全伸展形成鏈內(nèi)氫鍵形成鏈

5、內(nèi)氫鍵多鏈間氫鍵多鏈間氫鍵如角蛋白如角蛋白如絲心蛋白如絲心蛋白q -螺旋與-折疊比較v-轉(zhuǎn)角：蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的回折，在這種肽鏈轉(zhuǎn)角：蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的回折，在這種肽鏈的回折角上就是的回折角上就是-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。q-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角（四）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)整條肽鏈整條肽鏈中全中全部氨基酸殘基的相部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽對(duì)空間位置。即肽鏈中鏈中所有原子所有原子的空的空間排布。間排布。1. 定義定義 N端C端2.球狀球狀蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)同時(shí)含有幾種類型二級(jí)結(jié)構(gòu)元件具有明顯的折疊層次整個(gè)分子緊密結(jié)實(shí)，分子表面有一個(gè)空穴或裂溝幾乎所有的親水側(cè)鏈都分布在分子的表面上，大部分的

6、疏水性基團(tuán)都埋在分子內(nèi)部。（五）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)（五）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu): :由兩個(gè)或兩個(gè)以由兩個(gè)或兩個(gè)以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵彼此締合在一起形成的聚集體。彼此締合在一起形成的聚集體。寡聚蛋寡聚蛋白：白：由兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽鏈通過(guò)由兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽鏈通過(guò)非共非共價(jià)鍵價(jià)鍵構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子。亞基（亞基（subunitsubunit）：）：寡聚蛋白中獨(dú)立具寡聚蛋白中獨(dú)立具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基單獨(dú)存在無(wú)有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基單獨(dú)存在無(wú)活性。活性。亞基間主要作用力是疏水作用，氫鍵、亞基間主要作用力是疏水

7、作用，氫鍵、鹽鍵也參與。鹽鍵也參與。1.1.血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)成人血紅蛋白組成：成人血紅蛋白組成： HbA： 22 98% ， HbA2： 22 2% 新生兒和新生兒和3個(gè)月以上胎兒：個(gè)月以上胎兒：HbF 22早期胚胎：早期胚胎： 22接近于球體，接近于球體，4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。、鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似。鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似。肌紅蛋白解離平衡常數(shù)：肌紅蛋白解離平衡常數(shù)：22MbOOMbK 氧飽和度：氧飽和度： 22MbMbOMbOY2.2.血紅蛋白和肌紅蛋白的氧

8、合曲線血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線Henry定律：溶于液體的任一氣體的濃度與液體上面的該氣體分壓成定律：溶于液體的任一氣體的濃度與液體上面的該氣體分壓成正比。正比。P50：Mb的半飽和氧分壓v 血紅蛋白和肌紅蛋白都能結(jié)血紅蛋白和肌紅蛋白都能結(jié)合氧，而且氧都是結(jié)合在分合氧，而且氧都是結(jié)合在分子中的血紅素輔基上。子中的血紅素輔基上。v 肌紅蛋白是個(gè)單體，可以貯肌紅蛋白是個(gè)單體，可以貯存氧，并且可以使氧在肌肉存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地?cái)U(kuò)散；然而血紅內(nèi)很容易地?cái)U(kuò)散；然而血紅蛋白是個(gè)四聚體分子，可以蛋白是個(gè)四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運(yùn)氧。轉(zhuǎn)運(yùn)氧。v MbMb的氧結(jié)合曲線為的氧結(jié)合曲線為雙曲線雙曲線形，形

9、，說(shuō)明說(shuō)明MbMb易結(jié)合氧；易結(jié)合氧；HbHb的的氧的的氧合曲線是合曲線是S S型曲線型曲線。說(shuō)明四。說(shuō)明四個(gè)亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)。個(gè)亞基之間具有正協(xié)同效應(yīng)。一個(gè)配體與蛋白質(zhì)上的一個(gè)結(jié)合部位的結(jié)合一個(gè)配體與蛋白質(zhì)上的一個(gè)結(jié)合部位的結(jié)合影響同一蛋白質(zhì)上其他結(jié)合部位的親和力稱影響同一蛋白質(zhì)上其他結(jié)合部位的親和力稱為為別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)?？煞譃橥傩?yīng)和異促效應(yīng)兩類。相同配體可分為同促效應(yīng)和異促效應(yīng)兩類。相同配體（同種的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為同促效應(yīng)，（同種的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為同促效應(yīng)，不同配體（不同的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為不同配體（不同的結(jié)合部位）引起的反應(yīng)稱為異促效應(yīng)異促效應(yīng) 3.變構(gòu)

10、效應(yīng)變構(gòu)效應(yīng)血紅蛋白上有血紅蛋白上有CO2和和BPG結(jié)合部位，因此，血結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運(yùn)輸紅蛋白還能運(yùn)輸CO2 。波耳效應(yīng)：波耳效應(yīng)：CO2濃度的增加以及相應(yīng)的濃度的增加以及相應(yīng)的pH降降低使得血紅蛋白氧分?jǐn)?shù)飽和度曲線向右移動(dòng)。低使得血紅蛋白氧分?jǐn)?shù)飽和度曲線向右移動(dòng)。4.波耳效應(yīng)及其生理意義波耳效應(yīng)及其生理意義在紅細(xì)胞內(nèi)：在紅細(xì)胞內(nèi)： 碳酸酐酶碳酸酐酶 CO2H2O HHCO3四維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力四維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力v氫鍵（二級(jí)結(jié)構(gòu)）v疏水基相互作用 疏水作用對(duì)維持蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)起主要作用v范德華力v離子鍵（鹽鍵）v二硫鍵v配位鍵氫鍵：多發(fā)生于多肽鏈中負(fù)電性很強(qiáng)的氫鍵

11、：多發(fā)生于多肽鏈中負(fù)電性很強(qiáng)的N原子或原子或O原子的孤對(duì)電子與原子的孤對(duì)電子與NH或或O-H的的H原子間的相原子間的相互吸引力。對(duì)維持蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)起互吸引力。對(duì)維持蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)起主要主要作用，三、四級(jí)結(jié)構(gòu)起一定作用。作用，三、四級(jí)結(jié)構(gòu)起一定作用。疏水相互作用：又稱疏水鍵，指疏水基團(tuán)或側(cè)鏈為疏水相互作用：又稱疏水鍵，指疏水基團(tuán)或側(cè)鏈為避開(kāi)水分子而相互靠近聚集形成的力，對(duì)維持蛋避開(kāi)水分子而相互靠近聚集形成的力，對(duì)維持蛋白質(zhì)分子的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)起白質(zhì)分子的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)起主要主要作用。作用。范德華力：實(shí)質(zhì)是靜電引力，產(chǎn)生于極性基團(tuán)之間范德華力：實(shí)質(zhì)是靜電引力，產(chǎn)生于極性基團(tuán)之間和極性基團(tuán)

12、與非極性基團(tuán)之間。和極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)之間。離子鍵：又稱鹽鍵，是正負(fù)電荷之間的一種靜離子鍵：又稱鹽鍵，是正負(fù)電荷之間的一種靜電相互作用力，主要在側(cè)鏈上發(fā)揮作用。電相互作用力，主要在側(cè)鏈上發(fā)揮作用。二硫鍵：形成于半胱氨酸殘基之間，在穩(wěn)定蛋二硫鍵：形成于半胱氨酸殘基之間，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。配位鍵：指在兩個(gè)原子之間由其中一個(gè)原子單配位鍵：指在兩個(gè)原子之間由其中一個(gè)原子單獨(dú)提供電子對(duì)而形成的一種特殊的共價(jià)鍵。獨(dú)提供電子對(duì)而形成的一種特殊的共價(jià)鍵。LOGOLOGO第四節(jié)第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1. 蛋白質(zhì)的激活蛋白質(zhì)的激活一、蛋白質(zhì)的

13、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系無(wú)活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)特定的方式斷裂后才轉(zhuǎn)變無(wú)活性的蛋白質(zhì)前體經(jīng)特定的方式斷裂后才轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)，這一過(guò)程叫為有活性的蛋白質(zhì)，這一過(guò)程叫蛋白質(zhì)的激活蛋白質(zhì)的激活（activation）。）。蛋白質(zhì)的激活是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式。蛋白質(zhì)的激活是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式。鐮刀形血紅蛋白（鐮刀形血紅蛋白（sickle-cell hemoglobin, Hb S）2 2、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病 -鏈鏈N端氨基酸排列順序端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）正常人） Val-His-Leu-

14、Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的功能通常取決于它的特定構(gòu)象一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的可解離基團(tuán)：末端-COO-、-NH3+，酸性氨基酸側(cè)鏈-COO- ，Lys的-NH3+，Arg的胍基，His的咪唑基。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI) 在某一在某一pH值時(shí)，蛋白質(zhì)分子中所帶的正值時(shí)，蛋白質(zhì)分子中所帶的正電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)相等，凈電荷為零，在電電荷數(shù)與負(fù)電荷數(shù)相等，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)，此時(shí)溶液的場(chǎng)中

15、不移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。電點(diǎn)。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離鑒定1.蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)的兩性電離 NH3+ NH3+ NH2P P P COOH COO- COO- 正離子正離子 兼性離子兼性離子 負(fù)離子負(fù)離子 pHpI pH=pI pHpI 各種蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，解離情況不同，等電點(diǎn)不同。+OH-+OH-+H+H+在下面所指的pH條件下，下述蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中向正極還是向負(fù)極移動(dòng)，還是不動(dòng)？(a)卵清蛋白，在pH5.0；(pI4.6)(b)乳球蛋白，在pH5.0和7.0；(pI5.2)(c)胰凝乳蛋白酶原，在 pH5.0、9.1和11。(pI9.1) (a)

16、正極 (b)負(fù)極，正極 (c)負(fù)極，不動(dòng)，正極蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的定的空間構(gòu)象被破壞空間構(gòu)象被破壞，即有序的空間結(jié)，即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理理化性質(zhì)改變化性質(zhì)改變和和生物活性喪失的現(xiàn)象生物活性喪失的現(xiàn)象。2.蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性造成變性的因素造成變性的因素 物理因素：紫外線照射、超聲波、物理因素：紫外線照射、超聲波、高溫、高壓。高溫、高壓。 化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、乙醇等有機(jī)化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、乙醇等有機(jī)

17、 溶劑及變性劑等溶劑及變性劑等。 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)變性，表現(xiàn)為：蛋白質(zhì)變性，表現(xiàn)為：1.1.物理性質(zhì)改變疏水基團(tuán)外露，溶解度降低，粘物理性質(zhì)改變疏水基團(tuán)外露，溶解度降低，粘度增加，擴(kuò)散系數(shù)降低，常伴隨蛋白質(zhì)的沉淀。度增加，擴(kuò)散系數(shù)降低，常伴隨蛋白質(zhì)的沉淀。2.2.生物活性喪失變性的主要標(biāo)志。生物活性喪失變性的主要標(biāo)志。3.3.生化性質(zhì)改變分子結(jié)構(gòu)松散，易被蛋白質(zhì)水解生化性質(zhì)改變分子結(jié)構(gòu)松散，易被蛋白質(zhì)水解酶水解。酶水解。 應(yīng)用：應(yīng)用：臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)

18、用來(lái)消毒及滅菌。毒及滅菌。蛋白質(zhì)的復(fù)性：變性的蛋白質(zhì)當(dāng)去除變性因素后，蛋白質(zhì)可重新恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation) 。蛋白質(zhì)的復(fù)性與導(dǎo)致變性的因素、蛋白質(zhì)的種類以及分子結(jié)構(gòu)改變的程度有關(guān)。一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 牛核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 -巰基乙醇 去除尿素、-巰基乙醇肽鏈伸展，失去活性3.3.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) v 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素水化膜水化膜顆粒表面電荷顆粒表面電荷1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：

19、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)分子：生物大分子，分子量蛋白質(zhì)分子：生物大分子，分子量 1100萬(wàn)，分子的直徑可達(dá)萬(wàn)，分子的直徑可達(dá)1100nm，膠體范圍。膠體范圍。+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀：由于受到某些因素的影：由于受到某些因素的影響，蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。響，蛋白質(zhì)從溶液中析出的

20、現(xiàn)象。沉淀和變性的區(qū)別：沉淀時(shí)空間結(jié)構(gòu)不一定被破壞，蛋白質(zhì)仍有生物活性，若恢復(fù)原來(lái)的條件，蛋白質(zhì)可重新溶解。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，沉淀不一定變性。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，沉淀不一定變性。4.蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀（1 1）鹽析）鹽析 不導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性不導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的鹽溶：在鹽濃度很低時(shí)，向蛋白質(zhì)溶液中加入少量的中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度增加的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的鹽析：當(dāng)加入大量的中性鹽后，蛋白質(zhì)的溶解度下降，沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析。 硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀 使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性的影響因素（2）有機(jī)溶劑 乙醇、丙酮非極性有機(jī)溶劑可降低介質(zhì)的介電常數(shù)，破壞蛋

21、白質(zhì)水化膜，使其沉淀。（3）重金屬鹽類 pHpI時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+，Pb2+， Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀。（4）生物堿試劑和酸類 單寧酸、三氯乙酸、硝酸、硝基水楊酸 pH pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。（5）加熱變性（6）等電點(diǎn)沉淀法5.蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)、米倫反應(yīng)等6.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等考馬斯亮藍(lán)染色法、紫外吸收法、凱氏定氮法等 電泳電泳 前處前處理理粗粗分分離離細(xì)細(xì)分分離離生物細(xì)胞或組織生物細(xì)胞或組織 無(wú)細(xì)胞提取液無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速離心解、差速離

22、心選擇性沉淀法選擇性沉淀法親和親和層析層析離子交離子交換層析換層析精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì)凝膠凝膠過(guò)濾過(guò)濾疏水疏水層析層析吸附吸附層析層析鹽析、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)溶解度不同分離1.透析和超過(guò)濾透析和超過(guò)濾初步分離純化常利用不同蛋白質(zhì)在溶液和鹽中溶解度的差別，硫酸銨常用于分級(jí)分離。再通過(guò)透析將硫酸銨除去。半透性膜超過(guò)濾是利用壓力或離心力，使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，蛋白質(zhì)被截留在膜上。2.層析（色譜）層析（色譜）1. 1.層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理待分離樣品（流動(dòng)

23、相）流過(guò)固定相時(shí)，待分離樣品（流動(dòng)相）流過(guò)固定相時(shí)，樣品中的各個(gè)成分與固定相進(jìn)行不同程度樣品中的各個(gè)成分與固定相進(jìn)行不同程度的相互作用，并以不同速度流經(jīng)固定相而的相互作用，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。2 2、蛋白質(zhì)分離常用的層析方法、蛋白質(zhì)分離常用的層析方法v離子交換層析：利用各種蛋白質(zhì)的電離子交換層析：利用各種蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。v凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾(gel filtration)又稱分子篩層又稱分子篩層析或排阻層析，利用析或排阻層析，利用各各蛋白質(zhì)相對(duì)分子蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離。質(zhì)量大小進(jìn)行分離。將含有天冬

24、氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、蘇氨酸(pI=6.53)、亮氨酸(pI=5.98)和賴氨酸(pI=9.74)的pH3.0檸檬酸緩沖液，加到預(yù)先同樣緩沖液平衡過(guò)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂中，隨后用該緩沖液洗脫此柱，并分別收集洗出液，這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來(lái)？Asp, Thr, Gly, Leu, Lys交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺瓊脂糖瓊脂糖1.將稱為配體的分子共價(jià)結(jié)合在層析柱的固體材料上，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配體發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。2.被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。親

25、和層析親和層析3.3.電泳電泳帶電的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中能向與其所帶電的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中能向與其所帶電荷相反的方向移動(dòng)。通過(guò)蛋白質(zhì)在帶電荷相反的方向移動(dòng)。通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), , 稱為稱為電泳電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支持物的不同，可分為薄膜電根據(jù)支持物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。泳、凝膠電泳等。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。*等電聚焦電泳等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而

26、分離蛋白質(zhì)的電泳方法。的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。重要技術(shù)。電泳遷移率與多肽鏈的分子量的關(guān)系：電泳遷移率與多肽鏈的分子量的關(guān)系：前沿染料遷移距離樣品遷移距離r=lgMr= a - brSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS ： amino acids1：2十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDS ）HS-CH2CH2OH巰基乙醇巰基乙醇SDS和巰基乙醇和巰基乙醇十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）等電聚焦電泳等電聚

27、焦電泳雙向電泳雙向電泳蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定1953年年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟。1.測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。2.多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用

28、8mol/L尿素或尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基亞基). 3.二硫鍵的斷裂v幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。二硫蘇糖醇v過(guò)甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵4.測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比。5.分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-末端和末端和C-末端。末端。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。 N-端氨基酸：端氨基酸： S

29、anger法。法。2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐端逐 個(gè)的向里水解。個(gè)的向里水解。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端末端 的肽鍵速度最大。的肽鍵速度最大。C-端氨基酸端氨基酸： 羧肽酶法：羧肽酶法：肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-C-端逐個(gè)的水解。端逐個(gè)的水解。 肼解法：肼解法：多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-C-端端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨

30、基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與質(zhì)而與C-C-端氨基酸分離。端氨基酸分離。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸6.多肽鏈斷裂成多個(gè)多肽鏈斷裂成多個(gè)小片小片段段。 可采用兩種或多種不同的斷裂方可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離肽段或肽碎片，并將其分離、純、純化化。 （1）酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，葡萄

31、球菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶Trypsin：R1為賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)胰蛋白酶胰蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）R1為苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr側(cè)鏈。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)糜蛋白酶糜蛋白酶 Pepsin：R2為苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr和亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸側(cè)鏈水解速度較快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)水解位點(diǎn)胃蛋白酶

32、胃蛋白酶（2）化學(xué)法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯7.測(cè)定測(cè)定各各肽段的氨基酸順序。肽段的氨基酸順序。Edman （苯異硫氰酸酯法）苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈重復(fù)循

33、環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。解離。利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。一種從流感病毒中提取的對(duì)其入侵細(xì)胞有重要作用的蛋白質(zhì)的肽鏈，一種從流感病毒中提取的對(duì)其入侵細(xì)胞有重要作用的蛋白質(zhì)的肽鏈，可以用可以用CNBr(溴化氰）和溴化氰）和Pepsin（胃蛋白酶）（胃蛋白酶） 降解成小的片斷。降解成小的片斷。CNBr 降解而成的片斷為降解而成的片斷為:Arg-Thr，Phe-Ser-Met， Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met.

34、Pepsin （胃蛋白酶）降解而成的片斷為：（胃蛋白酶）降解而成的片斷為：Arg-Thr，Phe-Ser-Met-Arg-Thr，Phe-Arg-Thr-Met.求正確的氨基酸殘基排列順序。求正確的氨基酸殘基排列順序。8.確定肽段在多肽鏈中的次序。確定肽段在多肽鏈中的次序。Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met-Phe-Ser-Met-Arg-Thr9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析。后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析。然后同與用胃蛋白酶處理的事先斷開(kāi)二硫鍵的肽段進(jìn)然后同與用胃蛋白酶處理的事先斷開(kāi)二硫鍵的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。行比較，確定二硫鍵的位置。1.名詞解釋：等電點(diǎn)、必需氨基酸、兼性離子、肽鍵、肽平面、名詞解釋：等電點(diǎn)、必需氨基酸、兼性離子、肽鍵、肽平面、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)、-螺旋、螺旋、-折疊、