四 培養(yǎng)基配制與無菌技術(shù)

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握微生物掌握微生物常規(guī)培養(yǎng)基的制備方法常規(guī)培養(yǎng)基的制備方法 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)無菌技術(shù)無菌技術(shù) 學(xué)習(xí)玻璃器皿的包扎學(xué)習(xí)玻璃器皿的包扎微生物培養(yǎng)基的配制微生物培養(yǎng)基的配制與無菌技術(shù)與無菌技術(shù) 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、6種培養(yǎng)基的配制種培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌） 高氏一號培養(yǎng)基（放線菌）高氏一號培養(yǎng)基（放線菌） 馬丁氏培養(yǎng)基（真菌）馬丁氏培養(yǎng)基（真菌） 淀粉培養(yǎng)基（淀粉水解試驗(yàn)）淀粉培養(yǎng)基（淀粉水解試驗(yàn)） 蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)）蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)） 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)）試驗(yàn)）2、 移液管、培

2、養(yǎng)皿、三角瓶、試管等的包扎移液管、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等的包扎3、滅菌、滅菌微生物培養(yǎng)基的配制微生物培養(yǎng)基的配制 v 無菌水的無菌水的準(zhǔn)備準(zhǔn)備三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基medium:用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生用人工的辦法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的營養(yǎng)基質(zhì)。物生長代謝的需要配制成的營養(yǎng)基質(zhì)。水、水、C源、源、N源、礦物質(zhì)、生長因素源、礦物質(zhì)、生長因素/因子、微量元素因子、微量元素培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培

3、養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)基的配制微生物培養(yǎng)基的配制 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟配制培養(yǎng)基的流程配制培養(yǎng)基的流程： 原料稱量原料稱量、溶解溶解 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值值 ( (加瓊脂熔化加瓊脂熔化) ) ( (過濾過濾) )定容定容 分裝分裝 塞棉塞塞棉塞/ /扎扎口口 滅菌滅菌 培養(yǎng)基分裝裝置培養(yǎng)基分裝裝置 斜面擺放法斜面擺放法 棉棉塞的做法塞的做法a)a)棉棉塞的制作過程塞的制作過程 ( (b)b)正誤正誤棉塞棉塞培養(yǎng)皿的包扎培養(yǎng)皿的包扎 在在( (利用微生物利用微生物) )進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過程中，進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過程中，采用物理

4、和化學(xué)的方法技術(shù)，保證培養(yǎng)物不采用物理和化學(xué)的方法技術(shù)，保證培養(yǎng)物不受環(huán)境微生物的污染，同時也不允許操作的受環(huán)境微生物的污染，同時也不允許操作的微生物擴(kuò)散到環(huán)境中去。微生物擴(kuò)散到環(huán)境中去。 如高溫滅菌、過濾、紫外線照射處理等。如高溫滅菌、過濾、紫外線照射處理等。滅菌與消毒滅菌與消毒 滅菌滅菌Sterilization：用物理或化學(xué)的方法來殺死或用物理或化學(xué)的方法來殺死或除去材料上或環(huán)境中的所有微生物的處理。除去材料上或環(huán)境中的所有微生物的處理。 消毒消毒Disinfection：用物理或化學(xué)的方法殺死物體用物理或化學(xué)的方法殺死物體上絕大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生上絕大部分微生物（主

5、要是病原微生物和有害微生物）的處理。消毒實(shí)際上是部分滅菌。物）的處理。消毒實(shí)際上是部分滅菌。防腐防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長化療化療(Chemotherapy)：殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物抑制抑制(Inhibition)：生長停止，但不死亡生長停止，但不死亡死亡死亡(Death)：生長能力不可逆喪失生長能力不可逆喪失 干熱滅菌干熱滅菌 熱蒸汽滅菌熱蒸汽滅菌 常壓滅菌常壓滅菌 過濾除菌過濾除菌 射線滅菌射線滅菌 化學(xué)藥物滅菌化學(xué)藥物滅菌 1 1、火焰滅菌、火焰滅菌微生物接種工具如接

6、種環(huán)、接種針或其微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其它金屬用具等可直接在酒精燈火焰上燒它金屬用具等可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。至紅熱進(jìn)行滅菌。這種方法滅菌迅速徹底。這種方法滅菌迅速徹底。接種過程中，試管或三角瓶口等，也可接種過程中，試管或三角瓶口等，也可通過火焰灼燒滅菌。通過火焰灼燒滅菌。用干燥熱空氣用干燥熱空氣（160, 12h）殺死微生物殺死微生物 培養(yǎng)皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接種、培養(yǎng)皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接種、鑷子、剪刀等能耐高溫的器皿鑷子、剪刀等能耐高溫的器皿 晾干后用牛皮紙包好晾干后用牛皮紙包好 溫度升到溫度升到100100，開箱內(nèi)鼓風(fēng)機(jī)，開箱內(nèi)鼓風(fēng)機(jī)

7、 培養(yǎng)基、橡膠塑料制品不能用此方法培養(yǎng)基、橡膠塑料制品不能用此方法 注意安全注意安全干熱滅菌箱干熱滅菌箱鼓風(fēng)鈕溫度調(diào)節(jié)器指示燈溫度調(diào)節(jié)旋扭溫度計(jì)與排氣孔 常壓蒸汽間歇滅菌常壓蒸汽間歇滅菌 將待滅菌的培養(yǎng)基或物品裝入常壓滅菌器內(nèi)，加熱至將待滅菌的培養(yǎng)基或物品裝入常壓滅菌器內(nèi)，加熱至100100大量產(chǎn)生氣體時大量產(chǎn)生氣體時, ,維持維持30306060min,min,每天滅菌一次每天滅菌一次, ,連連續(xù)滅菌三天續(xù)滅菌三天. .每次蒸煮間隙里每次蒸煮間隙里, ,培養(yǎng)基或物品應(yīng)放在室溫培養(yǎng)基或物品應(yīng)放在室溫(20-30)(20-30)條件下培養(yǎng)條件下培養(yǎng), ,第一次蒸煮殺死微生物的營養(yǎng)第一次蒸煮殺死微

8、生物的營養(yǎng)體體, ,芽孢則在培養(yǎng)過程中萌發(fā)成營養(yǎng)體芽孢則在培養(yǎng)過程中萌發(fā)成營養(yǎng)體; ;第二次蒸煮即可第二次蒸煮即可殺死殺死. .經(jīng)過二次培養(yǎng)經(jīng)過二次培養(yǎng), ,三次反復(fù)蒸煮三次反復(fù)蒸煮, ,即可達(dá)到完全滅菌。即可達(dá)到完全滅菌。 常壓蒸汽持續(xù)滅菌常壓蒸汽持續(xù)滅菌 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌常壓蒸汽間歇滅菌常壓蒸汽間歇滅菌 常壓蒸汽持續(xù)滅菌常壓蒸汽持續(xù)滅菌 常壓蒸汽持續(xù)滅菌中常壓蒸汽持續(xù)滅菌中, ,從蒸汽大量產(chǎn)生開始從蒸汽大量產(chǎn)生開始, ,繼續(xù)加繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽大火力保持充足蒸汽, ,持續(xù)加熱持續(xù)加熱3 36 6h,h,殺死絕大部分殺死絕大部分芽孢和全部營養(yǎng)體芽孢和全部營養(yǎng)體, ,達(dá)到滅菌目的

9、。達(dá)到滅菌目的。 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌原理：原理：水的沸點(diǎn)隨壓力的增加而提高。水在密閉的加壓水的沸點(diǎn)隨壓力的增加而提高。水在密閉的加壓蒸汽滅菌器中煮沸，產(chǎn)生蒸汽驅(qū)除鍋內(nèi)冷空氣后，使蒸汽滅菌器中煮沸，產(chǎn)生蒸汽驅(qū)除鍋內(nèi)冷空氣后，使蒸汽不能逸出，因而增加了鍋中的蒸汽壓力。蒸汽壓蒸汽不能逸出，因而增加了鍋中的蒸汽壓力。蒸汽壓力提高，水的沸點(diǎn)隨著上升，因而能夠獲得比力提高，水的沸點(diǎn)隨著上升，因而能夠獲得比100100更高的蒸汽溫度，用來進(jìn)行有效的滅菌。更高的蒸汽溫度，用來進(jìn)行有效的滅菌。同一溫度下，濕熱滅菌法比干熱滅菌法效果好同一溫度下，濕熱滅菌法比干熱滅菌法效果好蒸汽穿透

10、力強(qiáng)蒸汽穿透力強(qiáng)蛋白質(zhì)含水量高，易于凝固蛋白質(zhì)含水量高，易于凝固手提式滅菌鍋手提式滅菌鍋安全閥壓力表放氣閥軟管緊固螺栓滅菌桶篩架水臥式滅菌鍋臥式滅菌鍋 是指含菌液體或氣體通過細(xì)菌濾器，使雜菌留是指含菌液體或氣體通過細(xì)菌濾器，使雜菌留在濾器或?yàn)V板上，從而除去雜菌。在濾器或?yàn)V板上，從而除去雜菌。 常用于許多不宜用濕熱滅菌的液體物質(zhì)，如常用于許多不宜用濕熱滅菌的液體物質(zhì)，如抗抗生素、血清、糖類溶液生素、血清、糖類溶液等。等。 用于除菌的細(xì)菌過濾器，是由孔徑極小，能阻用于除菌的細(xì)菌過濾器，是由孔徑極小，能阻止擋的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成止擋的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成. .為了加快過濾為

11、了加快過濾, ,一般多采用抽氣減壓的方法一般多采用抽氣減壓的方法, ,進(jìn)進(jìn)行操作。行操作。過濾除菌過濾除菌 輻射滅菌輻射滅菌( (Radiation Sterilization) )是利用是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。上的微生物的一種有效方法。 用于滅菌的電磁波有微波，紫外線用于滅菌的電磁波有微波，紫外線( (UV)UV)、X-X-射線和射線和-射線等。射線等。 酚類酚類損傷微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、酶鈍化、蛋白質(zhì)變性損傷微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、酶鈍化、蛋白質(zhì)變性 醇類醇類溶解膜中的類脂，破壞膜結(jié)構(gòu)，使蛋白變性（純的或溶解膜中的類

12、脂，破壞膜結(jié)構(gòu)，使蛋白變性（純的或高濃度酒精使菌體表面蛋白凝固，使乙醇不易滲進(jìn)細(xì)胞）高濃度酒精使菌體表面蛋白凝固，使乙醇不易滲進(jìn)細(xì)胞） 醛類醛類與蛋白質(zhì)中氨基酸的多種基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而使其變性與蛋白質(zhì)中氨基酸的多種基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而使其變性 酸類酸類抑制微生物酶和代謝活性抑制微生物酶和代謝活性 表面活性劑表面活性劑改變細(xì)胞的穩(wěn)定性和透性，細(xì)胞物質(zhì)逸出改變細(xì)胞的穩(wěn)定性和透性，細(xì)胞物質(zhì)逸出 鹵化物鹵化物與細(xì)胞中的酶和蛋白質(zhì)中的酪氨酸結(jié)合，與細(xì)胞中的酶和蛋白質(zhì)中的酪氨酸結(jié)合，ClCl2 2和漂和漂白粉產(chǎn)生次氯酸和新生態(tài)氧（強(qiáng)氧化劑），破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)白粉產(chǎn)生次氯酸和新生態(tài)氧（強(qiáng)氧化劑），破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)作用機(jī)理

13、：作用機(jī)理： 重金屬重金屬與酶或蛋白質(zhì)上的與酶或蛋白質(zhì)上的SHSH結(jié)合結(jié)合 氧化劑氧化劑使細(xì)胞成份氧化使細(xì)胞成份氧化 染色劑染色劑堿性染料的陽離子基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基酸上的羧基或核酸上的堿性染料的陽離子基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基酸上的羧基或核酸上的 磷酸基結(jié)合，阻礙正常代謝磷酸基結(jié)合，阻礙正常代謝 抗生素抗生素多種機(jī)理：作用于細(xì)胞壁、膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子合成多種機(jī)理：作用于細(xì)胞壁、膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子合成 抗代謝物抗代謝物競爭抑制，如磺胺類藥物于對氨基苯甲酸類似，阻止葉競爭抑制，如磺胺類藥物于對氨基苯甲酸類似，阻止葉 酸的合成酸的合成 作用機(jī)理：作用機(jī)理：墻壁光滑，地面平坦，避免積累灰塵，便于清洗消

14、毒；不裝墻壁光滑，地面平坦，避免積累灰塵，便于清洗消毒；不裝風(fēng)扇，通風(fēng)換氣通過空氣調(diào)節(jié)裝置風(fēng)扇，通風(fēng)換氣通過空氣調(diào)節(jié)裝置 使用前，用使用前，用2%2%新潔爾敏擦洗新潔爾敏擦洗 再用再用75%75%酒精（或酒精（或5%5%石炭酸）噴霧，使灰塵落下石炭酸）噴霧，使灰塵落下 最后用紫外燈照射約最后用紫外燈照射約2020minmin 定期熏蒸：一年二定期熏蒸：一年二 四次四次 用用40%40%甲醛（甲醛（6 6 1010ml/mml/m3 3 ) )或加半量高錳酸鉀熏蒸，盛于或加半量高錳酸鉀熏蒸，盛于鐵制容器，電爐或酒精燈加熱（應(yīng)能隨時終止熱源），鐵制容器，電爐或酒精燈加熱（應(yīng)能隨時終止熱源），熏蒸后

15、密閉熏蒸后密閉1212h h以上，使用前以上，使用前1 1 2 2h h用氨水中和。用氨水中和。 其他熏蒸劑；乳酸（對細(xì)菌）、硫磺其他熏蒸劑；乳酸（對細(xì)菌）、硫磺升汞（升汞（ 0.1% HgCl2）漂白粉漂白粉10g/150mlNaClO（2-10%）酒精酒精75%苯酚（苯酚（1%）福爾馬林（福爾馬林（5%）過氧化氫（過氧化氫（3%）氰化汞（氰化汞（0.1%）高錳酸鉀（高錳酸鉀（2%）硝酸銀硝酸銀(0.1%) 酸性培養(yǎng)基酸性培養(yǎng)基: 如10ml培養(yǎng)基中加三滴25%的乳酸 孟加拉紅：孟加拉紅：0.035 g /L培養(yǎng)基 抗菌素抗菌素:金霉素（30g/ml）可抑制多數(shù)細(xì)菌;青霉素（20g/ml）可抑制G+細(xì)菌;多粘霉素（5.0g/ml）可抑制G-細(xì)菌;鏈霉素(40g/ml)和氯霉素(50g/ml)可抑制大部細(xì)菌. 除氯霉素可滅菌前加入外，其它抗菌素都是在培養(yǎng)基滅除氯霉素可滅菌前加入外，其它抗菌素都是在培養(yǎng)基滅菌后并冷卻到菌后并冷卻到45左右時加入左右時加入. 雙層培養(yǎng)基或