生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)常用分離技術(shù)實(shí)用教案

1、 1、鹽析法鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液(rngy)中，溶解度會(huì)隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液(rngy)中析出。 2、有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、破壞溶質(zhì)周圍形成的水化層，從而降低溶質(zhì)溶解度；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。 3、蛋白質(zhì)沉淀劑蛋白質(zhì)沉淀劑則僅對(duì)一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。第1頁(yè)/共25頁(yè)第一頁(yè)，共25頁(yè)。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型

2、聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。 5、選擇性沉淀法根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)(w l hu xu)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。第2頁(yè)/共25頁(yè)第二頁(yè)，共25頁(yè)。 在生化制備中，沉淀主要用于濃縮(nn su)目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的有以下幾種沉淀方法和沉淀劑： 1鹽析法 多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化 2有機(jī)溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。 3等電點(diǎn)沉淀法 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)的沉淀。但此

3、法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。 4非離子多聚體沉淀法用于分離生物大分子。 5生成鹽復(fù)合物沉淀 用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。 6熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。第3頁(yè)/共25頁(yè)第三頁(yè)，共25頁(yè)。第一節(jié) 鹽析(yn x)(yn x)法 所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程(guchng)(guchng)叫鹽析。 在生化制備中, ,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質(zhì)沉淀最為常見，特別是在粗提階段。 鹽析法分為兩類，第一類叫KsKs分段鹽析法，在一定PHPH和溫度下通過(guò)

4、改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PHPH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶. .第4頁(yè)/共25頁(yè)第四頁(yè)，共25頁(yè)。 鹽的選擇 鹽析(yn x)條件的確定 鹽析(yn x)公式 logS=-KsM Ks-鹽析(yn x)常數(shù) M-濃度 S-蛋白質(zhì)溶解度第5頁(yè)/共25頁(yè)第五頁(yè)，共25頁(yè)。一影響(yngxing)鹽析的若干因素 1蛋白質(zhì)濃度 2離子(lz)強(qiáng)度和類型 3PH值 4溫度 第6頁(yè)/共25頁(yè)第六頁(yè)，共25頁(yè)。 1蛋白質(zhì)濃度(nngd) 高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近，若蛋白濃度過(guò)高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)

5、重的共沉淀作用； 在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析(yn x)，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。 用于分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。第7頁(yè)/共25頁(yè)第七頁(yè)，共25頁(yè)。2離子強(qiáng)度(qingd)和類型 一般說(shuō)來(lái)，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來(lái)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾或冷凍(lngdng)離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來(lái)。 離子種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑

6、小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂。第8頁(yè)/共25頁(yè)第八頁(yè)，共25頁(yè)。3PH值 一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。 為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果是不同(b tn)的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液PH值，以達(dá)到最好的鹽析效果。第9頁(yè)/共25頁(yè)第九頁(yè)，共25頁(yè)。4溫度(wnd) 在低離子(lz)強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在

7、高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。 在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4進(jìn)行。第10頁(yè)/共25頁(yè)第十頁(yè)，共25頁(yè)。二硫酸銨的使用(shyng) 硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過(guò)夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶(jijng)，100烘干后使用。 另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。第11頁(yè)/共25頁(yè)第十一頁(yè)，共25頁(yè)。硫酸銨的加入有以下(yxi)幾種方法： 1）加

8、入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大(zn d)溶液體積的情況； 2）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況； 3）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測(cè)量飽和度，故多用于結(jié)晶，其它情況少見。第12頁(yè)/共25頁(yè)第十二頁(yè)，共25頁(yè)。使用(shyng)硫酸銨時(shí)： 1）必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中； 2）分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化。一種蛋

9、白質(zhì)如經(jīng)二次透析，一般來(lái)說(shuō)，第一次鹽析分離范圍（飽和度范圍）比較寬，第二次分離范圍較窄。 3）鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀完全后才過(guò)濾或離心。過(guò)濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因?yàn)榇朔N情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要(xyo)較高離心速度和長(zhǎng)時(shí)間的離心操作，耗時(shí)耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。第13頁(yè)/共25頁(yè)第十三頁(yè)，共25頁(yè)。第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理(j l)是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，最后析出。 有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等

10、。第14頁(yè)/共25頁(yè)第十四頁(yè)，共25頁(yè)。有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)缺點(diǎn) : 1 1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀； 2 2）沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易(rngy)(rngy)； 3 3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的大分子容易(rngy)(rngy)引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。第15頁(yè)/共25頁(yè)第十五頁(yè)，共25頁(yè)。影響(yngxing)有機(jī)溶劑的沉淀效果因素 1）溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率； 2）樣品濃度(nngd)和PH 與鹽析法中的作用基

11、本相同； 3）金屬離子 一些多價(jià)陽(yáng)離子如Zn 2+和Ca 2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。 4）離子強(qiáng)度 鹽濃度(nngd)太大或太低都對(duì)分離有不利影響，對(duì)蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度(nngd)不超過(guò)5%比較合適，使用的乙醇量不超過(guò)二倍體積為宜。第16頁(yè)/共25頁(yè)第十六頁(yè)，共25頁(yè)。 第三節(jié) 其他(qt)沉淀法 一等電點(diǎn)沉淀法 二生成鹽復(fù)合物沉淀法 三 選擇性變性(binxng)沉淀 四非離子多聚物沉淀法 第17頁(yè)/共25頁(yè)第十七頁(yè)，共25頁(yè)。一等電點(diǎn)沉淀法 兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低，不

12、同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。 利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須(bx)了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。 不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須(bx)注意調(diào)整PH值。 等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。第18頁(yè)/共25頁(yè)第十八頁(yè)，共25頁(yè)。二生成(shn chn)鹽復(fù)合物沉淀法 1金屬?gòu)?fù)合鹽法 許多有機(jī)物質(zhì)包括蛋白在內(nèi)，在堿性溶液中帶(zhn di)負(fù)電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據(jù)有機(jī)物與它們之間的作用機(jī)制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘；親羧酸含氮化合物類，如鈣鎂鉛

13、；親硫氫基化合物類，如汞銀鉛。 蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的重要性質(zhì)是它們的溶解度對(duì)溶液的介電常數(shù)非常敏感，調(diào)整水溶液的介電常數(shù)（如加入有機(jī)溶劑），即可沉淀多種蛋白。第19頁(yè)/共25頁(yè)第十九頁(yè)，共25頁(yè)。 2 有機(jī)鹽法含氮有機(jī)酸如苦味酸、鞣酸等能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，故用于制備蛋白質(zhì)時(shí)，需采用較溫和的條件，有時(shí)還需加入一定的穩(wěn)定劑。 3無(wú)機(jī)復(fù)合鹽法如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等?？偨Y(jié)：以上鹽類復(fù)合物都具有(jyu)很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬?gòu)?fù)合鹽，可通以H2S使金屬變成 硫化物而除去，若為有機(jī)酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無(wú)機(jī)酸并用乙醚萃取，把有機(jī)

14、酸和磷鎢酸等移入乙醚中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類方法常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。第20頁(yè)/共25頁(yè)第二十頁(yè)，共25頁(yè)。三 選擇性變性(binxng)沉淀 其原理是利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。此方法可分為： 1）利用表面(biomin)活性劑(SDS)或有機(jī)溶劑引起變性； 2）利用對(duì)熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分； 3）酸堿變性。第21頁(yè)/共25頁(yè)第二十一頁(yè)，共25頁(yè)。四非離子(lz)多聚物沉淀法 非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要沉淀劑，最早用于提純免疫球蛋白、

15、沉淀一些細(xì)菌(xjn)和病毒，近年來(lái)逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇。 第22頁(yè)/共25頁(yè)第二十二頁(yè)，共25頁(yè)。用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒(wil)，一般有兩種方法： 1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)。并外加離子強(qiáng)度、PH值和溫度等影響，從而(cng r)擴(kuò)大分離效果。 2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時(shí)先離心除去大懸浮顆粒，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃