細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

1、第四章第四章 抗菌藥物敏感試驗(yàn)抗菌藥物敏感試驗(yàn)黃露萍黃露萍抗菌藥物敏感試驗(yàn)測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無(wú)抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（Antimicrobial Susceptibility Test），簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST）。藥敏試驗(yàn)的意義預(yù)測(cè)抗菌治療的效果；指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。 藥敏試驗(yàn)MIC：在與微生物生長(zhǎng)速率有關(guān)的特定時(shí)間間隔內(nèi)，通常是1824小時(shí)，能夠抑制被測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。對(duì)

2、倍稀釋的優(yōu)點(diǎn)：操作容易敏感株的MIC呈正態(tài)分布區(qū)分異常(R)與敏感(S)的菌群藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)的建立 1. MIC的分布的分布2. 藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué) 定 MIC的折點(diǎn)3. 臨床療效和細(xì)菌清除率臨床療效和細(xì)菌清除率4. 抑菌圈直徑的分布 定抑菌圈折點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)的線性回歸計(jì)算錯(cuò)誤率：盡可能減少極重要誤差 (假敏感率)MIC的分布051015200.0080.0320.1250.52832128512藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)：藥物吸收，分布，代謝，排泄藥效學(xué)：藥物對(duì)機(jī)體的作用時(shí)間依賴型（TMIC：-內(nèi)酰胺類，大環(huán)內(nèi)酯類濃度依賴型（AUC/MIC比率：AGS, FQ這些參數(shù)可用于計(jì)算具

3、有最佳藥效的給藥方案MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系耐藥 中介 敏感RISLog2. MICD 1 d2 抑菌圈直徑（mm)抑菌圈直徑與MIC的關(guān)系MIC (ug/ml)1 12 23 35 52 22 22 22 22 21 11 11 11 12 22 25 58 8111251 12 25 568小誤差中介中介3234耐藥耐藥重要誤差小誤差9敏感敏感小誤差極重要誤差小誤差24262830141820220.250.510121248256256163264128不同國(guó)家的判定折點(diǎn)可能不同原因：用藥劑量不同，服藥的間隔不同評(píng)價(jià)敏感時(shí)較保守更強(qiáng)調(diào)檢測(cè)出耐藥株（即特定的耐藥群）技術(shù)因素：接種、培養(yǎng)

4、基在我國(guó)主要遵循臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。 CLSI的簡(jiǎn)單介紹NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)已經(jīng)被我國(guó)衛(wèi)生部指定為部頒標(biāo)準(zhǔn)每年有新版CLSI （Clinical and Laboratory Standards Institute）美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 2012年CLSI臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)范M100-S20Tables：抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

5、的實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)M2-A10：紙片擴(kuò)散法敏感性試驗(yàn)的實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)M07-A8：需氧菌稀釋法敏感性試驗(yàn)方法M11-A7: 厭氧菌敏感性試驗(yàn)方法M47-A8: 血培養(yǎng)的原則和步驟M35-A2: 細(xì)菌及酵母樣真菌的鑒定方法簡(jiǎn)本3判斷折點(diǎn)特殊的耐藥監(jiān)測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控范圍藥物分組敏感性分類(CLSI的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度超過(guò)細(xì)菌的MIC 5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)MIC高于藥物在血、體液中可能達(dá)到的濃度敏感性分類（2）中介 (Intermediate)MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株藥物生

6、理濃集部位有效 (尿-FQ)加大用藥劑量可能有效緩沖區(qū)：防止操作的系統(tǒng)誤差造成重大結(jié)果的判定錯(cuò)誤藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)半定量紙片擴(kuò)散法 (抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動(dòng)化儀法抗生素連續(xù)梯度法 (Etest )流式細(xì)胞儀 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）操作方法操作方法 ：1.將在約56恒溫

7、的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度4mm。2.無(wú)菌挑取孵育1624h的血平板上45個(gè)菌落。3.置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarland No 0.5管。4.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。 5.平板置室溫干燥35分鐘，用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。6.蓋上平板的蓋子，置35培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1618小時(shí)后閱讀結(jié)果，對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素敏感等應(yīng)孵育24

8、小時(shí)。2022-7-725紙片擴(kuò)散法影響因素MIC接種菌量細(xì)菌生長(zhǎng)率抗生素含量、擴(kuò)散性平皿厚度溫度，預(yù)孵育時(shí)間2022-7-726紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)化CLSI：美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute)每年修訂更改包括質(zhì)控新藥的判定標(biāo)準(zhǔn)特殊耐藥性的檢測(cè)2022-7-727CLSI的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控；規(guī)定常規(guī)測(cè)試報(bào)告的抗生素；不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同；不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同。2022-7-728常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(1) 腸桿菌科 綠膿和非腸桿菌科一 級(jí) 氨芐西林

9、 頭孢他啶，慶大霉素 頭孢唑林，慶大霉素替卡西林，哌拉西林二級(jí) 阿米卡星 阿米卡星 氨芐西林/舒巴坦 頭孢吡肟，頭孢哌酮 阿莫西林/克拉維酸氨曲南 頭孢呋肟，頭霉素環(huán)丙沙星，亞胺培南 頭孢噻肟，頭孢曲松 替卡西林/克拉維酸 環(huán)丙沙星，亞胺培南 妥布霉素，復(fù)方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三級(jí) 氨曲南，頭孢他啶頭孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四環(huán)素，氯霉素 2022-7-729常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(2) 葡萄球菌腸球菌一級(jí) 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨芐西林二級(jí) 紅霉素類萬(wàn)古霉素 克林霉素，萬(wàn)古霉素三級(jí) 氯霉素慶大霉素2022-7-730常規(guī)測(cè)試

10、并報(bào)告的藥物分組常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(3) 流感嗜血桿菌肺炎鏈球菌一級(jí) 氨芐西林，青霉素青霉素，紅霉素 復(fù)方磺胺 復(fù)方磺胺二級(jí) 頭孢呋肟，頭孢噻肟氧氟沙星，四環(huán)素 頭孢他啶，氯霉素 萬(wàn)古霉素三級(jí) 阿奇霉素，頭孢克羅氯霉素，利福平 環(huán)丙沙星，亞胺培南利福平，四環(huán)素2022-7-731預(yù)報(bào)用藥(一) 測(cè)試藥菌名推測(cè)其他藥物的敏感性 苯唑西林 葡萄球菌所有-內(nèi)酰胺類 四環(huán)素所有（除葡多西環(huán)素，米諾環(huán)素 萄球菌和不 動(dòng)桿菌紅霉素G球菌羅紅霉素，克拉霉素， 阿奇霉素克林霉素所有林可霉素2022-7-732預(yù)報(bào)用藥(二)測(cè)試藥菌名推測(cè)其他藥物的敏感性氨芐西林腸球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨芐西林，美洛西

11、林 替卡西林頭孢噻吩腸桿菌科頭孢拉定，頭孢氨芐 頭孢克羅奈啶酸腸桿菌科所有氟喹諾酮類萬(wàn)古霉素所有替考拉寧以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），經(jīng)培養(yǎng)后觀察其最低抑菌濃度。 稀釋法中用瓊脂培養(yǎng)基者為瓊脂稀釋法，用肉湯培養(yǎng)基者為肉湯稀釋法。 藥敏試驗(yàn)-稀釋法常用抗菌藥物容積稀釋法步驟濃度（mg/mL）來(lái)源體積(mL)CAMHB(mL)最終濃度（mg/mL）15120儲(chǔ)存液195122512步驟1112563512步驟1131284512步驟11764564步驟41132664步驟41316764步驟417888步驟711498步驟7132108步驟71

12、71111步驟10110.5121步驟10130.25131步驟10170.125原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入100l濃度為105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，351620h觀察結(jié)果。孔底部清晰不出現(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度，通過(guò)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng)，經(jīng)35過(guò)夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。 微量液體稀釋法 (microdilution test) 操作方法：1.抗菌藥物的稀釋和融解2.在

13、微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素 100l，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。 3.挑選1824小時(shí)的菌落置M-H肉湯增菌46小時(shí)。4.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，然?:200稀釋，使之最終 濃度105 CFU/ml。5.用微量加樣器接種100l 到96孔中，蓋上蓋板。 同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。 6.手工看濁度或儀器自動(dòng) 判讀。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào) 告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為 敏感、耐藥和中介。 閱讀結(jié)果的正確光源注：閱讀葡萄球菌中應(yīng)注意的紙片法藥敏結(jié)果是任何有可見(jiàn)的菌落生長(zhǎng)均應(yīng)視作對(duì)抗菌藥物耐藥2022-7-741肉湯稀釋法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清抗

14、生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml ， 孵育35，1620h，判讀。2022-7-742瓊脂稀釋法 濃度 16 32 64 128 256 ug/ml 制備含對(duì)倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104/每個(gè)點(diǎn)，孵育，判讀結(jié)果2022-7-743肉湯稀釋法調(diào)節(jié)離子濃度的MH肉湯宏量肉湯法（2ml, 13x100mm ）微量肉湯法 （ 0.1ml, 微量板） 自動(dòng)化儀優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，可靠，可用于研究。缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大細(xì)菌生長(zhǎng)情況不可查2022-7-744瓊脂稀釋法優(yōu)點(diǎn)：金標(biāo)準(zhǔn) 精確可靠可同時(shí)測(cè)定多株菌（40株）細(xì)菌生長(zhǎng)情況可查缺點(diǎn)： 測(cè)多個(gè)藥時(shí)勞動(dòng)強(qiáng)度大制備平皿費(fèi)時(shí)費(fèi)力E test 法nE

15、試條是一條5mm50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度；n抗菌藥物的梯度可覆蓋有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍；n將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度。 操作方法：14步驟與紙片擴(kuò)散法相同。5.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置6條，9mm平板只能放置12試條 。6.孵育，置平板于35孵育1624h。 7.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交 處的

16、刻度即為抗菌藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(MIC) 。2022-7-7wanghui-ART48E test 法 細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)E test 塑料條橢圓形細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)256128 8016判讀抑菌濃度（MIC ug/ml)2022-7-749E test 法優(yōu)點(diǎn)連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡(jiǎn)單，省時(shí)缺點(diǎn)：昂貴用途：快生長(zhǎng)菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌， 分枝桿菌2022-7-750聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)體外聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)的目的：擴(kuò)大抗菌譜，治療混合感染預(yù)防或推遲細(xì)菌耐藥性的發(fā)生聯(lián)合用藥可以減少劑量景避免達(dá)到毒性劑量對(duì)某些耐藥細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染，聯(lián)合用藥比單一用藥時(shí)效果更好。聯(lián)合

17、藥物敏感試驗(yàn)抗菌藥物聯(lián)合用藥可出現(xiàn)4種結(jié)果：無(wú)關(guān)作用：兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨(dú)活性。拮抗作用：兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨(dú)抗菌活性。累加作用：兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)的活性等于兩種單獨(dú)抗菌活性之和。協(xié)同作用：兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨(dú)作用總和。聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)棋盤稀釋法是目前臨床最常用的定量方法，利用肉湯稀釋法的原理，首先分別測(cè)定擬聯(lián)合的抗菌藥物對(duì)檢測(cè)是菌的MIC，根據(jù)所得MIC確定藥物稀釋度（一般為68個(gè)稀釋度），藥物最高稀釋度為其MIC值的2倍，依次對(duì)倍稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進(jìn)行，接種菌量為5105cfu/ml,35孵育18 24小時(shí)后觀察結(jié)果。計(jì)算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合的MIC/ A藥單測(cè)MIC+ B藥聯(lián)合的MIC/ B藥單測(cè)MIC。判斷標(biāo)準(zhǔn)： FIC指數(shù)，0.5為協(xié)同作用； 0.5 1相加作用； 1 2 無(wú)關(guān)作用； 2拮抗作用厭氧菌體外藥物敏感試驗(yàn)由于厭氧菌感