第十二章 食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測

1、第一節(jié) 概述 轉(zhuǎn)基因生物：利用基因工程技術(shù)改變基因組的構(gòu)成， 用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工動植物、微生物及產(chǎn)品。主要是轉(zhuǎn)基因植物。 轉(zhuǎn)基因食品：轉(zhuǎn)基因動植物、微生物產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因大豆：轉(zhuǎn)基因動植物、微生物產(chǎn)品直接加工品，如轉(zhuǎn)基因大豆油：以 和為原料生產(chǎn)的食品和添加劑，如轉(zhuǎn)基因大豆油加工成的人造奶油。 轉(zhuǎn)基因成分（外源基因成分）：物種本身不具有的，而是來源于其他物種的功能基因序列。轉(zhuǎn)基因食品的特征 具有其原有基因表達的性狀和功能 存在外源DNA的表達產(chǎn)物及其生物活性基因重組體 載體：自我復(fù)制，運載工具 目的基因：轉(zhuǎn)基因生物性狀改變直接相關(guān)DNA 調(diào)控元件：使目的基因表達精確開始和終止，表達增強 標(biāo)

2、記基因：進行標(biāo)記以便篩選轉(zhuǎn)化細胞 報告基因：編碼某種易于檢測蛋白質(zhì)或酶的基因基因組基因組基因組基因組啟動子啟動子終止子終止子外源目的基因外源目的基因基因重組體示意圖基因重組體示意圖外源基因表達的產(chǎn)物主要包括：目的基因、標(biāo)記基因和報告基因表達的蛋白，或意外表達的蛋白。使得其具有有傳統(tǒng)食物有不同的生物特性，由此產(chǎn)生安全性問題。第二節(jié) 食品中轉(zhuǎn)基因成分檢驗檢測方法概述主要針對外源DNA 及其表達產(chǎn)物DNA分析蛋白質(zhì)抗原特性PCR法ELISA和蛋白印跡法檢測流程采樣采樣混樣混樣樣品制備樣品制備目標(biāo)物質(zhì)提取目標(biāo)物質(zhì)提取PCR或蛋白質(zhì)檢測或蛋白質(zhì)檢測結(jié)果判斷結(jié)果判斷結(jié)果報告結(jié)果報告采樣要求1 一般規(guī)定：所

3、用器具清潔干燥無DNA和蛋白質(zhì)污染；避免樣品散落，防止污染生態(tài)環(huán)境；短時間內(nèi)完成，避免樣品組成發(fā)生變化2 抽樣方法：隨機原則；“三層五點”；若加工工程損壞DNA,則加大采樣量采樣要求3 抽樣數(shù)量：根據(jù)轉(zhuǎn)基因限量水平確定每批中應(yīng)抽取的原始樣品最小數(shù)量4 樣品制備與保存：分三份，用于檢測，復(fù)檢和備查；及時加貼標(biāo)簽，注明編號、貨物名稱、品種、抽樣時間、抽樣人及其他必要信息外源基因檢測 根據(jù)檢測目的和檢測結(jié)果特異性水平不同， 檢測方法可分為四類：初篩試驗：普遍存在的基因重組通用元件基因特異性試驗：基因重組體中含有的外源基因組成結(jié)構(gòu)特異性試驗：目的基因與調(diào)控基因連接處的核苷酸序列事件特異性試驗：插入的基

4、因序列和植物基因組之間的連接區(qū)DNA提取及純化 為什么要提取純化？植物細胞中DNA主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中，細胞中各種DNA稱為總DNA，其中95%以上的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合存在的。植物細胞中還存在大量多糖、蛋白質(zhì)、多糖、多酚類物質(zhì)和RNA等成分。 這些物質(zhì)都會影響后續(xù)DNA的PCR檢測。DNA提取及純化轉(zhuǎn)基因成分檢測時需要先提取總DNA，利用去污劑或有機溶劑破壞細胞膜，裂解細胞，是DNA與蛋白質(zhì)分離并游離于提取液中，然后去除雜質(zhì)成分。DNA純化的原理是根據(jù)乙醇或異丙醇競爭結(jié)合水分子的能力遠強于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或異丙醇，DNA因溶解度降低而析出。 DNA提取方法 一類：改進的

5、傳統(tǒng)方法，如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法（簡稱CTAB法）、二氧化硅法等。第二類：試劑盒法，試劑盒法因為操作簡便而被廣泛應(yīng)用。 CTAB法樣本準(zhǔn)備：樣本準(zhǔn)備：固體樣本要研磨成大小在2mm以下的顆粒，也可以用液氮研磨至DNA充分釋放并滿足DNA提取的要求；液態(tài)樣本可以通過離心沉淀、加熱蒸發(fā)、冷凍干燥等方法得到干物質(zhì)用于DNA提取。 CTAB法原理CTAB能溶解細胞膜并能與DNA結(jié)合成CTAB-DNA復(fù)合物，該復(fù)合物可溶解于高鹽溶液中（如氯化鈉），蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀，經(jīng)離心后與復(fù)合物分離；然后將該復(fù)合物置于低鹽溶液中，因其不溶性而沉淀析出；最后將復(fù)合物沉淀溶

6、解于高鹽溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，離心后獲得純化的DNA。 CTAB法主要試劑 按下表配置試劑，定容至200ml,高壓滅菌DNA質(zhì)量和純度檢測瓊脂糖凝膠電泳 在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠里進行電泳，紫外燈下觀察DNA條帶判斷核酸定量檢測 紫外分光光度計測定基因組DNA溶液的OD值，OD260/OD280一般在1.7 1.9，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白質(zhì)或有機溶劑污染。 核酸PCR檢測PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。 PCR反應(yīng)體系是由DNA模版、引物、dNTP

7、、DNA聚合酶、鎂離子和緩沖液等組成。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 變性：變性：94退火：退火：56延伸：延伸：72我國標(biāo)準(zhǔn)檢測方法核酸PCR定性檢測：檢測目標(biāo)基因是否存在 （有沒有）核酸PCR定量檢測：檢測目標(biāo)基因存在的量（有多少）1 核酸核酸PCR定性檢測定性檢測檢測原理是定性PCR檢測對象包括轉(zhuǎn)基因食品目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等外源基因和元件。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特異性序列設(shè)計引物，對試樣中外源目的基因進行PCR擴增。依據(jù)擴增產(chǎn)物中是否存在預(yù)期特異性片段，判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。為了提高反應(yīng)準(zhǔn)確性，在試樣PC

8、R反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性和陽性對照。在陽性對照PCR反應(yīng)時，內(nèi)源基因和待測樣品的特異性序列都得到擴增，陰性對照沒有任何擴增，表明PCR體系正常工作。2 實時熒光定量實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR是在普通PCR反應(yīng)體系中，增加能與模版結(jié)合的兩端有熒光基團標(biāo)記的寡聚核苷酸探針。 在PCR體系中加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時，兩條引物分別與待擴增目的DNA片段的5端和3端互補結(jié)合；探針則與兩條引物之間的目的DNA片段互補結(jié)合。Taq酶的53外切酶活性

9、將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 擴增反應(yīng)所經(jīng)歷的PCR循環(huán)數(shù)稱為循環(huán)閾值Ct值。Ct值與模版起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，只要獲得測試樣品的Ct值就可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出該樣品中目標(biāo)核酸的絕對含量。 3 LAMP檢測檢測 LAMP即環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中各個角落的DNA或RNA的特異高效擴增。擴增目的片段時要依賴一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶和四條能夠識別靶序列上六個特異區(qū)域的引物。 本方法特異性高，不需要熱循環(huán)設(shè)備，具有操作

10、簡單、快速的優(yōu)點。蛋白質(zhì)檢測（ELISA）原理原理:從測試樣品中按照一定的程序提取含有目標(biāo)蛋白的基質(zhì)，利用抗體與目標(biāo)蛋白（為抗原）特異性結(jié)合的特性，通過對偶聯(lián)抗原與抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生的信號進行檢測，而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品特異蛋白的檢測。 優(yōu)點：優(yōu)點：具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化。缺點：缺點：由于抗原抗體的專一性，每種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品都需要開發(fā)專門的檢測試劑。另外加工容易破壞蛋白的抗原性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。ELISA吸附原理圖將原料樣品粉碎后，加入緩沖液混勻，震蕩抽提蛋白質(zhì)，離心后去上清液稀釋，加入偶聯(lián)抗體孵育，在一定條件下是特異性蛋白進行顯色反應(yīng)，測定其吸光值。同時使用與基質(zhì)一致的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)

11、準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)外源蛋白的濃度。 每一輪反應(yīng)都要包括空白、陰性標(biāo)準(zhǔn)品、陽性標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品。蛋白質(zhì)檢測操作蛋白質(zhì)檢測操作其他檢測方法1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析 通過研究外源基因在同種或不同種作物中的蛋白質(zhì)差異性表達檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 目前主要采用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)及基于同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析技術(shù)進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析 優(yōu)點：不僅能夠鑒定差異表達的蛋白，還能對其進行較為準(zhǔn)確的定量2 近紅外光譜分析法3 變性高效液相色譜法基于異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中保留時間比同源雙鏈短，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或者多峰的

12、洗脫曲線。只能鑒定是否存在轉(zhuǎn)基因成分，不能檢測轉(zhuǎn)基因具體發(fā)生的位置及該區(qū)域的基因序列等信息?；蛐酒夹g(shù)基因芯片：基因芯片：通過微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬計的特定序列的DNA片段（基因探針）有規(guī)律地排列固定于支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，與計算機的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片。 基片：基片：又稱載片，是基因芯片中用于固定探針的基質(zhì)，通常采用標(biāo)準(zhǔn)的載玻片或者其他固體載體，經(jīng)過化學(xué)修飾制備而成。 基因芯片探針：基因芯片探針：又稱寡核苷酸探針，是基因芯片中固定于基質(zhì)表面、能與樣本DNA互補、用于探測樣本DNA信息的核酸分子。 雜交：雜交：指兩條互補的單鏈核酸形成一條穩(wěn)定的 雙螺旋分子的

13、過程基因芯片檢測原理：探針與待測樣品中目標(biāo)序列按堿基互補原理發(fā)生特異性雜交反應(yīng)，從而實現(xiàn)對目標(biāo)序列的檢測?；蛐酒瑱z測流程樣品樣品核酸核酸cDNA文庫文庫DNA列陣列陣基片基片基因芯片基因芯片標(biāo)記的核酸標(biāo)記的核酸核酸雜交核酸雜交洗滌洗滌檢測檢測提取PCR、標(biāo)記PCR、純化固定基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢驗中的應(yīng)用 檢測芯片：檢測芯片： 進行轉(zhuǎn)基因成分篩選； 轉(zhuǎn)基因食品品系或品種確定； 轉(zhuǎn)基因重組體構(gòu)成元件分析。 表達譜芯片表達譜芯片 主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品安全性評估 ，評價轉(zhuǎn)基因食品中外源特異性成分產(chǎn)生了怎樣的影響。包括：營養(yǎng)成分、毒性、過敏物質(zhì)等變化；基 因突變或代謝途徑改變；人體內(nèi)發(fā)生 突變而有害人體健康的可能性等。 優(yōu)點：優(yōu)點：基因芯片與傳統(tǒng)的檢測方法相比，靈敏性、特異性高，假陽性、假陰性率低，操作簡便快速，高通量。缺點：缺點：成本高l基片材料選擇固體類或薄膜類：普通玻璃片、硅片、聚丙烯膜、尼龍膜等能適應(yīng)透射光和反射光測量 具有惰性和穩(wěn)定性能使單位載體上結(jié)合的分子數(shù)達到最大具有活性基團l基片活化 對載體表面進行化學(xué)預(yù)處理，使探針固定于介質(zhì)表面 在基片上結(jié)合的活性基團：氨基、巰基、醛基、環(huán)氧化