第十二章 食品中轉基因成分的檢測

1、第一節(jié) 概述 轉基因生物：利用基因工程技術改變基因組的構成， 用于農業(yè)生產或者農產品加工動植物、微生物及產品。主要是轉基因植物。 轉基因食品：轉基因動植物、微生物產品，如轉基因大豆：轉基因動植物、微生物產品直接加工品，如轉基因大豆油：以 和為原料生產的食品和添加劑，如轉基因大豆油加工成的人造奶油。 轉基因成分（外源基因成分）：物種本身不具有的，而是來源于其他物種的功能基因序列。轉基因食品的特征 具有其原有基因表達的性狀和功能 存在外源DNA的表達產物及其生物活性基因重組體 載體：自我復制，運載工具 目的基因：轉基因生物性狀改變直接相關DNA 調控元件：使目的基因表達精確開始和終止，表達增強 標

2、記基因：進行標記以便篩選轉化細胞 報告基因：編碼某種易于檢測蛋白質或酶的基因基因組基因組基因組基因組啟動子啟動子終止子終止子外源目的基因外源目的基因基因重組體示意圖基因重組體示意圖外源基因表達的產物主要包括：目的基因、標記基因和報告基因表達的蛋白，或意外表達的蛋白。使得其具有有傳統(tǒng)食物有不同的生物特性，由此產生安全性問題。第二節(jié) 食品中轉基因成分檢驗檢測方法概述主要針對外源DNA 及其表達產物DNA分析蛋白質抗原特性PCR法ELISA和蛋白印跡法檢測流程采樣采樣混樣混樣樣品制備樣品制備目標物質提取目標物質提取PCR或蛋白質檢測或蛋白質檢測結果判斷結果判斷結果報告結果報告采樣要求1 一般規(guī)定：所

3、用器具清潔干燥無DNA和蛋白質污染；避免樣品散落，防止污染生態(tài)環(huán)境；短時間內完成，避免樣品組成發(fā)生變化2 抽樣方法：隨機原則；“三層五點”；若加工工程損壞DNA,則加大采樣量采樣要求3 抽樣數(shù)量：根據(jù)轉基因限量水平確定每批中應抽取的原始樣品最小數(shù)量4 樣品制備與保存：分三份，用于檢測，復檢和備查；及時加貼標簽，注明編號、貨物名稱、品種、抽樣時間、抽樣人及其他必要信息外源基因檢測 根據(jù)檢測目的和檢測結果特異性水平不同， 檢測方法可分為四類：初篩試驗：普遍存在的基因重組通用元件基因特異性試驗：基因重組體中含有的外源基因組成結構特異性試驗：目的基因與調控基因連接處的核苷酸序列事件特異性試驗：插入的基

4、因序列和植物基因組之間的連接區(qū)DNA提取及純化 為什么要提取純化？植物細胞中DNA主要存在于細胞核和細胞質中，細胞中各種DNA稱為總DNA，其中95%以上的DNA是與蛋白質結合存在的。植物細胞中還存在大量多糖、蛋白質、多糖、多酚類物質和RNA等成分。 這些物質都會影響后續(xù)DNA的PCR檢測。DNA提取及純化轉基因成分檢測時需要先提取總DNA，利用去污劑或有機溶劑破壞細胞膜，裂解細胞，是DNA與蛋白質分離并游離于提取液中，然后去除雜質成分。DNA純化的原理是根據(jù)乙醇或異丙醇競爭結合水分子的能力遠強于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或異丙醇，DNA因溶解度降低而析出。 DNA提取方法 一類：改進的

5、傳統(tǒng)方法，如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法（簡稱CTAB法）、二氧化硅法等。第二類：試劑盒法，試劑盒法因為操作簡便而被廣泛應用。 CTAB法樣本準備：樣本準備：固體樣本要研磨成大小在2mm以下的顆粒，也可以用液氮研磨至DNA充分釋放并滿足DNA提取的要求；液態(tài)樣本可以通過離心沉淀、加熱蒸發(fā)、冷凍干燥等方法得到干物質用于DNA提取。 CTAB法原理CTAB能溶解細胞膜并能與DNA結合成CTAB-DNA復合物，該復合物可溶解于高鹽溶液中（如氯化鈉），蛋白質、多糖等物質在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀，經(jīng)離心后與復合物分離；然后將該復合物置于低鹽溶液中，因其不溶性而沉淀析出；最后將復合物沉淀溶

6、解于高鹽溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，離心后獲得純化的DNA。 CTAB法主要試劑 按下表配置試劑，定容至200ml,高壓滅菌DNA質量和純度檢測瓊脂糖凝膠電泳 在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠里進行電泳，紫外燈下觀察DNA條帶判斷核酸定量檢測 紫外分光光度計測定基因組DNA溶液的OD值，OD260/OD280一般在1.7 1.9，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白質或有機溶劑污染。 核酸PCR檢測PCR即聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。 PCR反應體系是由DNA模版、引物、dNTP

7、、DNA聚合酶、鎂離子和緩沖液等組成。 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 變性：變性：94退火：退火：56延伸：延伸：72我國標準檢測方法核酸PCR定性檢測：檢測目標基因是否存在 （有沒有）核酸PCR定量檢測：檢測目標基因存在的量（有多少）1 核酸核酸PCR定性檢測定性檢測檢測原理是定性PCR檢測對象包括轉基因食品目的基因、啟動子、終止子、標記基因等外源基因和元件。根據(jù)轉基因產品的特異性序列設計引物，對試樣中外源目的基因進行PCR擴增。依據(jù)擴增產物中是否存在預期特異性片段，判斷樣品中是否含有轉基因成分。為了提高反應準確性，在試樣PC

8、R反應的同時，應設置陰性和陽性對照。在陽性對照PCR反應時，內源基因和待測樣品的特異性序列都得到擴增，陰性對照沒有任何擴增，表明PCR體系正常工作。2 實時熒光定量實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR是在普通PCR反應體系中，增加能與模版結合的兩端有熒光基團標記的寡聚核苷酸探針。 在PCR體系中加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時，兩條引物分別與待擴增目的DNA片段的5端和3端互補結合；探針則與兩條引物之間的目的DNA片段互補結合。Taq酶的53外切酶活性

9、將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。 擴增反應所經(jīng)歷的PCR循環(huán)數(shù)稱為循環(huán)閾值Ct值。Ct值與模版起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關系，只要獲得測試樣品的Ct值就可以利用標準曲線計算出該樣品中目標核酸的絕對含量。 3 LAMP檢測檢測 LAMP即環(huán)介導恒溫擴增，已經(jīng)被廣泛地應用于生命科學領域中各個角落的DNA或RNA的特異高效擴增。擴增目的片段時要依賴一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶和四條能夠識別靶序列上六個特異區(qū)域的引物。 本方法特異性高，不需要熱循環(huán)設備，具有操作

10、簡單、快速的優(yōu)點。蛋白質檢測（ELISA）原理原理:從測試樣品中按照一定的程序提取含有目標蛋白的基質，利用抗體與目標蛋白（為抗原）特異性結合的特性，通過對偶聯(lián)抗原與抗體復合物的作用產生的信號進行檢測，而實現(xiàn)對轉基因產品特異蛋白的檢測。 優(yōu)點：優(yōu)點：具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化。缺點：缺點：由于抗原抗體的專一性，每種轉基因產品都需要開發(fā)專門的檢測試劑。另外加工容易破壞蛋白的抗原性，影響結果的準確性。ELISA吸附原理圖將原料樣品粉碎后，加入緩沖液混勻，震蕩抽提蛋白質，離心后去上清液稀釋，加入偶聯(lián)抗體孵育，在一定條件下是特異性蛋白進行顯色反應，測定其吸光值。同時使用與基質一致的標準品制作標

11、準曲線，根據(jù)標準曲線計算相應外源蛋白的濃度。 每一輪反應都要包括空白、陰性標準品、陽性標準品和測試樣品。蛋白質檢測操作蛋白質檢測操作其他檢測方法1 蛋白質組學技術分析 通過研究外源基因在同種或不同種作物中的蛋白質差異性表達檢測轉基因產品 目前主要采用雙向電泳-質譜技術及基于同位素標記的質譜分析技術進行蛋白質組學分析 優(yōu)點：不僅能夠鑒定差異表達的蛋白，還能對其進行較為準確的定量2 近紅外光譜分析法3 變性高效液相色譜法基于異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中保留時間比同源雙鏈短，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或者多峰的

12、洗脫曲線。只能鑒定是否存在轉基因成分，不能檢測轉基因具體發(fā)生的位置及該區(qū)域的基因序列等信息?；蛐酒夹g基因芯片：基因芯片：通過微加工技術 ，將數(shù)以萬計的特定序列的DNA片段（基因探針）有規(guī)律地排列固定于支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，與計算機的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片。 基片：基片：又稱載片，是基因芯片中用于固定探針的基質，通常采用標準的載玻片或者其他固體載體，經(jīng)過化學修飾制備而成。 基因芯片探針：基因芯片探針：又稱寡核苷酸探針，是基因芯片中固定于基質表面、能與樣本DNA互補、用于探測樣本DNA信息的核酸分子。 雜交：雜交：指兩條互補的單鏈核酸形成一條穩(wěn)定的 雙螺旋分子的

13、過程基因芯片檢測原理：探針與待測樣品中目標序列按堿基互補原理發(fā)生特異性雜交反應，從而實現(xiàn)對目標序列的檢測?；蛐酒瑱z測流程樣品樣品核酸核酸cDNA文庫文庫DNA列陣列陣基片基片基因芯片基因芯片標記的核酸標記的核酸核酸雜交核酸雜交洗滌洗滌檢測檢測提取PCR、標記PCR、純化固定基因芯片技術在轉基因食品檢驗中的應用 檢測芯片：檢測芯片： 進行轉基因成分篩選； 轉基因食品品系或品種確定； 轉基因重組體構成元件分析。 表達譜芯片表達譜芯片 主要應用于轉基因食品安全性評估 ，評價轉基因食品中外源特異性成分產生了怎樣的影響。包括：營養(yǎng)成分、毒性、過敏物質等變化；基 因突變或代謝途徑改變；人體內發(fā)生 突變而有害人體健康的可能性等。 優(yōu)點：優(yōu)點：基因芯片與傳統(tǒng)的檢測方法相比，靈敏性、特異性高，假陽性、假陰性率低，操作簡便快速，高通量。缺點：缺點：成本高l基片材料選擇固體類或薄膜類：普通玻璃片、硅片、聚丙烯膜、尼龍膜等能適應透射光和反射光測量 具有惰性和穩(wěn)定性能使單位載體上結合的分子數(shù)達到最大具有活性基團l基片活化 對載體表面進行化學預處理，使探針固定于介質表面 在基片上結合的活性基團：氨基、巰基、醛基、環(huán)氧化