第二章發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備與培養(yǎng)基

1、第二章 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備與培養(yǎng)基第一節(jié)工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物第一節(jié)工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物一、微生物的特性一、微生物的特性q 有些微生物能在厭氧的條件下生長(zhǎng)有些微生物能在厭氧的條件下生長(zhǎng)q 有些微生物能夠利用簡(jiǎn)單的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物滿足自身有些微生物能夠利用簡(jiǎn)單的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物滿足自身 的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)q 有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝q 有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物q 有些微生物能在極端的環(huán)境下生長(zhǎng)有些微生物能在極端的環(huán)境下生長(zhǎng)二：工業(yè)化菌種的要求二：工業(yè)化菌種的要求q 能夠利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，大量高效地合成能夠利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培

2、養(yǎng)基，大量高效地合成 產(chǎn)物產(chǎn)物q 有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡(jiǎn)單，或者說(shuō)菌種改造的有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡(jiǎn)單，或者說(shuō)菌種改造的 可操作性要強(qiáng)可操作性要強(qiáng)q 遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定q 不易感染它種微生物或噬菌體不易感染它種微生物或噬菌體q 產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病 菌無(wú)關(guān)）菌無(wú)關(guān)）q 生產(chǎn)特性要符合工藝要求生產(chǎn)特性要符合工藝要求 由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類（由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。）等

3、也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。 盡管如此，目前人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)還是十分不夠的。已經(jīng)盡管如此，目前人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)還是十分不夠的。已經(jīng)初步研究的不超過(guò)自然界微生物總量的初步研究的不超過(guò)自然界微生物總量的10%左右。左右。 微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)一千三百多種，而大規(guī)模生微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)一千三百多種，而大規(guī)模生產(chǎn)的不超過(guò)一百多種；產(chǎn)的不超過(guò)一百多種； 微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過(guò)四五十種?？梢?jiàn)微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過(guò)四五十種。可見(jiàn)潛力是很大的。潛力是很大的。 在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母

4、菌、霉菌和放線菌。線菌。三、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物三、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物1、 細(xì)菌（細(xì)菌（bacteria）：）：可粗分為可粗分為6種類型，即細(xì)菌（狹義）、放線菌、螺旋體、支原種類型，即細(xì)菌（狹義）、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體和衣原體。是一類形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多以體、立克次氏體和衣原體。是一類形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多以二分裂方式進(jìn)行繁殖的二分裂方式進(jìn)行繁殖的原核生物原核生物，是在，是在自然界自然界分布最廣、個(gè)體分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。根據(jù)形物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。根據(jù)形狀分為三類，即：狀分為三類，即：球菌球菌、桿菌桿菌和和螺

5、形菌螺形菌。 按細(xì)菌的按細(xì)菌的生活生活方式來(lái)方式來(lái)分類，分為兩大類：自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，其中異養(yǎng)菌包括腐生菌分類，分為兩大類：自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，其中異養(yǎng)菌包括腐生菌和寄生菌。按細(xì)菌對(duì)氧氣的需求來(lái)分類，可分為需氧（完全需和寄生菌。按細(xì)菌對(duì)氧氣的需求來(lái)分類，可分為需氧（完全需氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細(xì)氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細(xì)菌。菌。 工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 乳酸桿菌乳酸桿菌(Lactobacillus lactics) 醋酸桿菌醋酸桿菌(Acetobacter) 棒

6、狀桿菌棒狀桿菌(Corynebacterium) 短桿菌短桿菌(Brevibacterium) 用于生產(chǎn)：用于生產(chǎn)： 生產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) 2、 酵母菌（酵母菌（yeast） 酵母菌為單細(xì)胞真核生物（酵母菌為單細(xì)胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的

7、的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜（、花蜜（nectar）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（petroleum yeast）較多地分布在油田周圍的土壤中。）較多地分布在油田周圍的土壤中。 酵母菌大多為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。酵母菌大多為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。母細(xì)胞體積長(zhǎng)到一定程度時(shí)就開(kāi)始發(fā)芽。芽長(zhǎng)大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，母細(xì)胞體積長(zhǎng)到一定程度時(shí)就開(kāi)始發(fā)芽。芽長(zhǎng)大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，在母子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母細(xì)胞。如果子芽不與在母子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母細(xì)胞。如果子芽不與母細(xì)胞脫離就形

8、成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲母細(xì)胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲(pseudomycelium)。 工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假、假絲酵母絲酵母(Candida)、類酵母、類酵母(Saccharomycodes)等，用于釀酒等，用于釀酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶（、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶（lipase），以及生產(chǎn)可），以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。 3、 霉菌（霉菌（mould） 霉菌不是一個(gè)分類學(xué)上的名詞。凡生長(zhǎng)在霉菌

9、不是一個(gè)分類學(xué)上的名詞。凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌真菌(fungi)統(tǒng)稱為霉菌。統(tǒng)稱為霉菌。 霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土壤、空氣、水和生物體內(nèi)外等處。它喜歡偏壤、空氣、水和生物體內(nèi)外等處。它喜歡偏酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性(aerobiotic)，多，多腐生，少數(shù)寄生。霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它腐生，少數(shù)寄生。霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它以無(wú)性孢子和有性孢子進(jìn)行繁殖，大多以無(wú)以無(wú)性孢子和有性孢子進(jìn)行繁殖，大多以無(wú)性孢子繁殖為主。性孢子繁殖為主。 生長(zhǎng)方式是菌絲末端的伸長(zhǎng)和頂端分支

10、，彼此生長(zhǎng)方式是菌絲末端的伸長(zhǎng)和頂端分支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。菌絲的長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又受交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。菌絲的長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又受環(huán)境的影響，其分支數(shù)量取決于環(huán)境條件。菌絲或環(huán)境的影響，其分支數(shù)量取決于環(huán)境條件。菌絲或呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生長(zhǎng)。呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生長(zhǎng)。 工業(yè)上常用的霉菌有：工業(yè)上常用的霉菌有： 藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等；曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等； 產(chǎn)品：產(chǎn)品： 酶制劑（酶制劑（enzyme preparation）、抗生素）、抗生素(antibiotic)、有機(jī)酸（、有機(jī)酸

11、（organic acid）及甾體激素）及甾體激素（steroid hormone） 等。等。 4、 放線菌放線菌(Actinomycetes) 放線菌因菌落呈防線狀而得名。它是一個(gè)原放線菌因菌落呈防線狀而得名。它是一個(gè)原核生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在含有核生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數(shù)機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數(shù)寄生。寄生。 放線菌主要以無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌放線菌主要以無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲片段進(jìn)行繁殖。后一種繁殖方式見(jiàn)于液體沉浸絲片段進(jìn)行繁殖。后一種繁殖方式見(jiàn)于液體沉浸培養(yǎng)（培養(yǎng)（submerged cu

12、ltures）中。其生長(zhǎng)方式是）中。其生長(zhǎng)方式是菌絲末端伸長(zhǎng)和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，成菌絲末端伸長(zhǎng)和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，成為菌絲體。菌絲長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又與環(huán)為菌絲體。菌絲長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又與環(huán)境相關(guān)。境相關(guān)。 在液體沉浸培養(yǎng)中由于攪拌器（在液體沉浸培養(yǎng)中由于攪拌器（agitator）的作用，常常形成短的分支旺盛）的作用，常常形成短的分支旺盛的菌絲體，或呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生的菌絲體，或呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生長(zhǎng)。它的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生長(zhǎng)。它的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素（素（antibiotics）。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生）。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，

13、有素，有60%以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。 常用的放線菌主要來(lái)自以下幾個(gè)屬：鏈常用的放線菌主要來(lái)自以下幾個(gè)屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。 5、 擔(dān)子菌（擔(dān)子菌（Basidiomycetes ）：所謂的擔(dān)）：所謂的擔(dān)子菌就是人們通常所說(shuō)的菇類子菌就是人們通常所說(shuō)的菇類(mushroom)生物生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來(lái)愈引起人們的重視。擔(dān)子菌資源的利用正愈來(lái)愈引起人們的重視，如多糖，如多糖(polysaccharide)、抗癌、抗癌(anticancer)藥藥物的開(kāi)

14、發(fā)。物的開(kāi)發(fā)。 近幾年來(lái)，日本、美國(guó)的一些科學(xué)家對(duì)香菇近幾年來(lái)，日本、美國(guó)的一些科學(xué)家對(duì)香菇的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質(zhì)具有抗及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。癌作用。 6、藻類（、藻類（alga）：）： 培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算每公頃可收獲培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算每公頃可收獲60噸，而種植大噸，而種植大豆每公頃才可獲豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來(lái)看，螺旋藻是大豆噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來(lái)看，螺旋藻是大豆28倍。倍。 培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得蛋培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得

15、蛋白質(zhì)是小麥的白質(zhì)是小麥的20-35倍。此外，還可通過(guò)藻類將倍。此外，還可通過(guò)藻類將CO轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)槭?，培養(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細(xì)胞干重石油，培養(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細(xì)胞干重得得5%-50%,合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽油、煤油合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽油、煤油、和其他產(chǎn)品。、和其他產(chǎn)品。 有的國(guó)家已建立培植單胞藻的農(nóng)場(chǎng)，每年每公頃地培植有的國(guó)家已建立培植單胞藻的農(nóng)場(chǎng)，每年每公頃地培植的單胞藻暗的單胞藻暗5%干物質(zhì)為碳水化合物（石油）計(jì)算，可得干物質(zhì)為碳水化合物（石油）計(jì)算，可得60噸石油燃料。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量噸石油燃料。此項(xiàng)

16、技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量排放排放CO造成的溫室效應(yīng)。國(guó)外還有人從造成的溫室效應(yīng)。國(guó)外還有人從“藻類農(nóng)場(chǎng)藻類農(nóng)場(chǎng)”獲取獲取氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng)藻類，利用其光合放氫作用來(lái)取得氫氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng)藻類，利用其光合放氫作用來(lái)取得氫能。能。第二節(jié)第二節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏 一、微生物菌種衰退的原因一、微生物菌種衰退的原因 1、原因、原因 一是菌種保藏不妥一是菌種保藏不妥; 二是菌種生長(zhǎng)的要求沒(méi)有得到滿足，或是遇到不利二是菌種生長(zhǎng)的要求沒(méi)有得到滿足，或是遇到不利的條件，或是失去某些需要的條件；的條件，或是失去某些需要的條件； 三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生回復(fù)突變，從而

17、喪失三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生回復(fù)突變，從而喪失新的特征的情況。新的特征的情況。 連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因。連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因。 衰退菌株的特點(diǎn)：個(gè)體或群體特征發(fā)生變化；生產(chǎn)衰退菌株的特點(diǎn)：個(gè)體或群體特征發(fā)生變化；生產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長(zhǎng)；抗不良環(huán)境能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長(zhǎng)；抗不良環(huán)境能力降低。能力降低。 2、防止菌種衰退的措施、防止菌種衰退的措施 菌種的分離菌種的分離: 。 對(duì)于已衰退的菌株采用單細(xì)胞菌株分離對(duì)于已衰退的菌株采用單細(xì)胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得單細(xì)胞所長(zhǎng)成的菌落（以取得單

18、細(xì)胞所長(zhǎng)成的菌落（colony），再），再通過(guò)菌落和菌體的特征分析和性能測(cè)定，就通過(guò)菌落和菌體的特征分析和性能測(cè)定，就可獲得具有原來(lái)形狀的菌株，甚至性能更好可獲得具有原來(lái)形狀的菌株，甚至性能更好的菌株（的菌株（strain）。）。 如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進(jìn)行分離復(fù)壯。進(jìn)行分離復(fù)壯。 如對(duì)芽孢桿菌如對(duì)芽孢桿菌(Bacillus)，可先將菌液用可先將菌液用沸水處理幾分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所沸水處理幾分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所剩下的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體。剩下的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體。 某些菌株即使進(jìn)行單細(xì)胞分離，仍不能某些菌株即使進(jìn)行單細(xì)胞分

19、離，仍不能達(dá)到復(fù)壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達(dá)到達(dá)到復(fù)壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達(dá)到復(fù)壯的目的。復(fù)壯的目的。 如如AT3.942棲土曲霉棲土曲霉(Aspergillus terricola)的產(chǎn)孢子能力下降，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，的產(chǎn)孢子能力下降，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，恢復(fù)其能力?；謴?fù)其能力。 同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇一種有利于高產(chǎn)菌株同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。二二 菌種的復(fù)壯菌種的復(fù)壯 通過(guò)分離達(dá)到復(fù)壯通過(guò)分離達(dá)到復(fù)壯: 在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)再分離，達(dá)到菌落脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)再分離，達(dá)到菌落純

20、純 采用單細(xì)胞或單孢子分離法達(dá)采用單細(xì)胞或單孢子分離法達(dá)到細(xì)胞純到細(xì)胞純 通過(guò)寄主體達(dá)到復(fù)壯通過(guò)寄主體達(dá)到復(fù)壯: 將菌株接種到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁將菌株接種到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁殖達(dá)到復(fù)壯。殖達(dá)到復(fù)壯。 三三 菌種保藏（菌種保藏（strain preservation） 基本原理：根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人工基本原理：根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活波狀態(tài)。地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活波狀態(tài)。 要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡量使菌種保持原來(lái)優(yōu)良的生產(chǎn)性能。量使菌種保持原來(lái)優(yōu)良的生產(chǎn)性能。 保藏時(shí)首先選擇優(yōu)良純菌種

21、，最好是它們的休眠保藏時(shí)首先選擇優(yōu)良純菌種，最好是它們的休眠體如孢子（體如孢子（ spore）、芽孢）、芽孢 (gemma)等；其次是要等；其次是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的，即可達(dá)到降低其代謝活動(dòng)缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的，即可達(dá)到降低其代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)其保存期的目的。，延長(zhǎng)其保存期的目的。 保存方法：保存方法： 應(yīng)能較長(zhǎng)期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同應(yīng)能較長(zhǎng)期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同時(shí)也要考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。不同的菌種有不同的保時(shí)也要考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。不同的菌種有不同的保存方

22、法，以便長(zhǎng)期保藏。存方法，以便長(zhǎng)期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保藏法。保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。霉菌：沙土管保藏法。 細(xì)菌和放線菌：一般細(xì)菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。細(xì)菌和放線菌：一般細(xì)菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。 放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。 保藏應(yīng)注意的問(wèn)題保藏應(yīng)注意的問(wèn)題： 菌體狀態(tài)：休眠體菌體狀態(tài)：休眠體 基質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)貧乏基質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)貧乏 操作過(guò)程：不應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成傷害操作過(guò)程：不應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成傷害第三節(jié)第三節(jié) 菌株選育菌株選育目的目的q 提高生產(chǎn)能力提高生產(chǎn)能力q 提高產(chǎn)品質(zhì)量

23、提高產(chǎn)品質(zhì)量q 開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品q 解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題q 防止菌種退化防止菌種退化方法方法基因突變：基因突變：自然選育、誘變育種自然選育、誘變育種基因重組：基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程自然狀態(tài)下，發(fā)生自然突變的機(jī)率為自然狀態(tài)下，發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8-10-9自然突變有兩種情況：自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突另一種是我們生產(chǎn)上

24、希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。變成為正突變。一、自然選育一、自然選育自然選育操作步驟：自然選育操作步驟： 一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞單細(xì)胞(孢子孢子)懸液的制備懸液的制備平板分離平板分離挑選單菌落挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵試驗(yàn)二、誘變育種二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子物

25、理：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍原種（出發(fā)菌株）原種（出發(fā)菌株）純化純化斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)基同步培養(yǎng)離心洗滌離心洗滌玻璃珠震蕩分散玻璃珠震蕩分散過(guò)濾過(guò)濾單細(xì)胞或孢子懸浮液?jiǎn)渭?xì)胞或孢子懸浮液 自然分離（對(duì)照液）活菌計(jì)數(shù)自然分離（對(duì)照液）活菌計(jì)數(shù)誘變處理誘變處理 誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn)誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn) 處理液活菌計(jì)數(shù)處理液活菌計(jì)數(shù)平板分離平板分離 形態(tài)變異并計(jì)算其變異率形態(tài)變異并計(jì)算其變異率斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng) 初篩、復(fù)篩初篩、復(fù)篩 自然分離和再?gòu)?fù)篩自然分離和再?gòu)?fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種誘變育種 第四節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)第四節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)

26、 一、一、 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)1、提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。接種量大，發(fā)酵時(shí)、提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。接種量大，發(fā)酵時(shí)間則短。間則短。 2、得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、接、得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。 不同產(chǎn)品的發(fā)酵，決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)。不同產(chǎn)品的發(fā)酵，決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)。 第五節(jié)第五節(jié) 培養(yǎng)基及其制備培養(yǎng)基及其制備培養(yǎng)基是提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種培養(yǎng)基是提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的的多種營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。

27、物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精致、產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影產(chǎn)品的分離精致、產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影響。響。 微生物的營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)，是依靠向外界分泌大量的微生物的營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)，是依靠向外界分泌大量的酶，將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等酶，將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，在借助于細(xì)胞膜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，在借助于細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營(yíng)養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。滲透作用，吸收這些小分子營(yíng)養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 一、培養(yǎng)基的類型和用途一、培養(yǎng)基的類型和用途 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 化

28、學(xué)成分不清楚或化學(xué)成分不恒定的各種植物和動(dòng)化學(xué)成分不清楚或化學(xué)成分不恒定的各種植物和動(dòng)物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)（例如牛肉膏物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)（例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基: 使用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。使用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。使用于實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、使用于實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、 生生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析定量研究工作。物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析定量研究工作。半合成培養(yǎng)基：既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑半合成培養(yǎng)基：既含有天然成分又含

29、有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。的培養(yǎng)基。（生物）鑒別培養(yǎng)基（生物）鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入能與某一菌的無(wú)：培養(yǎng)基中加入能與某一菌的無(wú)色代謝物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而用肉眼區(qū)別于該菌色代謝物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而用肉眼區(qū)別于該菌與其他菌。與其他菌。 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其：根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基 。 固體培養(yǎng)基：外觀呈固體的培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：外觀呈固體的培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：凝固劑量低于正常量半固體培養(yǎng)基：凝固劑量低于正常量液體培養(yǎng)基：呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：呈液體狀態(tài)的

30、培養(yǎng)基。 孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基： 供制備孢子用的培養(yǎng)基?；|(zhì)濃度（有機(jī)氮）供制備孢子用的培養(yǎng)基?；|(zhì)濃度（有機(jī)氮）要低些，否則影響孢子的的形成。無(wú)機(jī)鹽要適量，要低些，否則影響孢子的的形成。無(wú)機(jī)鹽要適量，否則影響孢子的數(shù)量和質(zhì)量。否則影響孢子的數(shù)量和質(zhì)量。 常用的有麩皮、大（?。┟?，無(wú)機(jī)鹽、蛋白胨常用的有麩皮、大（?。┟?，無(wú)機(jī)鹽、蛋白胨等配制的瓊脂等配制的瓊脂 斜面培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基。 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基： 供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)用的培養(yǎng)基。為使培供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)用的培養(yǎng)基。為使培養(yǎng)的種子能較快適應(yīng)發(fā)酵罐內(nèi)的環(huán)境，在設(shè)計(jì)種養(yǎng)的種子能較快適應(yīng)發(fā)酵罐內(nèi)的環(huán)境，在設(shè)計(jì)種子培養(yǎng)基時(shí)要考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基

31、組成的內(nèi)在聯(lián)系。子培養(yǎng)基時(shí)要考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基組成的內(nèi)在聯(lián)系。發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基： 供供菌體生長(zhǎng)和合成大量代謝產(chǎn)物用的培養(yǎng)基。菌體生長(zhǎng)和合成大量代謝產(chǎn)物用的培養(yǎng)基。不同的菌體，不同的產(chǎn)品，對(duì)培養(yǎng)基的要求是不同的。不同的菌體，不同的產(chǎn)品，對(duì)培養(yǎng)基的要求是不同的。不同的發(fā)酵產(chǎn)品，培養(yǎng)基的狀態(tài)、粘度、各成分的含量也不同的發(fā)酵產(chǎn)品，培養(yǎng)基的狀態(tài)、粘度、各成分的含量也是不同的。但是，基本的營(yíng)養(yǎng)需求是一致。因此，應(yīng)根據(jù)是不同的。但是，基本的營(yíng)養(yǎng)需求是一致。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇發(fā)酵培養(yǎng)基。不同的情況選擇發(fā)酵培養(yǎng)基。二、發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的應(yīng)遵循的原則：二、發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的應(yīng)遵循的原則： 1、提供合成微生

32、物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基、提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分本成分. 2、有利于提高培養(yǎng)基中產(chǎn)物的濃度，以、有利于提高培養(yǎng)基中產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。 3、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期酵周期. 4、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化的分離純化 5、原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容、原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。易。 6、所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中、所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率降低能耗。率降低

33、能耗。 有利于產(chǎn)品的分離和純有利于產(chǎn)品的分離和純化，并盡可能減少產(chǎn)生化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢三廢”的物的物質(zhì)。質(zhì)。 另外，要考慮配比、滲透壓、另外，要考慮配比、滲透壓、PH、氧、氧化還原等因素?；€原等因素。 碳源：供給菌體生命活動(dòng)所需的能量和構(gòu)成碳源：供給菌體生命活動(dòng)所需的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。有糖類、脂肪、菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。有糖類、脂肪、某些有機(jī)酸等等。某些有機(jī)酸等等。氮源：主要構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，氮源：主要構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。功能：構(gòu)成菌體可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。功能：構(gòu)成菌體成分；作為酶的組成分或維持酶的活性；調(diào)節(jié)

34、成分；作為酶的組成分或維持酶的活性；調(diào)節(jié)滲透壓、滲透壓、PH值、氧化還原電位等。值、氧化還原電位等。第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽：鈣、鎂、硫、磷、鉀、鈉、氯、鋅、無(wú)機(jī)鹽：鈣、鎂、硫、磷、鉀、鈉、氯、鋅、鈷、錳。鈷、錳。特殊生長(zhǎng)因子：其功能是構(gòu)成輔酶的組成特殊生長(zhǎng)因子：其功能是構(gòu)成輔酶的組成分，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。如生物素、硫胺分，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是極少的。素、肌醇等，但需要量是極少的。水：體內(nèi)各種生化作用必須在水溶液中進(jìn)水：體內(nèi)各種生化作用必須在水溶液中進(jìn)行。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須溶解于水中，才能透過(guò)細(xì)行。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須溶解于水中，才能透過(guò)細(xì)胞膜被

35、微生物利用。胞膜被微生物利用。誘導(dǎo)劑、前體和促進(jìn)劑：胞外酶合成需要誘導(dǎo)劑、前體和促進(jìn)劑：胞外酶合成需要誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)物。不同的發(fā)酵產(chǎn)物，不同的菌種所選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基是不同的。不同的發(fā)酵產(chǎn)物，不同的菌種所選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基是不同的。 白酒白酒 (chinese spirit)發(fā)酵：固體發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵：固體發(fā)酵培養(yǎng)基； 果酒果酒(fruit spirit)發(fā)酵：發(fā)酵：fruit juice or fruit sauce ； 啤酒啤酒(beer) 發(fā)酵：麥芽汁發(fā)酵：麥芽汁(wort)液體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基； 酒精酒精(alcohol)發(fā)酵：淀粉糖化醪發(fā)酵：淀粉糖化醪(starch mash) ； 氨基

36、酸氨基酸(amino acid)發(fā)酵：水解糖液加其他營(yíng)養(yǎng)成分；發(fā)酵：水解糖液加其他營(yíng)養(yǎng)成分； 檸檬酸檸檬酸(citric acid)發(fā)酵：淀粉液化醪發(fā)酵：淀粉液化醪(starch dextrinizate mash)； 乳酸乳酸(lactic acid)發(fā)酵：淀粉糖化醪發(fā)酵：淀粉糖化醪(starch mash) ； 甲烷甲烷(methane)發(fā)酵：復(fù)雜的有機(jī)廢物發(fā)酵；發(fā)酵：復(fù)雜的有機(jī)廢物發(fā)酵； 抗生素抗生素(antibiotic)發(fā)酵：淀粉糖化醪發(fā)酵：淀粉糖化醪(starch mash) +豆餅粉豆餅粉+麩皮粉；麩皮粉；一、工業(yè)常用的碳源一、工業(yè)常用的碳源 葡萄糖：純葡萄糖、水解淀粉葡萄糖：純

37、葡萄糖、水解淀粉 乳糖：乳糖： 純?nèi)樘?、乳清粉純?nèi)樘恰⑷榍宸?淀粉：大麥、花生粉、燕麥粉、黑麥淀粉：大麥、花生粉、燕麥粉、黑麥 粉粉 蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、 精白糖精白糖 醋酸、乙醇、亞硫酸紙漿廢液、食品工廠的下醋酸、乙醇、亞硫酸紙漿廢液、食品工廠的下腳等等。腳等等。 糖蜜中主要含有蔗糖，總糖含量可達(dá)糖蜜中主要含有蔗糖，總糖含量可達(dá)50%70%。 糖蜜分為甘蔗糖蜜糖蜜分為甘蔗糖蜜(cane molasses)和甜菜和甜菜糖蜜糖蜜 (beet molasses) ，二者在糖的含量和無(wú)機(jī)，二者在糖的含量和無(wú)機(jī)鹽的含量都有所不同，使用時(shí)應(yīng)注意。鹽的含量都

38、有所不同，使用時(shí)應(yīng)注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生產(chǎn)中，抗糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生產(chǎn)中，抗生素等微生物工業(yè)也常用它作為碳源。生素等微生物工業(yè)也常用它作為碳源。 酒精工業(yè)中若用糖蜜代甘薯粉，則可省去酒精工業(yè)中若用糖蜜代甘薯粉，則可省去蒸煮、制曲、糖化等過(guò)程，簡(jiǎn)化了酒精生產(chǎn)工蒸煮、制曲、糖化等過(guò)程，簡(jiǎn)化了酒精生產(chǎn)工藝。藝。 工業(yè)生產(chǎn)中常用有機(jī)氮源豆餅粉工業(yè)生產(chǎn)中常用有機(jī)氮源豆餅粉(soybean cake powder)、花生餅粉、花生餅粉(peanut powder)、麩皮或麩皮水解液、麩皮或麩皮水解液(bran hydrolysis liquid)、玉米漿、玉米漿(corn steep

39、liquor)等。等。根據(jù)：現(xiàn)有的工藝條件根據(jù)：現(xiàn)有的工藝條件 菌種生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物時(shí)菌種生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物時(shí)pH的變化的變化 最適最適pH的控制范圍的控制范圍 綜合考慮選用生理酸、堿性物質(zhì)及用量，從而保證在綜合考慮選用生理酸、堿性物質(zhì)及用量，從而保證在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH都能維持在最佳狀態(tài)。都能維持在最佳狀態(tài)。 培養(yǎng)基成分用量的多少大部分根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而來(lái)。但對(duì)于培養(yǎng)基成分用量的多少大部分根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而來(lái)。但對(duì)于主產(chǎn)物代謝途徑清楚的物質(zhì)如酒精，可通過(guò)物料平衡計(jì)算主產(chǎn)物代謝途徑清楚的物質(zhì)如酒精，可通過(guò)物料平衡計(jì)算加以確定。加以確定。 前體物質(zhì)、促進(jìn)劑、抑制劑前體物質(zhì)、促進(jìn)劑、抑制劑前體：能直接被微生物在生物合成過(guò)程中結(jié)合到產(chǎn)物前體：能直接被微生物在生物合成過(guò)程中結(jié)合到產(chǎn)物中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大的提高。有較大的提高。e.g. 青霉素發(fā)酵中加玉米漿，發(fā)酵單位青霉素發(fā)酵中加玉米漿，發(fā)酵單位由由20 g/ml提提高到高到100 g/ml 。玉米漿中含有苯乙胺，它被優(yōu)先結(jié)合到青霉素分子中玉米漿中含有苯乙胺，它被優(yōu)先結(jié)合到青霉素分子中去，從而提高產(chǎn)量。去，從而提高產(chǎn)量。在生產(chǎn)中常采用少量多次地加入前體。在生產(chǎn)中常采用少量多次地加入前體。 總的加入量可按一個(gè)產(chǎn)物分