普通免疫學(xué)-8-2014-單克隆抗體

1、普通免疫學(xué)(Immunology) 抗體制備與抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗體制備與抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用 抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）基因工程抗體的制備基因工程抗體的制備主要的抗原抗體反應(yīng)主要的抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)在生物學(xué)中的應(yīng)用免疫學(xué)在生物學(xué)中的應(yīng)用抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）什么是多克隆抗體什么是多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)?抗原上那部分可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分抗原上那部分可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇抗原決定簇。一個(gè)抗原上可。一個(gè)抗原上可以有以有許多不同的抗原決定簇許多不

2、同的抗原決定簇，因而使機(jī)體，因而使機(jī)體產(chǎn)生產(chǎn)生許多許多不同的抗體。不同的抗體。 用包含用包含多種抗原決定簇多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)免的抗原物質(zhì)免疫動(dòng)物，從而刺激多個(gè)疫動(dòng)物，從而刺激多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物，稱(chēng)為多克隆抗體。物，稱(chēng)為多克隆抗體。 另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，也稱(chēng)為多形成好幾種單克隆

3、抗體混雜物，也稱(chēng)為多克隆抗體?？寺】贵w。 The immune response to an antigen generally involves the activation of multiple B-cells all of which target a specific epitope on that antigen. As a result a large number of antibodies are produced with different specificities and epitope affinities these are known as polyclonal

4、 antibodies.可以制作可以制作“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”。 多克隆抗體通常用兔制備的多克隆抗體通常用兔制備的多克隆抗體通常用什么制備的多克隆抗體通常用什么制備的?多克隆抗體具有多克隆抗體具有異質(zhì)性異質(zhì)性：如何表示？等：如何表示？等電聚焦實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂径嗫寺】贵w中的各種電聚焦實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂径嗫寺】贵w中的各種抗體具有不同的等電點(diǎn)。抗體具有不同的等電點(diǎn)。等電聚焦實(shí)驗(yàn)：等電聚焦實(shí)驗(yàn)： 蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在pHpH梯度膠中電梯度膠中電泳，每個(gè)分子沿著泳，每個(gè)分子沿著pHpH梯度遷移至電荷為梯度遷移至電荷為中性的相應(yīng)中性的相應(yīng)pHpH位置，并在此點(diǎn)積聚。位置，并在此點(diǎn)積聚?？寡宓娜毕荩嚎寡宓娜毕荩?每一種抗血

5、清都不同于其他任何的每一種抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使選用遺傳背景完全相同的抗血清，即使選用遺傳背景完全相同的動(dòng)物，采用相同的抗原制劑和相同的免動(dòng)物，采用相同的抗原制劑和相同的免疫程序。疫程序。 產(chǎn)生的抗血清只能是有限的數(shù)量，產(chǎn)生的抗血清只能是有限的數(shù)量，因此同一份血清制劑不可能長(zhǎng)期使用或因此同一份血清制劑不可能長(zhǎng)期使用或完成一系列復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)或臨床檢測(cè)。完成一系列復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)或臨床檢測(cè)。 即使是用親和層析技術(shù)純化的抗體即使是用親和層析技術(shù)純化的抗體也可能包含少量引起交叉反應(yīng)的抗體，也可能包含少量引起交叉反應(yīng)的抗體，干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)的分析。干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)的分析。怎么辦怎么辦? ? 發(fā)展一種無(wú)限量能產(chǎn)

6、生結(jié)構(gòu)均一且已知發(fā)展一種無(wú)限量能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)均一且已知特異性的抗體分子方法。特異性的抗體分子方法。 1975年年Khler和和Milstein首先報(bào)道用細(xì)首先報(bào)道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC)免疫免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,建立起第建立起第一個(gè)一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株,并成功地制得抗并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（的單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）。迄今世界已研制成數(shù)以千計(jì)的）。迄今世界已研制成數(shù)以千計(jì)的McAb。for theories concerning the speci

7、ficity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodiesJerne Khler MilsteinThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 由一種克隆產(chǎn)生的針對(duì)一種細(xì)胞表位由一種克隆產(chǎn)生的針對(duì)一種細(xì)胞表位的特異性抗體叫做單克隆抗體。的特異性抗體叫做單克隆抗體。Monoclonal antibodies represent a single B l

8、ymphocyte generating antibodies to one specific epitope. 單克隆抗體為單一種單克隆抗體為單一種B B細(xì)胞克隆所產(chǎn)細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白，是一種獨(dú)特生的一種均一的免疫球蛋白，是一種獨(dú)特型的抗體。它的特異性是針對(duì)一個(gè)抗原決型的抗體。它的特異性是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的。定簇的。 如何獲得如何獲得針對(duì)一種細(xì)胞表位針對(duì)一種細(xì)胞表位的特異性抗體的特異性抗體? ?問(wèn)題一問(wèn)題一: :有關(guān)有關(guān)單克隆抗體單克隆抗體生產(chǎn)的實(shí)際問(wèn)題生產(chǎn)的實(shí)際問(wèn)題? ?問(wèn)題二問(wèn)題二: :如何如何大量無(wú)限大量無(wú)限地生產(chǎn)地生產(chǎn)單克隆抗體單克隆抗體? ?選擇什么樣的細(xì)胞選擇

9、什么樣的細(xì)胞? ? 生產(chǎn)單克隆抗體的原理生產(chǎn)單克隆抗體的原理 骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，因此能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不能分泌特異性因此能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不能分泌特異性抗體；抗體； B B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖，因此不能長(zhǎng)期培養(yǎng)。外不能無(wú)限增殖，因此不能長(zhǎng)期培養(yǎng)。 免疫動(dòng)物的免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞脾細(xì)胞與與骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合后融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限制增殖的特特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限制增殖的特性，又具有免疫性

10、，又具有免疫B B細(xì)胞合成和分泌特異性抗細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。體的能力。在制備雜交瘤過(guò)程中的一個(gè)問(wèn)題是什么？在制備雜交瘤過(guò)程中的一個(gè)問(wèn)題是什么？如何解決？如何解決？讓未成雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和脾臟細(xì)胞去死讓未成雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和脾臟細(xì)胞去死 HAT HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基 含有含有次黃嘌呤次黃嘌呤(H)(H)、氨基、氨基喋呤喋呤(A)(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)(T)中進(jìn)行選擇性中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。培養(yǎng)。 5-磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸尿嘧焦磷酸尿嘧啶啶RNADNA 次黃嘌呤（次黃嘌呤（H） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤氨基蝶呤 （A）合成主要途徑合成主要途徑 合成替代途徑合成

11、替代途徑 TKHPGRTHPGRT：次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核苷轉(zhuǎn)移酶：次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核苷轉(zhuǎn)移酶TK：胸腺嘧啶激酶：胸腺嘧啶激酶 未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成核酸活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成核酸的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又又因缺乏次黃嘌呤因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次，不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤合成核酸而死亡。黃嘌呤合成核酸而死亡。 融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾臟細(xì)胞獲融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾臟細(xì)胞獲得了次黃嘌呤得了次黃嘌呤-

12、鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體。即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體。 未融合的親代脾臟細(xì)胞壽命有未融合的親代脾臟細(xì)胞壽命有限，不久就死亡了。限，不久就死亡了。問(wèn)題一問(wèn)題一 三、單克隆抗體的制備過(guò)程三、單克隆抗體的制備過(guò)程 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要步驟包括：雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要步驟包括：（1）抗原制備；）抗原制備；（2）免疫動(dòng)物

13、；）免疫動(dòng)物；（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備； （4）細(xì)胞融合；）細(xì)胞融合； （5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)； （6）雜交瘤細(xì)胞的篩選；）雜交瘤細(xì)胞的篩選； （7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；（8）單克隆抗體的檢定；）單克隆抗體的檢定； （9）分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；）分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立； （10）單克隆抗體的大量制備。）單克隆抗體的大量制備。1 1、免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物 免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏使小鼠產(chǎn)生致敏B B淋巴細(xì)胞的過(guò)程。淋巴細(xì)胞的過(guò)程。 一般選

14、用一般選用6-6-8 8周齡雌性周齡雌性Balb/cBalb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B B淋巴細(xì)胞克隆，使淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏其活化、增殖，并分化成為致敏B B淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞。 2 2、細(xì)胞融合細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)將

15、準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。 3 3、選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HATHAT選擇培選擇培養(yǎng)基。在養(yǎng)基。在HATHAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤- -鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤- -磷酸核糖轉(zhuǎn)磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成核酸而死亡

16、。移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成核酸而死亡。 未融合的脾細(xì)胞雖具有次黃嘌呤未融合的脾細(xì)胞雖具有次黃嘌呤- -鳥(niǎo)嘌呤鳥(niǎo)嘌呤- -磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因此能在能無(wú)限增殖的特性，因此能在HATHAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基中存活和增殖。中存活和增殖。 如何獲得如何獲得針對(duì)一種細(xì)胞表位針對(duì)一種細(xì)胞表位的特異性抗體的特異性抗體? ?問(wèn)題一問(wèn)題一:

17、:4 4、雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化 在在HATHAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌數(shù)是分泌所需所需特異性單克隆抗體的細(xì)胞，特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體

18、的免疫球蛋白類(lèi)型、亞所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類(lèi)型、亞類(lèi)、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及類(lèi)、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。 5 5、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備 單克隆抗單克隆抗體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。法和體外培養(yǎng)法。 （1 1）體內(nèi)誘生法）體內(nèi)誘生法 取取Balb/cBalb/c小鼠，首小鼠，首先腹腔注射先腹腔注射0.5ml0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。行預(yù)處理。1-21-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔

19、內(nèi)增瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-21-2周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。 （2）體外培養(yǎng)法）體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，雜交瘤細(xì)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量

20、有限。近年來(lái)，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和體量有限。近年來(lái)，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。 鼠單抗也具有一些缺陷，主要是小鼠鼠單抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系統(tǒng)不能識(shí)別某些免疫原。免疫系統(tǒng)不能識(shí)別某些免疫原。 另一方面，由于多克隆抗體識(shí)別的是另一方面，由于多克隆抗體識(shí)別的是抗原的多個(gè)抗原決定簇，同時(shí)抗體的親和抗原的多個(gè)抗原決定簇，同時(shí)抗體的親和性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鼠來(lái)源的抗體，再加上技術(shù)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鼠來(lái)源的抗體，再加上技術(shù)環(huán)節(jié)的簡(jiǎn)單性，所以一直具有不可取代的環(huán)節(jié)的簡(jiǎn)單性，所以一直具有不可取代的優(yōu)勢(shì)，也廣泛應(yīng)用于科研及診斷。優(yōu)勢(shì)，也廣泛應(yīng)用于科研

21、及診斷。 如何得到高親和性、強(qiáng)特異性、如何得到高親和性、強(qiáng)特異性、廣譜識(shí)別性的抗體？廣譜識(shí)別性的抗體？ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇： 做單抗的動(dòng)物最開(kāi)做單抗的動(dòng)物最開(kāi)始是小鼠，后來(lái)又有像始是小鼠，后來(lái)又有像Epitomics這樣的公這樣的公司用兔子的司用兔子的(有特殊的專(zhuān)利有特殊的專(zhuān)利)，還有一些人用，還有一些人用大鼠的，當(dāng)然其它的動(dòng)物的也有，據(jù)不完全大鼠的，當(dāng)然其它的動(dòng)物的也有，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在能用傳統(tǒng)方法制備單抗的動(dòng)物已統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在能用傳統(tǒng)方法制備單抗的動(dòng)物已經(jīng)有二三十種了。經(jīng)有二三十種了。 但是最主流的還是小鼠但是最主流的還是小鼠和兔子了。和兔子了。 雖然兔子能產(chǎn)生雖然兔子能產(chǎn)生高親

22、和性、強(qiáng)特異性、高親和性、強(qiáng)特異性、廣譜識(shí)別性的抗體廣譜識(shí)別性的抗體, ,但但不存在兔的骨髓瘤樣不存在兔的骨髓瘤樣腫瘤腫瘤). 怎么辦怎么辦? 1995年，年，Dr. Katherine Knight在在Loyola University of Chicago成功地在在轉(zhuǎn)基因兔中成功地在在轉(zhuǎn)基因兔中獲得骨髓瘤樣腫瘤獲得骨髓瘤樣腫瘤(plasmacytoma)。其后幾。其后幾年里，年里，Dr. Robert Pytela 和和 Mr. Weimin Zhu在在UCSF將此技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使之能高產(chǎn)將此技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使之能高產(chǎn)量的生產(chǎn)兔單克隆抗體。量的生產(chǎn)兔單克隆抗體。兔單克隆抗體兔單克隆抗體

23、(RabMAbs)： 新一代單新一代單克隆抗體用于科研、診斷和治療克隆抗體用于科研、診斷和治療 如何獲得骨髓瘤樣腫瘤如何獲得骨髓瘤樣腫瘤?在在c-myc/v-abl轉(zhuǎn)基因兔身上成功地轉(zhuǎn)基因兔身上成功地獲得了兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系獲得了兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系 proto-oncogenes (原癌基因原癌基因) 調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的正常細(xì)胞基因。突調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的正常細(xì)胞基因。突變后轉(zhuǎn)化成為致癌的癌基因變后轉(zhuǎn)化成為致癌的癌基因myc 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 Burkitt 淋巴瘤、肺癌、早淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病幼粒白血病 Abl-1: 非受體酪氨酸激酶非受體酪氨酸激酶 慢性髓性白血慢性髓性白血病病 美國(guó)美

24、國(guó)Epitomics公司成立于公司成立于2001年年9月，月，與加州大學(xué)舊金山分校與加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)及芝加哥及芝加哥 LOYOLA 大學(xué)聯(lián)手開(kāi)發(fā)出新型雜交瘤技術(shù)，大學(xué)聯(lián)手開(kāi)發(fā)出新型雜交瘤技術(shù)，擁有兔單克隆抗體擁有兔單克隆抗體(RabMabs)技術(shù)的全球?qū)＜夹g(shù)的全球?qū)＠?，是?guó)際上唯一一家擁有兔類(lèi)單抗技術(shù)的利，是國(guó)際上唯一一家擁有兔類(lèi)單抗技術(shù)的生物技術(shù)公司。生物技術(shù)公司。 2012年年3月月6日英國(guó)上市公司日英國(guó)上市公司Abcam宣宣布將以布將以1.7億美元收購(gòu)全球唯一兔單株抗億美元收購(gòu)全球唯一兔單株抗體蛋白生物技術(shù)公司體蛋白生物技術(shù)公司Epitomics(F-宜佰宜佰) Epito

25、mics 由于兔脾臟較大，可以進(jìn)行更多的融合由于兔脾臟較大，可以進(jìn)行更多的融合實(shí)驗(yàn)，使得高通量篩選融合細(xì)胞成為可能。實(shí)驗(yàn)，使得高通量篩選融合細(xì)胞成為可能。預(yù)期后預(yù)期后10年數(shù)百種治療性抗體將被開(kāi)發(fā)用年數(shù)百種治療性抗體將被開(kāi)發(fā)用于許多疾病的治療。于許多疾病的治療。鼠單克隆抗體與兔單克隆抗體的比較鼠單克隆抗體與兔單克隆抗體的比較親和力更高親和力更高:可以比鼠抗血清識(shí)別更多種類(lèi)的可以比鼠抗血清識(shí)別更多種類(lèi)的表位表位識(shí)別表位更多識(shí)別表位更多: 能夠識(shí)別許多小鼠中不產(chǎn)生免能夠識(shí)別許多小鼠中不產(chǎn)生免疫的抗原疫的抗原特異性更高、檢測(cè)靈敏度更高、應(yīng)用范圍更特異性更高、檢測(cè)靈敏度更高、應(yīng)用范圍更廣、背景本底更低

26、廣、背景本底更低漿細(xì)胞腫瘤漿細(xì)胞腫瘤 基因工程抗體的制備基因工程抗體的制備生物導(dǎo)彈的原理生物導(dǎo)彈的原理: : 生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱(chēng)呼，生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱(chēng)呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。 單克隆抗體具有高度專(zhuān)一性，能夠識(shí)單克隆抗體具有高度專(zhuān)一性，能夠識(shí)別細(xì)胞表面抗原、各種受體、各種體液成別細(xì)胞表面抗原、各種受體、各種體

27、液成分及細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)的各種成分，能精確分及細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)的各種成分，能精確地瞄準(zhǔn)和捕獲靶細(xì)胞，特異性地與靶目標(biāo)地瞄準(zhǔn)和捕獲靶細(xì)胞，特異性地與靶目標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，因而有發(fā)生反應(yīng)，因而有“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”之稱(chēng)。之稱(chēng)。 單抗體引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部單抗體引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用.從而從而減少藥物、毒素、同位素和酶在腫瘤治療減少藥物、毒素、同位素和酶在腫瘤治療過(guò)程中引起嚴(yán)重的副作用過(guò)程中引起嚴(yán)重的副作用,大大提高治療腫大大提高治療腫瘤的效果。瘤的效果。用鼠單克隆抗體制備的生物導(dǎo)彈有什么問(wèn)題？用鼠單克隆抗體制備的生物導(dǎo)彈有什么問(wèn)題

28、？ 雜交瘤是雜交瘤是鼠來(lái)源鼠來(lái)源的，因此產(chǎn)生的抗體的，因此產(chǎn)生的抗體也是也是鼠源的蛋白鼠源的蛋白，對(duì)于人體而言是一種異，對(duì)于人體而言是一種異種蛋白。種蛋白。異種蛋白在人體內(nèi)可能會(huì)引起免疫反異種蛋白在人體內(nèi)可能會(huì)引起免疫反應(yīng)（哮喘、蕁麻疹應(yīng)（哮喘、蕁麻疹/ /風(fēng)疹塊，產(chǎn)生抗體等）風(fēng)疹塊，產(chǎn)生抗體等）或被排斥，有時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的致死性反應(yīng)，或被排斥，有時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重的致死性反應(yīng)，因此自因此自19801980年代以來(lái)，如何解決生物導(dǎo)彈年代以來(lái)，如何解決生物導(dǎo)彈的這個(gè)問(wèn)題，一直是生物導(dǎo)彈在人體內(nèi)應(yīng)的這個(gè)問(wèn)題，一直是生物導(dǎo)彈在人體內(nèi)應(yīng)用的重要問(wèn)題。用的重要問(wèn)題。 FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3

29、CDR3 FR4V區(qū)區(qū)抗體基因的改造抗體基因的改造 將鼠源抗體的將鼠源抗體的V區(qū)與人源抗體區(qū)與人源抗體C區(qū)區(qū)基因重組，獲得的嵌合體（基因重組，獲得的嵌合體（chimerical antibody),可保留鼠抗體對(duì)抗原的高親可保留鼠抗體對(duì)抗原的高親和性，又減弱鼠抗原對(duì)人的免疫原和性，又減弱鼠抗原對(duì)人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。性，提高治療性抗體的效果。解決方法解決方法鼠單抗恒定區(qū)人源化 鼠單抗恒定鼠單抗恒定區(qū)人源化區(qū)人源化 如何得到親和力高、特異性強(qiáng)的抗體克隆？如何得到親和力高、特異性強(qiáng)的抗體克??？ 通過(guò)遺傳工程技術(shù)改造與生產(chǎn)抗體通過(guò)遺傳工程技術(shù)改造與生產(chǎn)抗體抗體基因文庫(kù)抗體基因文庫(kù) 將不

30、同的重鏈和輕鏈基因隨機(jī)組合，將不同的重鏈和輕鏈基因隨機(jī)組合，克隆到合適的表達(dá)載體（噬菌體）中，在克隆到合適的表達(dá)載體（噬菌體）中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個(gè)抗體原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個(gè)抗體庫(kù)。庫(kù)。 從這個(gè)抗體庫(kù)中，從這個(gè)抗體庫(kù)中， 用抗原可以篩選用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因。到相應(yīng)的抗體基因。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 一是從不適合進(jìn)行人工免疫的一是從不適合進(jìn)行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得二是可快速方便獲得親和力高、特異性強(qiáng)親和力高、特異性強(qiáng)的的克隆抗體?？寺】贵w。主要的抗原抗體反應(yīng)主要的抗原抗體反應(yīng) 抗體效價(jià)的

31、測(cè)定抗體效價(jià)的測(cè)定血清：血清：血液凝固析出的淡黃色透明液體血液凝固析出的淡黃色透明液體 ，在凝血過(guò)程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋在凝血過(guò)程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無(wú)纖維蛋白原。白塊，所以血清中無(wú)纖維蛋白原?？贵w效價(jià)抗體效價(jià)( (滴度，滴度，titer)titer)：通過(guò)通過(guò)血清學(xué)方法血清學(xué)方法能顯示一定反應(yīng)的抗血清能顯示一定反應(yīng)的抗血清(或抗體或抗體)的的最高稀最高稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)(或或稀釋度的倒數(shù)稀釋度的倒數(shù)) )。如終點(diǎn)稀釋度為如終點(diǎn)稀釋度為1/100，則血清的效價(jià)，則血清的效價(jià)(每每1ml的血清中抗體的血清中抗體效價(jià)效價(jià))為為100抗體單位抗體單位的高低是衡量血清中的高低是

32、衡量血清中抗體水平的一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)?？贵w水平的一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)。 試管凝集實(shí)驗(yàn)（試管凝集實(shí)驗(yàn)（tube agglutination test）原理：大分子顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞）原理：大分子顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞）與其相應(yīng)的抗體相結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存與其相應(yīng)的抗體相結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存在及一定的溫度下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間可出現(xiàn)在及一定的溫度下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝聚團(tuán)塊。一般以標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)得肉眼可見(jiàn)的凝聚團(tuán)塊。一般以標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)得免疫血清或患者血清中抗體的效價(jià)。免疫血清或患者血清中抗體的效價(jià)。不加免疫血清不加免疫血清、：凝聚強(qiáng)度、：凝聚強(qiáng)度：出現(xiàn)凝聚：出現(xiàn)凝聚：無(wú)凝聚：無(wú)凝聚抗體稀釋度應(yīng)

33、根據(jù)：抗體稀釋度應(yīng)根據(jù)：抗體效價(jià)高，溶液中特異性抗體濃度越抗體效價(jià)高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；高，工作稀釋度越高；一般講，應(yīng)用的一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時(shí)間越長(zhǎng)?？贵w稀釋度越大，溫育時(shí)間越長(zhǎng)?？贵w抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時(shí)才中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時(shí)才能防止非特異性背景染色；抗體的稀釋主能防止非特異性背景染色；抗體的稀釋主要是指第一抗體，因?yàn)榈谝豢贵w中特異性要是指第一抗體，因?yàn)榈谝豢贵w中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵抗體合適的嘗試是關(guān)鍵, ,應(yīng)用高稀釋度第應(yīng)用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng)一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng), ,減少

34、或消除其中交叉抗體反應(yīng)。減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。 三、常見(jiàn)免疫分析方法三、常見(jiàn)免疫分析方法 利用抗原與抗體特異利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗體進(jìn)行量和質(zhì)的測(cè)定分析。體進(jìn)行量和質(zhì)的測(cè)定分析。這類(lèi)分析方法具有特異、這類(lèi)分析方法具有特異、靈敏和快速的特點(diǎn)。靈敏和快速的特點(diǎn)。免疫沉淀免疫沉淀1. 環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)：是溶環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)：是溶液中的沉淀反應(yīng)。在體液中的沉淀反應(yīng)。在體外當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二外當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例恰當(dāng)時(shí)，會(huì)者濃度比例恰當(dāng)時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫沉淀。發(fā)生免疫沉淀?？贵w與多價(jià)抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象抗體與多價(jià)抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象2.免疫雙擴(kuò)散免疫雙擴(kuò)散抗原抗

35、體在半透明的半固抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)。相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)。雙擴(kuò)散是在瓊脂板中抗原雙擴(kuò)散是在瓊脂板中抗原和抗體分別從相鄰的孔中和抗體分別從相鄰的孔中向四周擴(kuò)散，在抗原孔和向四周擴(kuò)散，在抗原孔和抗體孔之間二者比例合適抗體孔之間二者比例合適的部位形成沉淀線(xiàn)。的部位形成沉淀線(xiàn)。當(dāng)兩個(gè)抗原完全一致時(shí)，當(dāng)兩個(gè)抗原完全一致時(shí)，兩條沉淀線(xiàn)完全融合；如兩條沉淀線(xiàn)完全融合；如果兩個(gè)抗原無(wú)共同抗原決果兩個(gè)抗原無(wú)共同抗原決定簇時(shí)，沉淀線(xiàn)互不干擾；定簇時(shí)，沉淀線(xiàn)互不干擾；當(dāng)兩個(gè)抗原只是部分抗原當(dāng)兩個(gè)抗原只是部分抗原決定簇相同，還有其他不決定簇相同，還有其他不同的抗原決定簇，則沉淀同的抗原決定簇，

36、則沉淀線(xiàn)在后者一方形成突出的線(xiàn)在后者一方形成突出的小刺小刺3. 免疫電泳免疫電泳 利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離開(kāi)來(lái)的特點(diǎn)與免疫擴(kuò)散結(jié)合一起能被分離開(kāi)來(lái)的特點(diǎn)與免疫擴(kuò)散結(jié)合一起進(jìn)行分析的方法。進(jìn)行分析的方法。1 1、 血清免疫電泳血清免疫電泳: :雙擴(kuò)散雙擴(kuò)散2 2、火箭電泳：為、火箭電泳：為加速度的加速度的單向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散( (抗原擴(kuò)散抗原擴(kuò)散, ,抗體不擴(kuò)散抗體不擴(kuò)散) )與電泳結(jié)合的一與電泳結(jié)合的一種方法種方法 在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測(cè)標(biāo)本后，在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測(cè)標(biāo)本后，將抗原置陰極端，抗原泳向陽(yáng)極

37、，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生將抗原置陰極端，抗原泳向陽(yáng)極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。正比，用標(biāo)本中的抗原含量。 酶聯(lián)免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法 廣泛使用廣泛使用, ,因酶促反應(yīng)使測(cè)定的結(jié)果因酶促反應(yīng)使測(cè)定的結(jié)果被放大被放大, ,反應(yīng)靈敏度高。反應(yīng)靈敏度高。 酶標(biāo)酶標(biāo)方法方法直接酶標(biāo)直接酶標(biāo)間接酶標(biāo)間接酶標(biāo)用于標(biāo)記抗體的酶用于標(biāo)記抗體的酶:辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化

38、物酶 (horseradish peroxidase)化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光劑:熒光醇（熒光醇（luminol） 利用利用化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent)檢測(cè)抗檢測(cè)抗原和抗體相互作用原和抗體相互作用.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent) 原理原理 化學(xué)發(fā)光劑如熒光醇（化學(xué)發(fā)光劑如熒光醇（luminol） ，在辣根，在辣根過(guò)氧化物酶（過(guò)氧化物酶（HRP）的催化作用下）的催化作用下,熒光醇熒光醇與過(guò)氧與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。Lumigen PS3:化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的底物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的底物 , produces a more intense light emission of linger duration如果發(fā)光劑是如果發(fā)光劑是Lumigen PS3免疫熒光分析免疫熒光分析: : 將熒光化合物標(biāo)記抗體