分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與純化

1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定與純化1課件作者：蔣華云實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。對獲得的目的產(chǎn)物進(jìn)行割膠純化回收,為接下來的DNA重組和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供外源DNA片段。2課件作者：蔣華云實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.03課件作者：蔣華云TaKaRa公司的膠純化試劑盒 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段的試劑盒，采用了獨(dú)特的凝膠溶解bufff

2、er，其具有較強(qiáng)的緩沖性能并含有pH指示劑，方便判斷溶液的pH是否適合與DNA制備膜結(jié)合，其溶膠能力很強(qiáng)，無需加熱，再室溫（15-25度）條件下即可快速溶膠。結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效、快速、方便的特點(diǎn)，全套操作只需20min便可完成。使用該試劑盒每次可純化得到多至20g的DNA片段（50bp20kb），回收率高達(dá)5080%。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、DNA測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)膠純化試劑盒回收的DNA片段采用-20低溫保存，延緩DNA的降解。4課件作者：蔣華云儀器、材料與試劑【儀器】瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)紫外透射儀臺式離心機(jī)移液槍（配

3、套槍頭）-20低溫冰箱分析天平【材料與試劑】PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)瓊脂糖1TAE6Loading BufferDNA Marker 2000單面刀片純化試劑盒1.5mL離心管超純水（無菌）5課件作者：蔣華云實(shí)驗(yàn)步驟（1）使用1TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（參照瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實(shí)驗(yàn)）（2）在紫外燈下切出含有目的DNA（約600bp）的瓊脂糖凝膠。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。 注意：切膠時請注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以

4、防止DNA損傷。6課件作者：蔣華云實(shí)驗(yàn)步驟（3）切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。 （4）稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時，以1mg=1L進(jìn)行計(jì)算。（5）向膠塊中加入膠塊融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：7課件作者：蔣華云（6）均勻混合后15-25融化膠塊（膠濃度較大或比較難溶時可以在37加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約510分鐘）。 注意：膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。（7）*當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。 （8）將試劑盒中的Spin

5、 Column安置于Collection Tube上。 （9）將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1min，棄濾液。注意：如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。 8課件作者：蔣華云（10）將700 L的Buffer WB加入Spin Column中，12000 rpm離心30s，棄濾液。（11）重復(fù)操作步驟10。（12）將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 L的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。 注意：使用加熱至60的滅菌蒸餾水或Elution Buffer有利于提高洗脫效率。 （13）室溫12000 rpm離心1min洗脫DNA。（14）-20低溫保存純化的目的DNA片段。9課件作者：蔣華云實(shí)驗(yàn)分組PCR產(chǎn)物鑒定全班分為2大組，每大組制備1塊1%的瓊脂糖凝膠。（8個點(diǎn)樣孔，1孔Marker,7孔樣品。）割膠純化回收目的DNA片段每4人1組（檢測到PCR反應(yīng)產(chǎn)物的），全班約7組。10課件作者：蔣華云思考題為什么