質(zhì)譜技術(shù)分析

1、第三章第三章 質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)Mass spectrumMS內(nèi)容：內(nèi)容：第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)譜學(xué)基礎(chǔ)質(zhì)譜學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用第三節(jié)第三節(jié) 生物質(zhì)譜簡(jiǎn)介生物質(zhì)譜簡(jiǎn)介第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)譜學(xué)基礎(chǔ)質(zhì)譜學(xué)基礎(chǔ) 什么是質(zhì)譜質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu) 質(zhì)譜儀的主要性能指標(biāo) 質(zhì)譜圖及其判讀第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜質(zhì)譜高效液相色譜質(zhì)譜 (HPLC-API MS) HPLC-ESIMS(電噴霧電離電噴霧電離) HPLC-APCI(大氣壓化學(xué)電離大氣壓化學(xué)電離) LCMS聯(lián)用所面臨的兩大問(wèn)題聯(lián)用所面臨的兩大問(wèn)題液相色譜流動(dòng)相的量比質(zhì)譜所能忍受的量大得多。典型流量是1mL/min,氣化后相當(dāng)

2、于氣體流速1501200mL/min，而現(xiàn)代質(zhì)譜只能忍受的氣體流量只有120mL/min；液相色譜的研究對(duì)象是難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物，這些化合物用常規(guī)電離方法是很難電離的。關(guān)于LCMS的研究主要致力于解決上述兩個(gè)問(wèn)題。LC/MS 電離技術(shù)的相對(duì)適用性電離技術(shù)的相對(duì)適用性 HPLC-ESIMS (電噴霧電離電噴霧電離) 檢測(cè)器檢測(cè)器噴霧室噴霧室離子阱離子阱加熱的氮?dú)飧稍餁饧訜岬牡獨(dú)飧稍餁怆p電子毛細(xì)管入口雙電子毛細(xì)管入口 霧化氣霧化氣(氣體用紅色顯示氣體用紅色顯示)溶劑噴霧溶劑噴霧+電噴霧電噴霧離子離子-4000 V 電噴霧電離源API-Electrospray Ion Source高電壓裝置高

3、電壓裝置電噴霧電離離子形成的必要步驟電噴霧電離離子形成的必要步驟 步驟步驟 1 溶液中的電離溶液中的電離 樣品的樣品的pKa 溶液的溶液的pH步驟步驟 2 噴霧噴霧表面張力和粘度表面張力和粘度氣動(dòng)輔助氣動(dòng)輔助步驟步驟 3 去溶劑去溶劑干燥氣溫度和流速干燥氣溫度和流速熱容量，熱容量，H vap步驟步驟 4 離子從溶液中解吸離子從溶液中解吸溶解能溶解能步驟步驟 5 氣相中的離子反應(yīng)氣相中的離子反應(yīng)質(zhì)子親合力質(zhì)子親合力電荷交換電荷交換步驟 1在溶液中如何產(chǎn)生離子？在溶液中如何產(chǎn)生離子？離子種類(lèi)離子種類(lèi) NH4+ PO4-酸酸/堿化學(xué)性質(zhì)堿化學(xué)性質(zhì) M - NH2 + 酸酸 M - NH3+ + 酸酸

4、-（正離子檢測(cè)）（正離子檢測(cè)） M - COOH + 堿堿 MCOO- + 堿堿+ （負(fù)離子檢測(cè)）（負(fù)離子檢測(cè)）締合締合（對(duì)類(lèi)似糖的中性物質(zhì)） M + Na+ M - Na+ （堿金屬，如（堿金屬，如20 m mM 乙酸鈉）乙酸鈉）衍生化衍生化 形成離子或酸形成離子或酸/堿產(chǎn)物堿產(chǎn)物 步驟 2氣動(dòng)輔助電噴霧產(chǎn)生帶電液滴含有約100,000電荷、直徑2 m mm的帶電溶劑液滴由于溶劑組成或流速，氣動(dòng)噴霧減小了液滴的大小對(duì)粘度和表面張力的偏離噴霧柱體、端板和毛細(xì)管上的場(chǎng)使液滴帶電步驟 3帶電液滴的去溶劑熱干燥氣體加熱的氮?dú)庹舭l(fā)了液滴，增加了電荷/體積比。Rayleigh極限是帶電液滴能夠存在的最大

5、 電荷/體積比 。當(dāng)電荷超過(guò)這個(gè)極限時(shí)，發(fā)生庫(kù)侖破裂。液滴的液滴的ContCont庫(kù)侖分裂庫(kù)侖分裂 Rayeigh破裂釋放出較小的最終變成樣品離子的液滴。50-100 nm帶電液滴包含100個(gè)電荷 這些液滴包含母體液滴中10-20%的電荷但僅僅2 %的質(zhì)量。步驟步驟 4 4從溶液中解吸離子從溶液中解吸離子當(dāng)液滴的場(chǎng)強(qiáng)超過(guò)分析物在溶液中的溶解能時(shí)，離子解吸進(jìn)入氣相。帶電殘余物離子蒸發(fā)蒸發(fā)蒸發(fā)Rayleigh極限極限Coulomb爆裂爆裂蒸發(fā)蒸發(fā)被分析離子被分析離子步驟 5氣相中的離子反應(yīng)通過(guò)離子傳輸區(qū)域時(shí)從大氣壓噴霧室的反應(yīng)中會(huì)發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)通過(guò)離子傳輸區(qū)域時(shí)從大氣壓噴霧室的反應(yīng)中會(huì)發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電

6、荷交換反應(yīng)。這個(gè)高壓區(qū)允許發(fā)生移和電荷交換反應(yīng)。這個(gè)高壓區(qū)允許發(fā)生1000次離子次離子/分子分子反應(yīng)。反應(yīng)。 質(zhì)子轉(zhuǎn)移: 氣相質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)使分子帶電 M + NH4+ M+H+ + NH3帽電壓帽電壓裂解區(qū)裂解區(qū)霧化氣壓力霧化氣壓力干燥氣干燥氣溫度和流速溫度和流速霧化氣壓力霧化氣壓力800 mL/min 50-70 psig干燥氣流速干燥氣流速 (6-12 L/Min)含水高需更高的流速如果太底，液滴會(huì)導(dǎo)致譜圖中的尖峰當(dāng)有疑問(wèn)時(shí)，使用過(guò)量的干燥氣溫度干燥氣溫度蒸汽壓越低的溶劑溫度越高 開(kāi)始為 300 - 350C帽電壓帽電壓 用FIA優(yōu)化 (2000-5000) 開(kāi)始 3000 V 在負(fù)離子模

7、式，注意高的室電流或蘭色光輝（電暈針顯示）：當(dāng)這現(xiàn)象發(fā)生時(shí)須降低帽電壓電噴霧噴霧室設(shè)置電噴霧噴霧室設(shè)置樣品樣品 在溶液中為離子態(tài): 兒茶酚胺、硫酸酯共軛物、丁基胺 有可誘導(dǎo)電離的化合物：甲醇 含雜原子的化合物：氨基甲酸酯類(lèi)，苯并二氮雜草類(lèi) 溶液中帶多電荷：蛋白質(zhì)、多肽、低聚核甘酸溶液化學(xué)參數(shù)溶液化學(xué)參數(shù) 流速 樣品的 pK, 溶液 pH 溶液導(dǎo)電性應(yīng)避免的樣品應(yīng)避免的樣品 尤其非極性的樣品：PAHs, PCBs電噴霧需考慮的問(wèn)題電噴霧需考慮的問(wèn)題溶劑+ H+ + A 溶劑 + A + H+霧化蒸發(fā)液滴氣相電離HPLC-APCI(大氣壓化學(xué)電離大氣壓化學(xué)電離)APCIAPCI離子化機(jī)理離子化機(jī)理

8、VcapCorona currentNebulizerPressureFragmentor Drying gasTemperatureand FlowHeaterAPCI離子化機(jī)理離子化機(jī)理 氣化氣化 溶劑電離溶劑電離 電荷交換給分析物電荷交換給分析物 N2 (從干燥氣) + e- N2+ + 2e- N2+ + 2N2 N4 + + N2 N4+ + H2O H2O + + 2N2H2O + + H2O H3O+ + OH H3O+ + M M+H+ + H2OAPCI 離子源電暈針 HPLC 流速流速 500m mL/min 霧化氣壓力霧化氣壓力60 psig 干燥氣溫度干燥氣溫度star

9、t with 350 C干燥氣流速干燥氣流速4 L/min氣化溫度氣化溫度隨 FIA調(diào)節(jié)帽電壓帽電壓隨 FIA調(diào)節(jié) (2000-6000)開(kāi)始 2500 V電暈電流電暈電流隨 FIA調(diào)節(jié)開(kāi)始 25 A (neg) 或 4 A (pos)帽電壓帽電壓電暈針電暈針電流電流霧化氣霧化氣壓力壓力碎裂區(qū)碎裂區(qū) 干燥氣干燥氣溫度和流速溫度和流速加熱器加熱器APCI 噴霧室的設(shè)置噴霧室的設(shè)置樣品樣品 分子量和極性中等的化合物：PAHs, PCBs, 脂肪酸, 鄰苯二甲酸酯類(lèi)； 不含酸性和堿性位點(diǎn)的化合物（碳?xì)浠衔?、醇、醛、酮和酯）?含有雜原子的化合物：脲、苯并二氮雜草、氨基甲酸酯； 具有一定揮發(fā)性的化合

10、物, 排除了分子量較大和極性較大的分子, 如蛋白質(zhì)/多肽； 電噴霧響應(yīng)不好的樣品；溶液化學(xué)參數(shù)溶液化學(xué)參數(shù) 較ES對(duì)溶液化學(xué)作用不靈敏 較ES更耐大的流速 適用ES不宜的一些溶劑應(yīng)避免的樣品應(yīng)避免的樣品 在氣化過(guò)程中熱不穩(wěn)定的化合物APCI APCI 需考慮需考慮 電噴霧電離電噴霧電離: 其電離過(guò)程通過(guò)電場(chǎng)產(chǎn)生帶電液滴，接著樣品離子通過(guò)離子蒸發(fā)后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。適用于在溶液中為離子態(tài)或可誘導(dǎo)電離的化合物。適用于分子量較大和極性較大的分子, 如蛋白質(zhì)/多肽； 大氣壓化學(xué)電離大氣壓化學(xué)電離(APCI): 氣相化學(xué)電離 (CI)過(guò)程中溶劑相當(dāng)于CI反應(yīng)氣來(lái)使樣品電離。適用于分子量和極性中等的化合物和

11、具有一定揮發(fā)性的化合物, 排除了分子量較大和極性較大的分子。小小 結(jié)結(jié)HPLCHPLCMSMS用途用途 成份確認(rèn)或定性及半定量，如合成產(chǎn)物分析，成份確認(rèn)或定性及半定量，如合成產(chǎn)物分析，F(xiàn)IA 無(wú)光譜吸收物質(zhì)的定量無(wú)光譜吸收物質(zhì)的定量 低含量和色譜未分離成份的測(cè)定，如雜質(zhì)檢查，低含量和色譜未分離成份的測(cè)定，如雜質(zhì)檢查，SIM，LC條件優(yōu)化條件優(yōu)化 未知樣品的分析，如中藥分析，與未知樣品的分析，如中藥分析，與DAD結(jié)合結(jié)合, Multi-channel data acquisition 大分子大分子樣品分析，樣品分析，pH至關(guān)重要至關(guān)重要樣品前處理樣品前處理質(zhì)譜檢測(cè)條件質(zhì)譜檢測(cè)條件檢測(cè)離子模式，離

12、子化參數(shù)設(shè)定檢測(cè)離子模式，離子化參數(shù)設(shè)定液相色譜條件液相色譜條件ESI液質(zhì)分析液質(zhì)分析APCI液質(zhì)分析液質(zhì)分析樣品導(dǎo)入方式樣品導(dǎo)入方式Infusion, HPLC, FIA柱后修飾技術(shù)柱后修飾技術(shù)樣品前處理樣品前處理q 了解樣品情況了解樣品情況 種類(lèi)種類(lèi) 純度或含量，溶解度，存儲(chǔ)條件，揮發(fā)性，純度或含量，溶解度，存儲(chǔ)條件，揮發(fā)性， 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性 分子結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)，pK值，值，pI值值q 影響影響LC/MS分析的主要因素分析的主要因素 鹽鹽 背景或基質(zhì)成份背景或基質(zhì)成份(離子化離子化) 濃度濃度 ng/ml, dimer 真空度，溶劑霧化真空度，溶劑霧化質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件 - - 離子源選擇

13、（離子源選擇（1 1）ESI待測(cè)物無(wú)需有揮發(fā)性待測(cè)物無(wú)需有揮發(fā)性熱不穩(wěn)定成份首選熱不穩(wěn)定成份首選離子在溶液中已形成離子在溶液中已形成形成單電荷離子和多電形成單電荷離子和多電荷離子荷離子流速流速 750500500L/minL/min質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件 - - 離子源選擇（離子源選擇（2 2）ESIESI在溶液中已是離子態(tài)在溶液中已是離子態(tài)lcatcata acholaminescholamines, sulfate , sulfate conjugates, quaternary conjugates, quaternary aminesamines含雜原子化和物含雜原子化和物lcarbamat

14、escarbamates, , benzodiazepinesbenzodiazepines帶多電荷成份帶多電荷成份lproteins, peptides, proteins, peptides, oligonucleotidesoligonucleotides對(duì)對(duì)APCIAPCI響應(yīng)弱的物質(zhì)響應(yīng)弱的物質(zhì)APCIAPCI中等分子量和中等極性成份中等分子量和中等極性成份lPAHsPAHs, PCBs, fatty acids, , PCBs, fatty acids, phthalates, alcohols, phthalates, alcohols, aldehydesaldehydes,

15、, ketonesketones，etcetc. .含雜原子化和物含雜原子化和物lcarbamatescarbamates, , benzodiazepinesbenzodiazepines對(duì)對(duì)ESIESI響應(yīng)弱的物質(zhì)響應(yīng)弱的物質(zhì)質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件 - - 離子模式選擇離子模式選擇正離子正離子ESES模式：模式：適合于堿性樣品適合于堿性樣品，amines, amides, aminoacidsamines, amides, aminoacids, , antibioticsantibiotics，etcetc有雜原子有雜原子(N(N2 2 O O2 2) )可接受可接受H H+ +、NaNa+

16、+、NHNH4 4+ +，如，如NHNH2 2、 N N、 NHNH、COCO、COORCOORpH pK-2pH N N2 2) ) 可失去質(zhì)子可失去質(zhì)子? COOH? COOH、SHSH、NONO2 2pH pK+2pH pK+2可正可負(fù)可正可負(fù): :比較靈敏度比較靈敏度質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件 - API- API參數(shù)設(shè)定參數(shù)設(shè)定ESI For aqueous levels above 50%HPLC Flow rate (l/ml)Nebulizer Pressure (psi)Drying Gas Flow (l/min)Drying Gas Temp (0C)1-1010-15432510

17、-5015-20532550-20020-408350200-50030-508-10350500-100050-7010-12350HPLC Flow Rate (l/min)Nebulizer Pressure (psi)Drying Gas Flow (l/min)Drying Gas Temp (0C)APCI Temp (0C)*200-1500604350300-500APCI Good sensitivity at above 500l/min，* - 需優(yōu)化需優(yōu)化液相方法轉(zhuǎn)為液質(zhì)聯(lián)用需要考慮：液相方法轉(zhuǎn)為液質(zhì)聯(lián)用需要考慮：- - 色譜分離和待測(cè)物離子化色譜分離和待測(cè)物離子化 待

18、測(cè)物的離子化能力待測(cè)物的離子化能力 流動(dòng)相及流速與質(zhì)譜的匹流動(dòng)相及流速與質(zhì)譜的匹配性配性 色譜柱與質(zhì)譜的匹配性色譜柱與質(zhì)譜的匹配性色譜柱色譜柱流動(dòng)相流動(dòng)相流速流速液相條件液相條件- - 選擇相應(yīng)的色譜柱選擇相應(yīng)的色譜柱ApplicationColumn I.D.Flow RateStandard2-4mm500-2500 L/minNarrowbore1-2mm100-500 L/minMicro LC1mm800m40 L/min20 L/minCapillary LC300 m180 m4L/min2 L/minNano LC100 m 75 m 50 m300nL/min180nL/mi

19、n 80nL/min液相條件液相條件- - 色譜柱內(nèi)徑選擇色譜柱內(nèi)徑選擇ESIESIFlow rate: 1-Flow rate: 1-1000l/min1000l/min1.0, 2.1, 3.0mm id1.0, 2.1, 3.0mm id建議用建議用 2.1mm2.1mm濃度相關(guān)濃度相關(guān)反相流動(dòng)相反相流動(dòng)相APCIAPCIFlow rate: 50-1500l/minFlow rate: 50-1500l/min4.6, 3.0, 2.1mm id4.6, 3.0, 2.1mm id建議用建議用 4.6mm4.6mm濃度不相關(guān)，進(jìn)樣多，信號(hào)濃度不相關(guān)，進(jìn)樣多，信號(hào)強(qiáng)強(qiáng)反相和正相流動(dòng)相反相和正相流動(dòng)相液相條件液相條件- - 色譜柱顆粒度選