分子克隆工具酶2

1、基因工程的操作過(guò)程基因工程的操作過(guò)程DNA的體外重組（切、接）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）基因工程的操作過(guò)程基因工程的操作過(guò)程接增檢轉(zhuǎn)切DNADNA的體外重組（切、接）的體外重組（切、接） 限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的限制性?xún)?nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源外源DNADNA切切成小片斷。成小片斷。u細(xì)菌自身的細(xì)菌自身的DNADNA堿基被堿基被甲基化酶甲基化酶甲基化修飾甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別所保護(hù)，不能被自身的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別切割。切割。uDamDam甲基化酶甲基化酶G GA ATCTC腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基uDcmDcm甲基

2、化酶甲基化酶C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二個(gè)序列在第二個(gè)C C上上C5C5位置上位置上引入甲基。引入甲基。距識(shí)別序列下游距識(shí)別序列下游24-24-26bp26bp處處識(shí)別序列內(nèi)或附近識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割特異性切割距識(shí)別序列距識(shí)別序列1kb1kb處隨機(jī)處隨機(jī)性切割性切割切割位點(diǎn)GAGCC CAGCAGGAGCC CAGCAG旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列TGAN8TGCTTGAN8TGCTAACN6GTGCAACN6GTGC識(shí)別序列ATPATP、Mg2+Mg2+、 SAMSAMMg2+Mg2+ATPATP、Mg2+Mg2+、SAMSAM（S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨

3、酸 ）輔助因子異源二聚體異源二聚體同源二聚體同源二聚體異源三聚體異源三聚體蛋白結(jié)構(gòu)雙功能雙功能單功能單功能多功能多功能限制修飾 型 型I 型主要特性nI I型酶屬?gòu)?fù)合功能酶，兼具限制、修飾兩種型酶屬?gòu)?fù)合功能酶，兼具限制、修飾兩種功能。核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、功能。核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATPATP酶和酶和DNADNA解旋酶解旋酶4 4種活性。種活性。n顯著特點(diǎn)：顯著特點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致。識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致。n酶分子首先由酶分子首先由M. MeselsonM. Meselson和和R. YuanR. Yuan在在19681968年從大腸桿菌年從大腸桿菌 B B株株和和 K K株株分

4、離的。分離的。代表：代表：EcoBEcoB和和 EcoKEcoK。在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約10001500 bp處處隨機(jī)隨機(jī)切開(kāi)一條切開(kāi)一條單鏈單鏈。Recognize sitecut1-1.5kbn有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶作用。酶分子由有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶作用。酶分子由兩個(gè)亞基組成。兩個(gè)亞基組成。M M亞基負(fù)責(zé)位點(diǎn)識(shí)別與修飾，亞基負(fù)責(zé)位點(diǎn)識(shí)別與修飾，R R亞基具有核酸酶活性。亞基具有核酸酶活性。n在完全肯定的位點(diǎn)切割在完全肯定的位點(diǎn)切割DNADNA，但反應(yīng)需要，但反應(yīng)需要ATPATP、 Mg2+Mg2+和和SAMSAM（S-S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 ）。）。n在基因工

5、程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。n19701970年，由年，由SmithSmith和和WilcoxWilcox從流感嗜血菌中分離出從流感嗜血菌中分離出來(lái)。分離的第一個(gè)酶是來(lái)。分離的第一個(gè)酶是Hind Hind 。n限制限制- -修飾系統(tǒng)分別由修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩種不同酶限制酶與修飾酶兩種不同酶分子組成分子組成，分子量小，能識(shí)別，分子量小，能識(shí)別DNADNA的特殊序列，種的特殊序列，種類(lèi)多，在基因工程中起重要作用。類(lèi)多，在基因工程中起重要作用。n顯著特點(diǎn)：顯著特點(diǎn)：能識(shí)別雙鏈能識(shí)別雙鏈DNADNA的特殊序列，并在這個(gè)的特殊序列，并在這個(gè)序列內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的序列內(nèi)進(jìn)行切

6、割，產(chǎn)生特異的DNADNA片段。其種類(lèi)繁片段。其種類(lèi)繁多多在基因工程技術(shù)中，在基因工程技術(shù)中，I型酶不能用，型酶不能用，型酶型酶基本不用，基本不用， 型酶最有用。型酶最有用。微生物屬名微生物屬名種名種名株名株名(品系品系)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)序數(shù)序數(shù)n不同的不同的DNADNA雙鏈：雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接, ,比連接兩個(gè)平齊末端比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。容易的多。n同一個(gè)同一個(gè)DNADNA分子內(nèi)連接：分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子環(huán)形分子。n凸出的凸出的55末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激酶進(jìn)行多核苷酸

7、激酶進(jìn)行32P32P標(biāo)記。標(biāo)記。n凸出的凸出的33端端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如尾巴（如AAAAAA或或TTTTTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。端。在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿(mǎn)足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。 n050 mM 低鹽酶；100 mM 中鹽酶；150 mM 高鹽酶nMgCl2、Na

8、Cl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度； nTris-HCl： 維持pH； n二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； n牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 當(dāng)當(dāng)DNA樣品確定后，為完全切割此樣品確定后，為完全切割此DNA，酶，酶的用量視酶的催化活性而定。的用量視酶的催化活性而定。 酶活力單位：酶活力單位：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng) 1 h，完全水解完全水解 1 mg 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn)DNA所需的酶量定為所需的酶量定為1U。 比活：比活：1 ul酶溶液中具有的酶活力單位。酶溶液中具有的酶活力單位。 DNA所需酶量來(lái)?yè)Q算。所需酶

9、量來(lái)?yè)Q算。(2) DNA樣品的甲基化程度樣品的甲基化程度不同的限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37，少數(shù)要求4065。 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶連接酶只能催化雙鏈只能催化雙鏈DNA的互補(bǔ)黏性末端，以的互補(bǔ)黏性末端，以NAD+為能量。為能量。 T4噬菌體連接酶噬菌體連接酶黏性、平末端均可連接，以黏性、平末端均可連接，以ATP為能量。為能量。1）必須是兩條）必須是兩條雙鏈雙鏈DNA。2）DNA3端有游離的端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。）。3）需要）需要能量能量動(dòng)物或噬菌體中：動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+ ATPATP（NA

10、DNAD+ +) )提供激活的提供激活的AMPAMP。 ATPATP與連接酶形成共價(jià)與連接酶形成共價(jià)“連接酶連接酶-AMP-AMP”復(fù)合物，復(fù)合物，并釋放出焦磷酸并釋放出焦磷酸PPiPPi。 AMPAMP與連接酶的與連接酶的賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸 - -氨基氨基相連。相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi“連接酶連接酶-AMP-AMP”復(fù)合物復(fù)合物AMPAMP隨后從連接酶的賴(lài)氨酸隨后從連接酶的賴(lài)氨酸 - -氨基轉(zhuǎn)移到氨基轉(zhuǎn)移到DNADNA一條鏈的一條鏈的55端端P P上，形成上，形成“DNA-DNA-腺苷腺苷酸酸”復(fù)合物。復(fù)合物。-OH HO-P-AMP

11、-OHO-P-AMPDNA-腺苷酸腺苷酸”復(fù)合物復(fù)合物 3-OH3-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出二脂鍵，釋放出AMPAMP。1020倍。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。(1)(1)插入片段與載體的濃度比例插入片段與載體的濃度比例 (2)(2)反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度12.512.5，一般，一般14161416。常常用用的的聚聚合合酶酶 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶聚合酶 T4 DNA聚合酶聚合酶 修飾過(guò)的修飾過(guò)的T7 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶共同特點(diǎn)共同特點(diǎn)把把dN

12、TPs連續(xù)地加到引物的連續(xù)地加到引物的3-OH端。端。主要區(qū)別主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不而不從模板上掉下來(lái)。從模板上掉下來(lái)。其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)多個(gè)dNTPs就會(huì)就會(huì)從模板上解離下來(lái)。從模板上解離下來(lái)。3隱蔽末端的隱蔽末端的DNA片斷片斷Klenow fragment補(bǔ)平補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇根據(jù)末端的順序選擇一種一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNA 限制性?xún)?nèi)切酶切限制性?xún)?nèi)切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTT

13、AA55-GAATT33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I -32P-dATP -32P-dGTP25 1hmRNAcDNA第一鏈第一鏈逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈第二鏈klenow533553引物引物從從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成：由兩個(gè)亞基組成： T7基因基因5編碼的大亞基：編碼的大亞基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：大腸桿菌編碼的小亞基： 增加大亞基對(duì)模板的親和性。增加大亞基對(duì)模板的親和性。 持續(xù)

14、合成能力強(qiáng)持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。 35外切酶活性高外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。單鏈和雙鏈都能降解。 不受不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙。二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙。 進(jìn)行末端標(biāo)記進(jìn)行末端標(biāo)記 以大分子量以大分子量DNA為模板的合成為模板的合成如如M13 補(bǔ)平隱蔽末端補(bǔ)平隱蔽末端取代合成法標(biāo)記取代合成法標(biāo)記3末端。末端。與與T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成補(bǔ)平補(bǔ)平3隱蔽末端；隱蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾聚合酶的化學(xué)修飾去

15、除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚合能力聚合能力和聚合速率提高了和聚合速率提高了3倍。倍。修飾后的修飾后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA測(cè)序雙脫氧法。測(cè)序雙脫氧法。 標(biāo)記標(biāo)記DNA 3隱蔽末端隱蔽末端 更有效地補(bǔ)平末端更有效地補(bǔ)平末端在基因克隆技術(shù)中，除了限制酶、連接酶、聚在基因克隆技術(shù)中，除了限制酶、連接酶、聚合酶這些主要的工具酶外，還經(jīng)常使用某些酶合酶這些主要的工具酶外，還經(jīng)常使用某些酶的相關(guān)功能對(duì)的相關(guān)功能對(duì)DNA或或RNA進(jìn)行分子修飾，以使進(jìn)行分子修飾，以使操作更加巧妙、簡(jiǎn)便和高效。操作更加巧妙、簡(jiǎn)便和高效。5pOH 3DNA or RNA5ppp dN5pppNOH 35 HO5HO dN5HO N功能：催化核酸脫功能：催化核酸脫5-磷酸基團(tuán)，使磷酸基團(tuán)，使DNA或或RNA片片段段5-P末端轉(zhuǎn)換成末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端。末端。5p3HOOH 3p 55OH3HOOH 3OH 55p3HOOH 3p 55OH3HOOH 3