第八章基因重組與基因分析

1、第八章基因重組與基因分析第八章 基因重組與基因分析2022/7/822022/7/82 核酸的分離純化檢測1 DNA的體外合成2 核酸序列測定3 分 子 雜 交4 基因重組與表達(dá)5第一節(jié) 核酸的分離純化檢測核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進(jìn)行分離和純化，核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，要純化核酸就必須去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，同時要保持所要提取核酸分子的結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。核酸的性質(zhì)：DNA為白色類似石棉樣的纖維

2、狀物， RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。2022/7/83南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié) 核酸的分離純化檢測1. 核酸分離、純化原則保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。分離核酸原則：溫度不要過高；控制一定的pH值范圍（pH值5-9）；保持一定的離子強度；減少物理因素對核酸降解的機(jī)械剪切力

3、。2022/7/84南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié) 核酸的分離純化檢測1. 核酸分離、純化原則保持防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。DNA酶抑制劑金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羥基喹啉；陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。2022/7/85南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院保持防止核酸的生

4、物降解RNA酶抑制劑。RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 皂土。 皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC（二乙基焦碳酸鹽）。粘性液體，強核酸酶抑制劑作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意：DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。容易降解，保存在4 或液氮中；提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。劇毒。其它：肝素、復(fù)合硅酸鹽、RNase阻抑蛋白、氧釩核糖核苷復(fù)合物。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院6第一節(jié) 核酸的分離純化檢測2. 核酸提取的過程與原理核酸提取的主要步

5、驟為：裂解細(xì)胞。去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA，反之亦然。濃縮沉淀核酸。純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)。檢測純度與質(zhì)量。核酸的保存保存。2022/7/87南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院2. 核酸提取的過程與原理細(xì)胞的破碎細(xì)胞破碎的方法有：高速組織搗碎機(jī)搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學(xué)處理法（SDS、LDS，吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）。該過程要在低溫下進(jìn)行，并避免核酸酶對核酸的水解。核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力（核酸與堿性蛋白的結(jié)合）、氫鍵和非極性

6、的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。核蛋白有核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白兩種，針對所提核酸的種類，要選擇合適的方法。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院8核蛋白的解聚、變性蛋白的去除常用方法：加入濃鹽溶液（如NaCl）。核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；酚/氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速

7、有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用?？杉由弦欢康漠愇齑伎煞乐蛊鹋莺痛偈顾嗯c有機(jī)相的分離（酚:氯:異戊醉=25:24:1）。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院9核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP 溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大 (比在水中大2倍)核酸的沉淀濃縮核酸和蛋白質(zhì)分離后，經(jīng)離心后溶液分為三層：上中下分別是核酸溶液、變性蛋白質(zhì)凝膠和氯仿。接下來要濃縮核酸，沉淀是濃縮核酸最常用的方法。沉淀的具體方法見第二章。優(yōu)點：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。一般

8、強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進(jìn)行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達(dá)到實驗要求。核酸的純化得到核酸沉淀后，還要要去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)。通常是用乙醇洗滌，由于乙醇易揮發(fā)，最后只剩下比較純的核酸。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院10核酸的濃度與純度的測定紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37g/ml；RNA為40g/m

9、l。測DNA：純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等?？赡艹霈F(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院11核酸的濃度與純度的測定紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量測RNA純RNA樣品其OD260/OD280應(yīng)介于之間，OD260 /OD230比值應(yīng)大于2.0。若RNA樣品OD260/OD280比值太小，有

10、蛋白質(zhì)或酚污染；比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。溴乙錠熒光法測定核酸的含量如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。此法的比較主要基于目測，是估計水平。電泳檢測核酸的含量和質(zhì)量通過電泳，可以觀察所得核酸樣品降解情況，也可以通過與標(biāo)準(zhǔn)Marker亮度比較來估計所得核酸含量。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院12核酸的保存DNADNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；長期保存樣品中可加入一滴氯仿。RNA RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中

11、，-70 保存；長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院13第一節(jié) 核酸的分離純化檢測3. 植物總DNA的提?。–TAB法）操作步驟：取 2g 清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于65水浴中保溫 20min，其間顛倒混勻23次。破碎細(xì)胞12000r/min 離心 5min，取上清液700L轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛

12、倒混勻。12000r/min，離心 5min。抽提去蛋白將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛倒混勻，可見 DNA絮狀沉淀。沉淀核酸12000r/min，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。 將沉淀回溶于20L TE 緩沖液待測。2022/7/814南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院3. 植物總DNA的提取注意事項：選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應(yīng)與 CTAB 抽提液充分混勻；若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇，盡可能選取幼嫩的材料；收集 CTAB 與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生

13、命科學(xué)學(xué)院15為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。可加少量Rnase降解RNA。第一節(jié) 核酸的分離純化檢測4. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取細(xì)菌質(zhì)粒染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常編碼一些對宿主有利酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等。常用作基因重組的載體。質(zhì)粒提取要去除的物質(zhì)：蛋白、基因組DNA、脂類及小分子雜質(zhì)、RNA。常用的方法有堿裂解法、煮沸裂解等。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包

14、括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA 。2022/7/816南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié) 核酸的分離純化檢測4. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）堿裂解法的原理：堿裂解法主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復(fù)中性時，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價閉合環(huán)狀這兩個特性。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 2022

15、/7/817南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院4. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取所用試劑：溶液I。作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II。作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III。作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS與線性DNA沉淀，K可中和DNA酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院184. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的

16、提取所用試劑：溶液I。作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II。作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III。作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白SDS與線性DNA沉淀，K可中和DNA酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院194. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取提取步驟：取1.5ml培養(yǎng)物倒入eppendorf管中，

17、12000r/min，4離心30秒。棄上清，將管倒置于吸水紙上使液體流盡。將細(xì)菌沉淀懸浮于100l溶液I中，室溫下放置5-10分鐘。加200L溶液II（新鮮配制），蓋緊eppendorf管，快速溫和顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將Eppendorf管放在冰上5分鐘。加入150L溶液III（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放5min 。12000r/min，離心5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一eppendorf管中。在上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，振蕩混勻后置于-20冰箱中放置20分鐘 ，然后4下離心10分鐘.用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清夜，真空抽干或室溫干燥.2

18、022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院204. 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取注意事項制備質(zhì)粒過程中，所有操作必須緩和，以避免機(jī)械剪切力對DNA的斷裂作用。同時也應(yīng)防止DNase引起DNA的降解。用酚-氯仿混合液除蛋白的效果比單獨使用酚或氯仿更好。為充分除去殘余蛋白質(zhì)，可進(jìn)行多次抽提，直至兩相間無絮狀蛋白沉淀。提取的各步操作盡量在低溫條件下進(jìn)行（冰浴上）。提取用的菌體不宜太多，因菌體多雜酶也相應(yīng)增加，給提取、純化帶來困難。電泳后得到的DNA條帶不整齊。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院21電泳檢測時，可以分離相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的質(zhì)粒分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）直線DNA（

19、LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。 第一節(jié) 核酸的分離純化檢測5. 核酸提取的其他方法胍鹽提取結(jié)合二氧化硅吸附法：二氧化硅具有特異吸附核酸的特性，異硫氰酸胍可使細(xì)胞裂解，因此在高濃度異硫氰酸胍存在下，從細(xì)胞（包括細(xì)菌）或病毒顆粒中釋放出來的核酸成分可以結(jié)合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。TRIzol試劑提取RNA方法：TRIzol試劑盒是由GIBCO BRI公司推出的產(chǎn)品，其操作方法簡單方便，一小時內(nèi)即可完成。用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，再加入氯仿，離心后可見三層，上層為透明的水相含有RNA，中間層含DNA，下層為紅色的有機(jī)

20、相，含蛋白質(zhì)。2022/7/822南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié) 核酸的分離純化檢測5. 核酸提取的其他方法旋轉(zhuǎn)離心柱提?。盒D(zhuǎn)離心柱技術(shù)是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，屬于硅吸附方法的一種。利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來。把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。此法也可用于DNA測序前核酸的純化，又叫過柱純化。旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)具有廣泛的發(fā)展前景，該產(chǎn)品可應(yīng)用于生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)

21、學(xué)等各方面的基因分析。2022/7/823南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié) DNA的體外合成DNA的化學(xué)合成DNA的化學(xué)合成廣泛用于合成寡核苷酸探針和引物，有時也用于人工合成基因和反義寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成儀合成的，大多數(shù)DNA合成儀是以固相磷酰亞胺法為基礎(chǔ)設(shè) 計制造的。1. 合成的原理核酸固相合成的基本原理是將所要合成的核酸鏈的末端核苷酸先固定在一種不溶性高分子固相載體上，然后再從此末端開始將其他核苷酸按順序逐一接長。每接長一個核苷酸殘基則經(jīng)歷一輪相同的操作，由于接長的核酸鏈?zhǔn)冀K被固定在固相載體上，所以過量的未反應(yīng)物或反應(yīng)副產(chǎn)物可通過過濾或洗滌的方法除去。合成至所需長度后的核

22、酸鏈可從固相載體上切割下來并脫去各種保護(hù)基，再經(jīng)純化即可得到最終產(chǎn)物。 2022/7/824南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院DNA的化學(xué)合成1. 合成的原理核酸固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3-OH與固相載體成共價鍵，5-OH被4，4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護(hù)，下一個核苷酸的5-OH亦被DMTr保護(hù)，3-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3兩個基團(tuán)。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院252022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院26每延伸一個核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)：(1) 脫三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脫去，游離出5-OH 。(2) 縮合：新

23、生成的5-OH 在四唑催化下與下一個核苷3-磷酰亞胺單體縮合使鏈增長。(3) 蓋帽：有少量(小于0.5%)未縮合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封閉，以防進(jìn)一步縮合造成錯誤延伸。(4) 氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價亞磷，需用碘氧化成五價磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向5方向延伸一個核苷酸。DNA的化學(xué)合成2. 合成后處理合成后的寡核苷酸鏈仍結(jié)合在固相載體上，且各種活潑基團(tuán)也被保護(hù)基封閉著，要經(jīng)過以下合成后處理才能最后應(yīng)用。切割：合成的寡核苷酸鏈仍共價結(jié)合于固相載體上，用濃氨水可將其切割下來。切割后的寡核苷酸具有游離的3-OH。脫保護(hù)：切割后的寡核苷酸磷酸基及堿基上仍

24、有一些保護(hù)基，這些保護(hù)基也必須完全脫去。磷酸基的保護(hù)基-氰乙基在切割的同時即可脫掉，而堿基上的保護(hù)基苯甲?；彤惗□；鶆t要在濃氨水中55放置15h左右方能脫掉。純化：純化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，鹽及各種保護(hù)基等雜質(zhì)。通常采用的純化方法有電泳法、高效液相色譜法和高效薄層色譜法等。純化這一步操作是可以選擇的，對要求不高的應(yīng)用如PCR等可不純化。近年來發(fā)展了一些修飾試劑，可在合成寡核苷酸時，對某些核苷酸進(jìn)行一定的修飾，為寡核苷酸探針的非放射性標(biāo)記提供了新途徑。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院27第二節(jié) DNA的體外合成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是上世紀(jì)80年代發(fā)展起

25、來的一種體外快速擴(kuò)增特異DNA序列的技術(shù)。此技術(shù)于1985年由Mullis發(fā)明，1988年耐熱TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)令該技術(shù)使用更加方便、有效。PCR可以說是20世紀(jì)核酸分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的最重大發(fā)明之一，這不僅表現(xiàn)在該方法本身的簡單和巧妙，而且還表現(xiàn)在它的出現(xiàn)高速發(fā)展了大量在以前看來似乎不可能的生物學(xué)技術(shù)。Mullis因其卓越的貢獻(xiàn)而獲1993年的諾貝爾化學(xué)獎。2022/7/828南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR的原理：原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催

26、化DNA的復(fù)制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：變性。加熱模板使其解離成單鏈。退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板 DNA 中所要擴(kuò)增的靶序列的兩側(cè)按堿基配對原則相結(jié)合。延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復(fù)制，拷貝數(shù)約增加106107倍。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院29聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR的原理：原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種

27、脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化DNA的復(fù)制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：變性。加熱模板使其解離成單鏈。退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板 DNA 中所要擴(kuò)增的靶序列的兩側(cè)按堿基配對原則相結(jié)合。延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復(fù)制，拷貝數(shù)約增加106107倍。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院302022/7/8南京農(nóng)

28、業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院31聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR的原理：這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復(fù)制，拷貝數(shù)約增加106107倍。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院32典型PCR的反應(yīng)體系：耐熱DNA聚合酶：耐熱DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶 ，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶應(yīng)用最廣泛。Taq酶在92.5、95和97.5時半衰期分別為40min、30min和5-6min，故PCR中變性溫度不宜高于95。Taq酶的最適溫度是72 ，較高

29、溫度下的DNA合成錯誤率較低。因此一次加酶可滿足PCR反應(yīng)全過程的需要，使PCR 走向自動化。純化的Taq DNA聚合酶有53外切酶活性，而無35外切酶活性，無校對活性。因此在PCR中每2104個核苷酸中有可能摻入一個錯誤核苷酸，這對一般的PCR產(chǎn)物分析不會有多少影響，但將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于分子克隆時，需使用更準(zhǔn)確的DNA聚合酶。在100L反應(yīng)體系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5單位，酶濃度過高，可引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，濃度過低則擴(kuò)增產(chǎn)物量減少。Taq DNA酶可在-20貯存至少6個月。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院33典型PCR的反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)的緩沖液：PCR的緩沖

30、液一般制成10，含有：500m mol/L KCl；100m mol/L Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2；0.1% 明膠。使用時要稀釋10倍。各組分的作用：Tris-HCl可維持反應(yīng)體系的pH；KCl有利于引物退火，但濃度過高會抑制Taq DNA聚合酶活性；明膠可保護(hù)酶不變性失活；Mg2+能影響Taq酶的活性，影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增DNA的產(chǎn)率，因此要將Mg2+濃度調(diào)至最佳。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院34典型PCR的反應(yīng)體系：PCR引物：PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計。引物設(shè)計一般遵循以下原則：引物長度。一般為15-3

31、0bp，引物太短，就可能同非靶序列雜交得到不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物 。G+C含量。G+C含量一般為40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估計引物的Tm值。堿基的隨機(jī)分布。引物中4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，不要多個嘌呤或多個嘧啶連續(xù)出現(xiàn)。引物自身不應(yīng)存在互補序列，以免自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響與模板的退火結(jié)合。兩引物之間也不應(yīng)有互補性，尤其是避免3端的互補而形成引物二聚體，使靶序列的擴(kuò)增量下降。引物濃度。引物的濃度一般為0.1-0.5mol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院35典型PCR的反應(yīng)體系：dN

32、TP：dNTP常用的濃度為20-200mol/L，而且4種dNTP的終濃度相等。dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會增加堿基的錯誤參入率，適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度。另外，dNTP是磷酸根的來源，會與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。模板DNA：模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、擴(kuò)增后的DNA、cDNA等，RNA的擴(kuò)增需要首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常PCR循環(huán)。含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA。 PCR反應(yīng)中模板加入量一般為102-105拷貝的靶序列。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

33、 生命科學(xué)學(xué)院36典型PCR的反應(yīng)體系：溫度循環(huán)參數(shù)變性溫度一般為在90-95。變性所需的時間取決于DNA的復(fù)雜性，一般用94、30s對模板DNA進(jìn)行變性，過高的溫度及過長的時間會降低Taq酶的活性。引物退火溫度通過Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般55-80 30s。延伸溫度選在70-75之間，此時Taq酶活性最高。延伸反應(yīng)的時間根據(jù)擴(kuò)增片段的長度而定，一般1 kb以內(nèi)延伸1 min，更長的片段需相應(yīng)延長時間。PCR的循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度，一般20-30次。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物也越多。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院37第二節(jié) DNA的體外合成聚合酶鏈

34、式反應(yīng)（PCR）PCR技術(shù)的擴(kuò)展典型的PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴(kuò)展到分子生物學(xué)的各個方面 ，較常用的技術(shù)擴(kuò)展有：1. “巢式”PCR先用一對引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對引物擴(kuò)增第一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一PCR 技術(shù)即巢式PCR。第一次擴(kuò)增所用引物稱外引物，第二次擴(kuò)增作用的引物稱內(nèi)引物。進(jìn)行“巢式”PCR可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少，用外引物進(jìn)行時，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增。經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的PCR擴(kuò)增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進(jìn)退式”PCR?！俺彩健奔啊爸?/p>

35、途進(jìn)退式”PCR主要用于極少量模板的擴(kuò)增。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院38PCR技術(shù)的擴(kuò)展2. 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）PCR由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為RNA時，需2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院39 先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR。RT-PCR常用于基因cDNA文庫的構(gòu)建和基因表達(dá)水平的分析。該技術(shù)需要用到反轉(zhuǎn)錄酶。PCR技術(shù)的擴(kuò)展3. 熒光定量PCR（RT-PCR）通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析，計算待測樣品的初始

36、模板量。螢光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。熒光定量實時PCR的特點：2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院40實時在線監(jiān)控。對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期。降低反應(yīng)的非特異性。使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高PCR特異性。增加定量的精確性。全程監(jiān)控，準(zhǔn)確定量。結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠。3. 熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一

37、種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院41 強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖 。3. 熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。實時熒光定量pcr技術(shù)中的一些重要因素：Ct值。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時

38、所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛嬎愠鲈摌悠返钠鹗伎截悢?shù)。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院423. 熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：實時熒光定量PCR中熒光化學(xué)，熒光定量pcr所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的53外切酶活

39、性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院432022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院44TaqMan熒光探針SYBR熒光染料PCR技術(shù)的擴(kuò)展4. 復(fù)合PCR在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段

40、的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。5.不對稱PCR兩種引物比例相差較大的PCR稱不對稱PCR。不對稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交探針等。6. 涂片PCR直接對載玻片上細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院45PCR技術(shù)的擴(kuò)展7. 反向PCR擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進(jìn)行酶切和

41、環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴(kuò)增。8. 錨定PCR用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA 3端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。9. 修飾引物PCR為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5-末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結(jié)合位點等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院46第三節(jié) 核酸序列測定DNA測序是指分析特定DNA片段

42、的堿基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使用DNA測序的方法進(jìn)行測序。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前應(yīng)用最廣泛的是：Sanger雙脫氧鏈終止法。Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法。新技術(shù)：雜交測序法， 質(zhì)譜法， 單分子測序法， 原子探針顯微鏡測序法，DNA 芯片法 。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院47第三節(jié) 核酸序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：在模板指導(dǎo)下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddN

43、TP)，由于雙脫氧核糖的3位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5-引物端和以ddNMP殘基為3端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院48Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：測序所用的ddNTPddNTPs 是反應(yīng)終止劑，可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs（一般1：34）。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)

44、學(xué)院49在自動測序中將熒光素連在4種ddNTP上Sanger雙脫氧鏈終止法基本步驟：測序模板的純化與定量測序反應(yīng)PCR儀測序反應(yīng)產(chǎn)物純化與變性上樣電泳測序儀分析結(jié)果2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院502022/7/851南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院2022/7/852南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院毛細(xì)管電泳熒光檢測Sanger雙脫氧鏈終止法測序結(jié)果：2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院53DNA測序儀的多種應(yīng)用：2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院54第三節(jié) 核酸序列測定Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法基本原理：在一個末端標(biāo)記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學(xué)反應(yīng)分

45、別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標(biāo)記的分子，從共同起點（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。鮮明特點是可以探測DNA構(gòu)象中的蛋白質(zhì)DNA相互作用。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院55Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法基本原理：2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院56化學(xué)降解法與雙脫氧法的比較Maxam-Gilber化學(xué)降解法所能測定DNA

46、序列的長度要比Sanger法短一些，通常說來，化學(xué)降解法對放射性標(biāo)記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。如今雙脫氧核苷酸末端終止法遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert化學(xué)降解法應(yīng)用得更為廣泛。但是，化學(xué)降解法具有一個Sanger 法所不具備的明顯優(yōu)點：即所測核酸序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以對合成的寡核苷酸進(jìn)行測序，分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，也可以通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法的簡便快速，仍不失為現(xiàn)今DNA測序的最佳選擇方案。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

47、 生命科學(xué)學(xué)院57第三節(jié) 核酸序列測定基因組測序在大規(guī)模DNA測序中，目標(biāo)DNA分子的長度可達(dá)上百萬個bp?，F(xiàn)在還不能直接測定整個分子的序列，然而，可以得到待測序列的一系列序列片段。序列片段是DNA雙螺旋中的一條鏈的子序列（或子串）。這些序列片段覆蓋待測序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對于一個特定的片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對于起點的位置。另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯誤的信息。序列片段的長度范圍3001000 bp，而目標(biāo)序列的長度范圍是3100萬bp，總的片段數(shù)目可達(dá)上千個。DNA序列片段組裝（又稱序列拼接）的任務(wù)就是根

48、據(jù)這些序列片段，重建目標(biāo)DNA序列。如果能夠得到DNA一條鏈的序列，那么根據(jù)互補原則，另一條鏈的序列也就得到了。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院58基因組測序基因組的測序過程一般包括三個步驟：建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC克隆、細(xì)菌人工染色體BAC克隆等；利用鳥槍法測定每個克隆的序列；序列拼裝和注釋：當(dāng)?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進(jìn)行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，進(jìn)而對序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院59鳥槍測序法：大分子DNA被隨機(jī)地“敲碎”成許多小片段，收集這些隨機(jī)小片段并將它們

49、全部連接到合適的測序載體；小片段測序完成后，根據(jù)重疊區(qū)計算機(jī)將小片段整合出大分子DNA序列。這就是所謂的鳥槍測序法?；蚪M測序鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復(fù)測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進(jìn)行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行測序。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大

50、學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院60第四節(jié) 分子雜交核酸分子雜交技術(shù)是分子生物中最常用的基本技術(shù)之一。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的，但雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補。雜交的雙方是待測核酸序列及探針。將核酸從細(xì)胞分離純化后可在體外與探針雜交，也可直接在細(xì)胞或組織內(nèi)進(jìn)行原位雜交。用于檢測的已知核酸片段稱之為探針(probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于隨后的檢測。常用的標(biāo)記物是放射性核素，近年來也發(fā)展了一些非放射性標(biāo)記物。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。核酸分子雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因克隆的

51、篩選和酶切圖譜制作、基因組中特定基因序列的定量和定性檢測、基因突變分析以及疾病的診斷等方面。它的應(yīng)用也大大推進(jìn)了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，如基因芯片就是分子雜交技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)展的產(chǎn)物。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院61第四節(jié) 分子雜交核酸分子雜交的發(fā)展分類：液相雜交：Hall等1961年將探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術(shù)的研究。固相雜交：Bolton等1962年設(shè)計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。膜雜交：60年代中期Nygaard等的研究為應(yīng)用標(biāo)記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的

52、DNA序列奠定了基礎(chǔ)。Brown等應(yīng)用這一技術(shù)評估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。 原位雜交：Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細(xì)胞中的定位。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院62第四節(jié) 分子雜交1. 探針探針：帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記，并僅與特異靶分子結(jié)合。探針的種類與選擇根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類；DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。探針選擇正確與否，將會直接影響到雜

53、交結(jié)果的分析。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院631. 探針DNA探針DNA探針指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列。這些DNA片段須是特異的。DNA探針的優(yōu)點：這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院641

54、. 探針cDNA探針cDNA中由于不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，因此是一種較為理想的核酸探針。但cDNA探針不易獲得，從而限制了它的廣泛應(yīng)用。另外，還須注意其中的poly（dT）產(chǎn)生的非特異性雜交問題。制備方法：RT-PCR 。RNA探針mRNA作為探針的優(yōu)點是：RNA/RNA和RNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性較DNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性高，因此雜交溫度可提高10左右，雜交的特異性更高；RNA中不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交較少；雜交后可用RNase將未雜交的探針消化掉，從而使本底降低。但是，RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，mRNA作為探針，其來源極不方便。因此，一般通過cDNA克

55、隆、甚至基因克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到mRNA樣或anti-mRNA樣探針。 。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院651. 探針反義RNA探針通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以得到同義RNA探針和反義RNA探針。反義RNA又稱cRNA，可用于反義核酸研究，還可用于檢測mRNA的表達(dá)水平。因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還可以在研究基因表達(dá)時，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。 前述幾種探針均是可克隆的。優(yōu)點：在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測序時，因為克隆探針較寡核苷酸探針

56、特異性強，較長的序列隨機(jī)碰撞互補序列的機(jī)會較短序列少；可獲得較強的雜交信號缺點：較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。這既是其優(yōu)點，又是其缺點：優(yōu)點是當(dāng)用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細(xì)菌DNA少許變異而漏診，缺點則是不能用于點突變的檢測。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院661. 探針寡核苷酸探針寡聚核苷酸探針可根據(jù)需要隨心所欲地用DNA合成儀合成，避免了天然核酸探針中高度重復(fù)序列所帶的不利影響。寡核苷酸探針長度只有15-30bp，其中即使有一個堿基不配對也會顯著影響其Tm，因此它特別適合于基因點突變分析；另外，由于序列的復(fù)雜性降低，因此雜交所需時間也較短。優(yōu)點：由于鏈短，

57、其序列復(fù)雜度低，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。一次可大量合成寡核苷酸探針（110mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院671. 探針寡核苷酸探針應(yīng)用寡核苷酸針的原則長1850nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。堿基成分：G+C含量為40%60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。避免單一堿基

58、的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院68第四節(jié) 分子雜交2. 標(biāo)記物放射性核素標(biāo)記物常用于標(biāo)記核酸探針的放射性核素有32P、3H和35S，有時也用14C、125I以及131I等。各種放射性核素的適用范圍是由其物理特性所決定的。32P 釋放的-粒子能量高，穿透力較強，放射自顯影所需時間短，靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于各種濾膜雜交以及液相雜交中，特別適合于基因組中單拷貝基因

59、的檢測。 其缺點是半衰期短，射線散射嚴(yán)重，導(dǎo)致X-片上帶型輪廓不清，有時會影響到結(jié)果的分析。35SS原子可以取代磷酸分子上的一個氧原子，從而形成35S標(biāo)記的核苷酸分子。其檢測靈敏度較32P稍低。由于其射線的散射作用較弱，在X-光膠片上成影分辨率較高。另外， 35S的半衰期較32P長，是其受歡迎的原因之一。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院692. 標(biāo)記物非放射性核素標(biāo)記物根據(jù)其檢測方法，非同位素標(biāo)記物可分為以下幾類：半抗原：目前使用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素和地高辛，它們都是半抗原，可以利用這些半抗原的抗體進(jìn)行免疫檢測。配體：生物素還是一種抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和鏈霉

60、菌類抗生物素蛋白(strep tavidine)的配體，可以利用親和法進(jìn)行檢測。熒光素：如FITC、羅丹明類等，可以被紫外線激發(fā)出熒光進(jìn)行觀察，主要適用于細(xì)胞原位雜交?；瘜W(xué)發(fā)光：一些標(biāo)記物可與另一物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，可以象放射性核素一樣直接對X-光膠片進(jìn)行曝光，這類標(biāo)記物可能是今后研究的主流。光密度或電子密度標(biāo)記物：如金、銀等，適用于細(xì)胞原位雜交，可在光鏡下或電鏡下進(jìn)行觀察。 2022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院702022/7/8南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院71酶促生物素標(biāo)記技術(shù)第四節(jié) 分子雜交3. 探針標(biāo)記法探針的放射性核素標(biāo)記切口平移法線狀、超螺旋及帶缺口的環(huán)狀 雙鏈DNA均