應(yīng)用人類全基因組芯片檢測多藥耐藥白血病細(xì)胞株HL60／VCR與敏感

1、應(yīng)用人類全基因組芯片檢測多藥耐藥白血病細(xì)胞株HL-60VCR與敏感董寶俠，陳協(xié)群，王哲，梁蓉，白慶咸，黃高昇，張偉平，高廣勛，韓冬梅【摘要】本研究利用基因芯片技能檢測白血病多藥耐藥細(xì)胞株HL-60VR及其親本細(xì)胞株差異基因表達(dá)譜，探究急性白血病多藥耐藥機(jī)制。本試驗(yàn)提取白血病細(xì)胞株HL-60及其多藥耐藥細(xì)胞株HL-60/VR的RNA，在反轉(zhuǎn)錄及體外轉(zhuǎn)錄歷程中別離用生物素舉行標(biāo)識表記標(biāo)幟，與Affyetrix公司人類全基因組芯片U133A雜交，用Affyetrix專用芯片掃描儀G2500AGeneArraySanner及irarraySuite、irDBTGenehipLIS、GenehipDT闡

2、發(fā)軟件體系處置懲罰雜交信號獵取效果。效果表白：白血病細(xì)胞株HL-60及其耐藥株HL-60/VR差異表現(xiàn)基因5507條，此中耐藥細(xì)胞株中上調(diào)表達(dá)基因3100條，下調(diào)表達(dá)基因2407條；差異極明顯性基因1040條，表達(dá)上調(diào)435條，下調(diào)605條，涉及與細(xì)胞生長運(yùn)動及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相干的基因。結(jié)論：多基因到場白血病細(xì)胞株的多藥耐藥機(jī)制，基因芯片技能是并行闡發(fā)多個基因、探究白血病多藥耐藥機(jī)制的有用要領(lǐng)?！娟P(guān)鍵詞】基因芯片DifferenefGeneExpressinPrfilesbeteenHL-60/VRandHL-60ellsDetetedbyHuanGeneGenehipKeyrdsgenehip;u

3、ltidrugresistane;leukeia;HL-60;HL-60/VR基因芯片技能是比年來盤算機(jī)技能與生物學(xué)技能交織的產(chǎn)物。它通過利用微加工、微電子技能及其他相干技能，在固體外貌合成大量探針，利用生物大分子DNA的布局及其堿基配對原那么，實(shí)現(xiàn)對核酸分子中基因片斷的正確、快速、大信息量的檢測。化療是治療急性白血病的重要本領(lǐng)，而白血病細(xì)胞對化療藥物的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導(dǎo)致化療失敗的根底緣故原由。白血病的多藥耐藥征象是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)及化療失敗的重要緣故原由。如今創(chuàng)造的腫瘤多藥耐藥機(jī)制重要涉及P-gpRPLRPBRP、GSH/GSTPK、Tp、DNA修復(fù)、多種凋亡相干基因和腫瘤細(xì)胞生存的表里情況

4、如pH、缺氧、溫度變革。但白血病DR的機(jī)制并非單一，它錯綜龐大，以網(wǎng)絡(luò)的情勢彼此作用并彼此制約，且在臨床上根據(jù)現(xiàn)有的DR機(jī)制接納的逆轉(zhuǎn)耐藥方法并不非常有用?；蛐酒瑸槲覀兲峁┝伺e行不雅察、闡發(fā)差異種類基因與白血病耐藥彼此干系的平臺，為進(jìn)一步探究腫瘤耐藥機(jī)制、臨床尋求有用逆轉(zhuǎn)耐藥要領(lǐng)制造了條件。我們選用Affyetrix公司人類全基因組芯片U133A8，對急性白血病耐VR細(xì)胞株與其親本細(xì)胞株差異表達(dá)基因舉行挑選和闡發(fā)。質(zhì)料和要領(lǐng)藥品長春新堿VR購自美國Siga公司，柔紅霉素、阿糖胞苷購自Pharaia-Upjhn公司，拓樸替康為貴州漢方制藥廠產(chǎn)物，米托蒽醌為四川升和制藥產(chǎn)物，羥基喜樹堿為黃石飛云

5、制藥廠產(chǎn)物，足葉乙甙為連云港制藥廠產(chǎn)物。以上藥物用無菌生理鹽水稀釋、過濾并分裝，-20保存?zhèn)溆谩gP單克隆抗體為Iunteh公司產(chǎn)物，TrizL為Gib公司產(chǎn)物，基因芯片HU-133A購自Affyetrix公司，其上包羅18000個明了的轉(zhuǎn)錄本。細(xì)胞造就急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL-60系A(chǔ)T細(xì)胞株為本校病理教研室保存株。HL-60耐長春新堿VR細(xì)胞株HL-60VR由美國紐約erialSlan-Kettering癌癥研究所引進(jìn)，造就于含10滅活小牛血清的RPI1640造就液含青霉素、鏈霉素各0.1U/L中，置于52、飽和濕度、37造就箱中懸浮造就。2-3天換液1次。HL-60VR細(xì)胞造就液中V

6、R濃度為250ng/l，實(shí)行所用細(xì)胞均為分開藥物馴化2周后的對數(shù)生恒久細(xì)胞。HL-60VR上風(fēng)克隆的有限稀釋法選擇調(diào)解HL-60VR細(xì)胞濃度至5103l，將此懸液經(jīng)100倍稀釋，即為50細(xì)胞毫升；再將50細(xì)胞毫升的細(xì)胞懸液經(jīng)5倍稀釋，即為10細(xì)胞毫升；末了將10細(xì)胞毫升的細(xì)胞懸液經(jīng)2倍稀釋，即為5細(xì)胞毫升。將3種稀釋好的細(xì)胞懸液別離接種于96孔板中，每孔加液0.1l，然后放入造就箱內(nèi)造就。HL-60VR細(xì)胞株的體外藥物敏感試驗(yàn)接納TT細(xì)胞毒實(shí)行法。比擬組為HL-60細(xì)胞，處置懲罰組為HL-60/VR，調(diào)解細(xì)胞濃度為2104l，按每孔100l，接種于96孔板，37、52孵育留宿，越日參加含差異濃

7、度藥物的造就液100l。化療藥物別離以1ng/l、3.2ng/l、10ng/l、32ng/l、100ng/l、320ng/l、1000ng/l、3200ng/l、10000ng/l、32000ng/l濃度分為10組，每組設(shè)4個平行孔。加藥后造就72小時，每個孔參加TT(5g/L)20l，繼承孵育4小時，離心，去上清，每孔參加150l二甲亞砜DS，用平板振蕩儀振蕩10分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測儀測定A490n值，并盤算細(xì)胞存活率(處置懲罰組A490n/比擬組A490n100)，實(shí)行重復(fù)3次，繪制劑量效應(yīng)曲線，求出半數(shù)按捺劑量(I50)。耐藥指標(biāo)接納逆轉(zhuǎn)倍數(shù)和相對逆轉(zhuǎn)率。細(xì)胞周期的檢測以2104/l密度

8、將對數(shù)生恒久細(xì)胞HL-60細(xì)胞及HL-60/VR(脫藥2周后)接種于6孔板，別離于48小時后網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)約1106，用預(yù)冷的PBS洗2次，離心去上清后，參加1lPBS和2l無水乙醇結(jié)實(shí)留宿，參加DNA-Prepstain染液染色后，用ELITEESP流式細(xì)胞儀Fulter公司檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，每份樣品檢測約5000細(xì)胞，用DNAultiyle軟件Bekanulter舉行統(tǒng)計學(xué)闡發(fā)，得到各個組細(xì)胞周期時相。P170卵白表達(dá)的esternblt檢測按分子克隆要領(lǐng)，別離提取HL-60細(xì)胞及HL-60/VR細(xì)胞總卵白，經(jīng)紫外分光光度法定量后，各組取等量總卵白舉行8SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PV

9、DF膜上，膜用關(guān)閉液blkingbuffer(TBS+1%BSA+0.05%Teen20)關(guān)閉1小時，參加Pgp(1100稀釋)單克隆抗體4留宿，越日37復(fù)溫1小時，TBST洗膜，兔抗小鼠IgG-過氧化物酶二抗室溫孵育1小時，TBS洗膜后DAB顯色。細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度的測定實(shí)行分為2組:HL-60細(xì)胞組和HL-60/VR細(xì)胞組;調(diào)解各組細(xì)胞濃度為1106/l，同時參加DNR至終濃度為10g/L，60分鐘后參加等體積預(yù)冷的PBS以停頓細(xì)胞代謝，用冷PBS洗滌2次，立即用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)DNR被引發(fā)的相對熒光強(qiáng)度，引發(fā)波長為488n，發(fā)射波長為575n，以熒光恣意單元的對數(shù)值表現(xiàn)DNR濃度。H

10、L-60VR及其親本細(xì)胞株差異基因表達(dá)譜基因芯片技能的研究用TrizL試劑別離提取HL-60及HL-60/VR細(xì)胞的總RNA，并檢測其質(zhì)量濃度及A260280值。根據(jù)Affyetrix公司要領(lǐng)舉行反轉(zhuǎn)錄、體外轉(zhuǎn)錄同時舉行生物素標(biāo)識表記標(biāo)幟合成RNA探針、基因芯片雜交、洗脫、染色和檢測。芯片掃描所得數(shù)據(jù)用AffyetrixirarraySuitesftare5.0舉行盤算和處置懲罰。統(tǒng)計學(xué)闡發(fā)組間比力接納t查驗(yàn)。效果HL-60VR上風(fēng)克隆的形成細(xì)胞造就1周擺布，96孔板孔中即形成較大克隆，待克隆長至孔中造就液體積的13后將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔造就板擴(kuò)大造就。細(xì)胞甩片并舉行瑞氏-姬姆薩染色，可見挑選出

11、的HL-60VR細(xì)胞體積顯著大于HL-60細(xì)胞，胞形不規(guī)矩，核仁更為顯著圖1，2。HL-60VR體外藥物敏感試驗(yàn)HL-60/VR細(xì)胞對多種化療藥物的I50值顯著大于HL-60細(xì)胞耐藥倍數(shù)為7-251.2。逆轉(zhuǎn)服從的凹凸與化療藥物種類有關(guān)，此中以DNR、TPT的耐藥倍數(shù)較高附表。細(xì)胞周期的檢測流式細(xì)胞儀檢測表現(xiàn)，HL-60細(xì)胞重要聚攏于S+G2期，而其耐VR細(xì)胞重要聚攏于G1期圖3、4。esternblt檢測esternblt檢測表現(xiàn)，HL-60/VR細(xì)胞株高表達(dá)P170糖卵白，而HL-60細(xì)胞株未見表達(dá)P170糖卵白圖5。HL-60/VR細(xì)胞內(nèi)DNR的積蓄HL-60細(xì)胞和HL-60/VR細(xì)胞內(nèi)

12、DNR濃度差異很大，前者積蓄本領(lǐng)強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)DNR均勻熒光強(qiáng)度為12.1，后者積蓄本領(lǐng)低，細(xì)胞內(nèi)DNR均勻熒光強(qiáng)度為8.69P0.05)(圖6，7)?；蛐酒瑢L-60VR及其親本細(xì)胞株差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)闡發(fā)利用基因芯片HU-133A對來自HL-60、HL-60/VR細(xì)胞株舉行檢測的效果是：在統(tǒng)共22283個探針池中，HL-60組檢測到了10707個，占總數(shù)的48.1；HL-60/VR組檢測到了11248個，占50.5。進(jìn)一步運(yùn)用Affyetrix公司提供的闡發(fā)軟件AffyetrixirarraySuitesftare5.0對兩個樣品的芯片檢測所得數(shù)據(jù)舉行處置懲罰，效果創(chuàng)造：與HL-60

13、細(xì)胞株比，HL-60/VR細(xì)胞株檢測到有3058個基因表達(dá)上調(diào)，此中上調(diào)倍數(shù)大于2倍的有435個；表達(dá)下調(diào)的基因共有696個，此中有605個基因的下調(diào)倍數(shù)大于2，它們別離是與細(xì)胞分化、凋亡等生長運(yùn)動相干的調(diào)治因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相干基因?；虮磉_(dá)譜的散點(diǎn)圖見圖8。圖中的每一個點(diǎn)代表1個基因，X軸和Y軸別離代表基因在HL-60細(xì)胞中和在HL-60/VR細(xì)胞中表達(dá)的信號強(qiáng)度。沒有差異表達(dá)的基因漫衍在以管家基因平衡后的歪線四周，闊別歪線的為差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因及陽性比擬。在上述的差異表達(dá)基因中，芯片ID號為39729-atGenBank號為L19185的基因NKEFB，在HL-60/VR細(xì)胞株中表達(dá)程

14、度除dr1外其上調(diào)最為明顯與HL-60細(xì)胞株比擬上調(diào)了335倍。白血病的多藥耐藥是一種龐大的多基因相干征象1-3，有關(guān)其分子機(jī)制仍舊不是很明晰。針對多藥耐藥相干基因如dr1所接納的逆轉(zhuǎn)耐藥方法如今經(jīng)臨床證明仍不克不及有用辦理耐藥題目。探求新的耐藥相干基因，展現(xiàn)耐藥機(jī)理，進(jìn)而生長新的逆轉(zhuǎn)耐藥要領(lǐng)，這無疑黑白常需要的。本實(shí)行誘導(dǎo)并維持HL-60/VR細(xì)胞系的耐藥性，TT法測定其耐藥倍數(shù)，esternblt法斷定P170分子的存在，流式細(xì)胞儀斷定P170分子泵的成效，比力白血病細(xì)胞HL-60和長春新堿耐藥細(xì)胞HL-60VR二者在細(xì)胞周期上的差異，明白耐藥細(xì)胞株的耐藥特性。由于傳統(tǒng)挑選差異成效基因的要領(lǐng)如消減雜交、差示PR等具有挑選基因有限、假陽性率高等缺點(diǎn)，以是我們選擇了Affyetrix公司提供的人類全基因組芯片U133A，高通量、平行闡發(fā)了髓系白血病細(xì)胞株HL-60及其耐藥細(xì)胞株HL-60/VR，并通過比對