基因工程DNA重組技術(shù)

1、DNA重組技術(shù)1Gene engineering原理與實(shí)踐2 Take a donor egg, suck out the nucleus, and hence the DNA, and fuse it with, say, a skin cell from the human being copied. Then, with the help of an electrical current, the reconstituted cell should begin growing into a genetic duplicate.3重組DNA技術(shù)的重大突破引發(fā)現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快誕生了

2、許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)，包括了一系列分子生物學(xué)操作步驟?；蚬こ?gene engineering)就是有意識(shí)地將一個(gè)生物體中有價(jià)值的目的基因轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要產(chǎn)品。 重組DNA技術(shù)是基因工程的核心4DNA重組技術(shù)示意圖5One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid. Fig. 20.16DNA重組技術(shù)質(zhì)粒、DNA或RNA提取(Extraction

3、)酶切（Enzyme digest)連接（ligation)轉(zhuǎn)化（transformation)篩選（selection)蛋白表達(dá)（Protein expression)7第一節(jié) 質(zhì)粒和質(zhì)粒提取Chapter 1 Plasmid and Plasmid extract8（一）關(guān)于質(zhì)粒（1）質(zhì)粒的概念質(zhì)粒(Plasmid)是雙鏈、閉環(huán)DNA分子，以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞染色體外的遺傳因子 。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶，離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使無它們也可存活。9Chromosomal DNAPlasmid（已經(jīng)連接外源DNA)10

4、單拷貝質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒DNA有自我復(fù)制功能及攜帶遺傳信息等特性，可作為重組 DNA操作的載體染色體質(zhì)粒11（2）質(zhì)粒的復(fù)制緊密控制型(Stringent control)：只在細(xì)胞周期的特定階段進(jìn)行復(fù)制。染色體不復(fù)制時(shí), 它也不能復(fù)制。松馳控制型(Relaxed control)：在細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制, 有多拷貝。 蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素使細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受抑制。緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制。12（3）質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能共存于同一宿主細(xì)胞中,兩種質(zhì)粒彼此競爭。細(xì)胞生長幾代后,某個(gè)質(zhì)粒

5、丟失。發(fā)酵出發(fā)菌株 單質(zhì)粒13（4）質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工改造而成。與天然質(zhì)粒相比, 質(zhì)粒載體帶有選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)和人工合成多克隆位點(diǎn)序列,并去掉了許多非必需序列,使分子量減小,便于基因工程操作。14理想克隆載體的特性分子量小、多拷貝、松馳控制型具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)能插入較大的外源DNA片段具有容易操作的檢測表型。 常用質(zhì)粒載體大小在1kb至10kb之間，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。15 pBR322old-style general purpose plasmid4362 bp16以Ampr和T

6、etr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。17pUC192.68kbp18Multiple Cloning Sequence (Polylinker)GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACPart of MCS of pUC19 and other plasmidsEcoRIKpnIBamHISal IXbaISmaISacI1920（二）提取質(zhì)粒DNA的方法3個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞;分離和純化質(zhì)粒DNA。用溶菌酶破壞菌體細(xì)胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞膜

7、。經(jīng)溶菌酶和SDS處理后,細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞在細(xì)胞碎片上,而質(zhì)粒比細(xì)菌染色體DNA小得多，所以3000-5000g離心后，質(zhì)粒留在上清液中。21用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌線性染色體DNA變性, 而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA)兩條鏈不會(huì)分開。 當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性,而是與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起, 而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然超螺旋分子,并溶解于液相中。22共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。提取質(zhì)粒時(shí)，除超螺旋DNA外，還有其它形式質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生

8、一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA (Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA (Linear DNA)。當(dāng)質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。所以電泳有23條帶。23附：試劑配制1、 LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ： 蛋白胨(Tryptone)10 g， 酵母提取物(Yeast extract) 5 g， NaCl 10 g， 溶于800ml去離子水中， 用NaOH調(diào)pH至7.0-7.5 （有時(shí)pH試紙比pH計(jì)更可

9、靠），加去離子水至總體積1升, 高壓下蒸氣滅菌20分鐘。242、 LB固體培養(yǎng)基： 每升液體培養(yǎng)基中加10-12g瓊脂粉,高壓滅菌。問題： 如果配制1升LB固體培養(yǎng)基， 然后分裝到10個(gè)三角瓶，何時(shí)加瓊脂粉？253、 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20保存?zhèn)溆谩?注意分裝 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20。問題: 溶菌酶的作用是什么?265、RNA酶A母液 將RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaC

10、l中,配成10mg/ml的溶液,于100加熱15分鐘,使DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20。276、TE緩沖液：10 mmo/L TrisCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存于4冰箱中 問題: (1).如何配制10 mmo/L TrisCl (pH8.0) ? (2). TE緩沖液的作用?何種溶液可以代替它?287、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解 NaAc3H2 O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲(chǔ)存于4冰箱。 298、 溶液：50 mmol/

11、L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4冰箱。9、溶液：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH母液稀釋)，1 SDS?，F(xiàn)用現(xiàn)配10、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。3011、酚：市售酚中含有醌等氧化物可引起磷酸二酯鍵的斷裂，及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián), 應(yīng)在160用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入0.1的

12、8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達(dá)到7.6以上,因?yàn)樗嵝詶l件下DNA會(huì)分配于有機(jī)相。3112、氯仿: 按氯仿:異戊醇24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開,異戊醇則可消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。 按體積/體積1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。 32（三）質(zhì)粒提取步驟 1、 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50g/ml Amp)中, 37培養(yǎng)12-24小

13、時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50g/ml Amp)中,37振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期。 332、 質(zhì)粒DNA少量快速提?。ˋ）煮沸法 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中,12000離心30秒。 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩 3秒鐘。5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、12000g離心10分鐘。7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。 8、電泳檢查。 34（B） 堿法 1

14、、1.5ml菌液倒入1.5ml eppendorf管中, 12000g離心30秒。 2、棄上清, 倒置于衛(wèi)生紙上,使液體流盡。 3、菌體沉淀重懸浮于100l溶液中(需劇烈振蕩),室溫放置5-10分鐘。 4、加入新配制的溶液 200l, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,千萬不要振蕩,冰浴5分鐘。 5、加入150L預(yù)冷的溶液, 溫和振蕩10秒, 冰浴5分鐘,12000g離心5分鐘。 6、上清液移入eppendorf管中,加入等體積酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,12000g離心5分鐘。357、水相移入eppendorf管中,加2倍體積無水乙醇,振蕩混勻，-20放置20分鐘，4下120

15、00g離心10分鐘。 8、棄上清, 加入1ml 70乙醇, 12000g離心5分鐘。 9、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡, 室溫干燥。 10、將沉淀溶于20l TE(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20冰箱。注意 1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。 2. 提取質(zhì)粒DNA中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時(shí)間稍長可使DNA沉淀完全。36 （C）CTAB法 菌液5000rpm離心3分鐘，得細(xì)胞沉淀；加入STET緩沖液及裂解酶，震蕩混勻，室溫下放置10分鐘；沸水浴45秒

16、，12000rpm離心15分鐘，去沉淀留上清；加入RNA酶，65水浴15分鐘；加入CTAB，12000rpm離心5分鐘；用1.2M的NaCl懸??；用2倍無水乙醇沉淀DNA；12000rpm離心10分鐘；75%乙醇洗滌一次；12000rpm離心5分鐘；再用75%乙醇洗滌一次；干燥后加入TE，-20保存。37CTAB法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：避免使用氯仿等腐蝕性試劑缺點(diǎn)：得率較低383、質(zhì)粒DNA的大量提?。ˋ）堿法 1、取對(duì)數(shù)生長后期菌液250ml，5000g離心10分鐘,棄上清, 離心管倒置使上清流盡。 2、細(xì)菌沉淀重懸浮于5ml溶液I中。 3、加入10ml新配制的溶液II, 緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以混

17、勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。 4、加10ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖勻離心管,冰置15分鐘,此時(shí)形成白色絮狀沉淀。39 5、5000g離心15分鐘。 6、取上清,加入RNA酶A(10mg/ml), 37水浴20分鐘。 7、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻, 12000g離心10分鐘。 8、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻, 12000g離心10分鐘。 9、取上層水相, 用70%冷乙醇洗滌，12000g離心5分鐘。 10、倒置離心管，風(fēng)干沉淀，溶于500ml TE或水中。40注意 1. 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。 2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。 3. 由于RNA

18、酶A中常有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性, 應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(80 1小時(shí)),使DNA酶失活。41(B)煮沸法 將培養(yǎng)液倒入eppendorf管中, 12000g離心30秒。棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)秒鐘，使液體流盡。將菌體沉淀懸浮于 STET溶液中，渦旋混勻。加入新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），渦旋震蕩5秒鐘。將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。12000g離心10分鐘。用滅菌牙簽剔除eppendorf管中的細(xì)菌碎片。取20ul進(jìn)行電泳檢查。 42第二節(jié) DNA酶切及凝膠電泳（1）酶切和酶切圖譜（2）瓊脂糖凝膠電泳（A）電泳所用試劑（B）電泳步驟43（1）酶

19、切和酶切圖譜DNA或RNA.測其濃度緩沖液（含Mg2+)10雙蒸水酶（含甘油） 37水浴保溫2-3小時(shí) DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都影響限制性內(nèi)切酶的活性。44Manipulating Genes- Cutting up the DNAGAATTCSection of DNA moleculeRestriction EndonucleaseCTTAAGCTTAAGGAATTC45Manipulating Genes- Digesting the Plasmid DNACTTAAGGAATTCDigest with EcoR1GAATTCAATTCG46Manipulatin

20、g Genes- The Resulting Recombinant DNAGGCTTAAAATTCCGTTAAGAATTCDonor Gene Inserted47 限制性內(nèi)切酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了200多種EcoRI特異識(shí)別GAATTC及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段粘性末端T4連接酶48酶切圖譜DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。通過綜合分析多種酶單切、雙切所得到的限制性片段來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及相對(duì)位置。49Restriction fragment analysis indirectly detects certain di

21、fferences in DNA nucleotide sequences.After treating long DNA molecules with a restriction enzyme, the fragments can be separated by size via gel electrophoresis.This produces a series of bands that are characteristic of the starting molecule and that restriction enzyme. Restriction fragment analysi

22、s detects DNA differences that affect restriction sites50 We can use restriction fragment analysis to compare two different DNA molecules representing, for example, different alleles.Because the two alleles must differ slightly in DNA sequence, they may differ in one or more restriction sites.If the

23、y do differ in restriction sites, each will produce different-sized fragments when digested by the same restriction enzyme.In gel electrophoresis, the restriction fragments from the two alleles will produce different band patterns, allowing us to distinguish the two alleles.Copyright 2002 Pearson Ed

24、ucation, Inc., publishing as Benjamin Cummings51Restriction fragment analysis is sensitive enough to distinguish between two alleles of a gene that differ by only base pair in a restriction site. Fig. 20.952已知序列酶切圖譜制作根據(jù)多個(gè)酶切片段的長度，推導(dǎo)酶切位點(diǎn)DNAstar等 軟件535455（2）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分離DNA長度從200bp至近50kb片段。實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平

25、板凝膠電泳進(jìn)行DNA電泳。聚丙烯酰胺凝膠（PAGE)可分離較小片段，多采用垂直裝置進(jìn)行蛋白質(zhì)或DNA電泳。 56遷移速率由下列因素決定DNA的分子大小瓊脂糖濃度DNA分子的構(gòu)象電源電壓嵌入染料的存在離子強(qiáng)度影響 57（A）瓊脂糖電泳所用試劑TBE 緩沖液 (5)：稱取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定容至1000ml。TAE緩沖液 上樣緩沖液 (6)：0.25% 溴酚藍(lán)(指示劑)，40% (w/v) 蔗糖水溶液（增加比重）。 58溴化乙錠(EB)插入DNA雙鏈之間，在紫外照射下呈現(xiàn)亮色溴化乙錠(EB)溶液母液: 將EB配制成10mg/m

26、l,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于 室溫即可。使用時(shí)溴化乙錠(EB)直接加入瓊脂糖凝膠或稀釋后染色。59電泳設(shè)備瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)水平凝膠電泳系統(tǒng)紫外分析儀凝膠成像系統(tǒng)60（B）電泳步驟制膠：0.71.0瓊脂糖加雙蒸水，微波爐中加熱融化，冷卻至60度，加EB, 倒平板加樣打開電源進(jìn)行電泳拍照Photoshop處理圖片pBS(-)5kb2kb1.5kb1kb0.75kb61瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽極移動(dòng) 酶切和電泳方法62For linear DNA molecules, separation depends mainly on size (length

27、 of fragment) with longer fragments migrating less along the gel.63思考題 1. 如果一個(gè)DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動(dòng), 你認(rèn)為可能是什么原因？ 2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？ 64第三節(jié) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞經(jīng)處理后(如電擊法,CaCl2 等法),細(xì)胞膜通透性發(fā)生暫時(shí)性改變,成為允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Component cells)。轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀。 65一、感受態(tài)細(xì)胞的制備( CaCl2

28、法) 受體菌的培養(yǎng) 挑取新活化的E. coli DH5單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 0.5左右。 661、菌液冰浴10分鐘,4下3000g離心10分鐘。2、 棄上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰置20分鐘,4下3000g離心10分鐘。 3、棄上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕懸細(xì)胞,冰置5分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。4、 感受態(tài)細(xì)胞分裝成50100l

29、的小份,-70可保存半年。 感受態(tài)細(xì)胞的制備關(guān)鍵是什么？67二、轉(zhuǎn)化(Transformation) 將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀68 Transfection Methods轉(zhuǎn)染69電脈沖穿孔法不需要預(yù)先誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞, 操作簡單轉(zhuǎn)化效率高109 轉(zhuǎn)化子/微克閉環(huán)DNA 而氯化鈣為106 108細(xì)胞死亡率增高需要成套的設(shè)備70轉(zhuǎn)化(Transformation)步驟（熱擊法） 1、從-70冰箱中取100l感受態(tài)細(xì)胞懸液,冰上解凍。2、 加入質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10l),輕輕搖勻,冰置30分鐘。 3、42水浴中熱擊90秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻5

30、分鐘。 714、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。5、將上述菌液4000g離心，棄上清，留200l 涂布于Amp篩選LB平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)過夜。 72Thanks for your patience!73第四節(jié) 重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 田平芳74一、連接是DNA重組的關(guān)鍵75（一）、 連接反應(yīng)1、將已經(jīng)酶切線性化的載體DNA與等摩爾(可稍多)的外源DNA片段（相同酶消化）混勻，加適量雙蒸水。 2、65保溫1

31、5分鐘。3 、室溫3分鐘。4、加入T4 DNA ligase buffer, T4 DNA ligase , 混勻,16保溫過夜。 76載體自連怎么辦？去磷酸化Alkaline Phosphatase Action77OAOCH2OPO-OHOOGOCH2OPOHOOCOCH2OPOHOOTO-CH2OPOHO35OOOOHOPH2CTOOOOHOPH2CCOOOOHOPH2CGOO-OOOHOPH2CA5378Alkaline Phosphatase ActionTwo nicks remainWill be repaired inbacterial cell follow-ing tran

32、sformation79（二） 載體和目的基因連接方式按照切口形狀劃分：平末端連接粘末端連接按照限制酶數(shù)目劃分：單切點(diǎn)雙酶切80限制性內(nèi)切酶的剪切方式平末端連接難于粘末端連接81單酶切載體和目的基因多用于篩選文庫 篩選文庫的流程造成雙向插入，故不適合基因表達(dá)82定向克?。―irectional Cloning）H BH BHBH: Hind III B: BamH I83定向克?。―irectional Cloning）Digest plasmid and target DNA with two different restriction enzymesHind III and BamHIEn

33、ds are not compatible（末端不匹配）Plasmid wont re-circularize unless target DNA has inserted(質(zhì)粒不會(huì)自連）雙酶切應(yīng)當(dāng)注意的問題？84二、轉(zhuǎn)化85三、篩選 本課介紹載體質(zhì)粒pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E. coli DH5菌株。由于pBS上帶有Amp抗性基因 和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。 86藍(lán)白篩選的原理：-互補(bǔ) lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識(shí)別，它在

34、生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變, 表達(dá)蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去-互補(bǔ)能力, 因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。87互補(bǔ)載體 Plac 受IPTG誘導(dǎo) 半乳糖苷酶氨基端片段 宿主細(xì)胞 互補(bǔ) 缺陷型半乳糖苷酶 geo+ X-gal 藍(lán)色菌落 插入片段 使載體不能表達(dá)半乳糖苷酶氨基端片段 白色菌落88 質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacZ基因中，該位點(diǎn)如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達(dá)出半乳糖苷酶，如

35、果平板培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal，X-gal便會(huì)被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍(lán)色克隆。 在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成白色的克隆 利用lacZ基因的插入失活篩選重組質(zhì)粒質(zhì)粒還攜帶了氨卞青霉素抗性基因，可篩選重組質(zhì)粒。89Blue-White ScreeningX-GalBlue productand colonyb-galactosidase (lacZ)(colorless)White colonyno cleavage of X-galnon-functional b-galX-Gal = 5-bromo-4-chloro3-indoly

36、l-b-D-galactopyranoside90重組質(zhì)粒篩選實(shí)驗(yàn)步驟1、取轉(zhuǎn)化原液100l用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上。 2、倒置平板37培養(yǎng),待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。 3、放于4數(shù)小時(shí),使顯色完全。 不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞,由于無Amp抗性,不能在Amp平板上成活。帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有-半乳糖苷酶活性, 在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。 9192附：含Amp、X-gal和IPTG的LB平板制備用微波爐溶化100ml LB固體培養(yǎng)基, 待溫度降至50時(shí),

37、分別加入50ul,100ul,20ul 的Amp、X-gal和IPTG，旋轉(zhuǎn)混勻，倒平板凝固后待用。從-70低溫冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞DH5，室溫下稍稍解凍, 向其中加入連接混合液，混勻后冰浴30分；42熱擊90秒或37 5分鐘，取出,立即置冰上5分鐘；加入不含氨芐（Amp）的LB培養(yǎng)基，混勻后37培養(yǎng)45分鐘，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)；取出后每分3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，涂板后37培養(yǎng)過夜。93思考題 1. 在用質(zhì)粒載體進(jìn)行外源DNA片段克隆時(shí)主要應(yīng)考慮哪些因素？ 2. 利用互補(bǔ)現(xiàn)象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？ 94粘性末端質(zhì)粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端95酶切后的目的基因片段接(連

38、接)連接后的重組質(zhì)粒DNA分子96重組質(zhì)粒目的基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!97(篩選)分解抗生素的酶含抗生素的培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌98大量擴(kuò)增提取大量質(zhì)粒酶切鑒定99Outline of DNA recombination techniques100您已掌握DNA重組的主要步驟獲得目的基因和載體用合適的酶切割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端連接酶將目的基因裝與載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌篩選具有抗藥性克隆101第五節(jié) 基因組DNA的提取和酶切基因組DNA的制備基因組DNA的檢測北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 田平芳102 細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取 細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序103問題：DNA操

39、作中離心的轉(zhuǎn)速如何確定？30005000？ 分離菌體10000？分離核酸104（一）基因組DNA的提取利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組大分子DNA沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達(dá)到提取的目的。105細(xì)菌基因組DNA的制備 培養(yǎng)細(xì)菌, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時(shí)。加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻

40、。加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分。用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 上清液移至離心管。用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。用玻棒撈出DNA, 70%乙醇漂洗, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。106（二）基因組DNA的檢測 有時(shí)DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會(huì)影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。 1. DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的

41、含量和質(zhì)量。 2. 取2-5l 在0.7% agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。 3. 取2g DNA, 用10單位(U)Hind酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。107如果DNA中所含雜質(zhì)多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理： （1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白質(zhì)和多糖。 （3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度離心, 去除雜質(zhì), 分離大片段DNA(可用作文庫構(gòu)建)。 108 紫外

42、分光光度計(jì)測定DNA純度和濃度109基因組完全酶切110基因組酶切不徹底111思考題 1. 提取基因組DNA的目的之一是構(gòu)建文庫，為什么構(gòu)建DNA文庫時(shí),一定要用大分子DNA？ 2. 如何檢測和保證DNA的質(zhì)量？ 112第六節(jié) RNA提取和cDNA合成北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 田平芳113一、RNA提取細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍、熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒,可快速提取高質(zhì)量的總RNA。114異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法1. 取100mg細(xì)胞組織.2. 加入500ul變性裂解液（異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、-巰基乙醇），冰浴勻漿，充分裂解細(xì)胞.3

43、. 依次加入50ul 乙酸鈉（pH4.0）、500ul水飽和酚、100ul氯仿：異戊醇(49：1)，用力振蕩15秒，冰浴15分.4. 4，12000r/min，離心20min.5. 上清加等體積異丙醇，-20過夜.6. 4，12000r/min，離心20min.7. 沉淀溶于300ul變性裂解液中，加入等體積異丙醇，混勻，-20放置2h以上。8. 4，12000r/min，離心20min.9. 沉淀用75%乙醇，4，12000r/min，離心20min洗鹽10. 4干燥，溶于20ul三蒸水中。115動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法 用Trizol法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。1、將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 116 4、棄上清，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加75%乙醇，混勻，4下7500g離心5分鐘。 5、小心棄去上清，室溫或真空干燥5-10分鐘，不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA