微生物控制檢測工作

1、1微生物檢測目的回憶環(huán)境控制和質(zhì)量控制的微生物檢測微生物環(huán)境監(jiān)測容器完整性測試滅菌前微生物負(fù)載測試培養(yǎng)基灌裝促生長試驗無菌測試其他微生物實驗室事項2環(huán)境監(jiān)測表3 這些數(shù)據(jù)是平均值 單個沉降碟在空氣中暴露小于4小時 這些數(shù)據(jù)是指導(dǎo)性的，并不是代表標(biāo)準(zhǔn) 必須建立微生物污染的水平限度，這樣就可以起到警戒、糾偏的目的，并監(jiān)控整個工廠的空氣質(zhì)量趨勢。微生物限度值3環(huán)境監(jiān)測方法外表監(jiān)測應(yīng)當(dāng)對產(chǎn)品接觸外表、地面、墻以及設(shè)備進行定期監(jiān)測接觸碟 用于平整外表取樣面積25cm2培養(yǎng)基要凸起，高于碟子邊緣培養(yǎng)基中含有中和劑外表擦試法-用于非規(guī)那么外表擦拭面積大約為25cm2定性或定量外表取樣必須遵循無菌取樣操作使污

2、染生產(chǎn)過程的關(guān)鍵外表的風(fēng)險最小化擦拭法和接觸碟法都可以使用4環(huán)境監(jiān)測方法浮游菌監(jiān)測撞擊式，離心式和膜過濾明膠取樣儀必須取一定體積的空氣取樣體積必須有代表性儀器必須經(jīng)過校驗沉降菌監(jiān)測沉降碟在空氣中的暴露時間為30-60 分鐘時間過長可能導(dǎo)致瓊脂干掉，在灌裝過程中需要更換。只能給出定性和半定量的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)必須結(jié)合空氣浮游菌的取樣結(jié)果進行評價5環(huán)境監(jiān)測取樣地點必須基于微生物污染的風(fēng)險取樣點必須在產(chǎn)品或組件暴露的區(qū)域周圍取樣，比方：在灌裝針頭處凍干機產(chǎn)品裝載處膠塞鍋部件無菌連接操作部位操作人員活動頻繁處但不會影響生產(chǎn)進程低級別的區(qū)域以較低頻率進行監(jiān)測并監(jiān)控趨勢6環(huán)境監(jiān)測人員每次進入，手套都必須取樣但不能

3、在消毒過后馬上取樣定期的對著裝的其他部位進行取樣潔凈室的操作人員必須定期的驗證來說明自己在更衣時衣服未受污染更衣資質(zhì)確認(rèn)。7環(huán)境監(jiān)測污染水平與趨勢GMP法規(guī)上的限度值僅供參考。企業(yè)必須根據(jù)不同的區(qū)域制定警戒和糾偏限度值。必須考慮單個結(jié)果值 - 平均值可能掩蓋了不可接受的情況必須要有書面的操作規(guī)程規(guī)定數(shù)據(jù)回憶和超過限度所采取的行動趨勢分析報告對于人員和環(huán)境的短期和長期結(jié)果分析報告環(huán)境監(jiān)測結(jié)果必須歸檔在批生產(chǎn)記錄里微生物菌群的明顯改變必須引起重視。8環(huán)境監(jiān)測消毒劑消毒劑的適用性、有效性、局限性以及消毒規(guī)程程都必須評估必須制定最少接觸時間對于A/B級區(qū)的消毒劑必須是無菌級別的，包裝在無菌容器內(nèi)，并在

4、明確的效期內(nèi)使用必須證明對工廠內(nèi)的常規(guī)菌群有效必須使用殺孢子劑如果在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)孢子，可以“噴霧的形式消毒部件和設(shè)備消毒的操作規(guī)程必須足夠的詳盡，以確保重現(xiàn)性配制，工作順序，接觸時間從不良趨勢中檢出的微生物必須檢測它們對于日常使用消毒劑的耐受性。9環(huán)境監(jiān)測制藥用水制藥用水的微生物水平是非常重要必須要有一個廣泛且全面的水系統(tǒng)監(jiān)測方案工廠源水，預(yù)處理水，反滲透水，去離子水，純化水/超純水和注射用水都必須被監(jiān)測企業(yè)必須設(shè)定警戒和糾偏限度。WHO推薦下一頁對于純化/水超純水和注射用水，藥典的限度如下：純化水100CFU/mL超純水和注射用水10CFU/100mL但通常高溫循環(huán)10環(huán)境監(jiān)測制藥用水微生物限

5、度參考值 CFU/mL11環(huán)境監(jiān)測制藥用水如果條件允許，需檢測大腸菌群及或假單胞菌群該菌群可能會導(dǎo)致生物膜的產(chǎn)生。非腸道用藥制劑用水必須檢測熱原。限度必須小于0.25 EU/mL水的微生物檢測用R2A 瓊脂此種培養(yǎng)基對于水中的微生物的復(fù)活提供低養(yǎng)分在30-35C 至少培養(yǎng)5天。取樣程序必須遵循生產(chǎn)過程中的操作規(guī)程。壓縮空氣/氮氣/CO2必須監(jiān)測非活性粒子和微生物。取樣時使用減壓口以提供穩(wěn)定的氣流，驗證時必須考慮這些要求12容器完整性測試密閉系統(tǒng)的完整性初始驗證用無菌培養(yǎng)基注入容器中，然后將容器浸入106 CFU/mL的高濃度菌懸液中。對真空下進行密封的容器必須定期進行真空度檢測，以證明在整個有

6、效期內(nèi)仍能維持真空度。建立規(guī)程，在制造過程剔除密閉性不好的產(chǎn)品。進行燈檢的操作人員必須經(jīng)常休息，并且定期進行視力檢查。13微生物負(fù)載/過程控制IPC檢測對于滅菌前的生物負(fù)載測試，過程控制和原材料的測試都必須建立相應(yīng)的書面規(guī)程必須對測試方法進行驗證，來證明少量微生物也能夠復(fù)活。如果環(huán)境中有厭氧菌存在，就要考慮使用厭氧培養(yǎng)基。必須有文件來規(guī)定微生物限度的目標(biāo)值，警戒和糾偏值，并且文件中應(yīng)規(guī)定超過糾偏值時，所必須采取的措施。14微生物促生長試驗用于微生物檢測的培養(yǎng)基必須先對其進行營養(yǎng)試驗來證明它是可以支持微生物的生長培養(yǎng)基灌裝驗證用的培養(yǎng)基必須能夠支持大多數(shù)微生物的生長細(xì)菌和真菌。通常選用大豆酪蛋白

7、酶消化培養(yǎng)基。有時如果環(huán)境中存在厭氧菌，需要考慮使用厭氧性培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基灌裝結(jié)束以后，必須用實驗證明培養(yǎng)基能夠支持環(huán)境環(huán)境別離菌的生長。進行營養(yǎng)試驗時，需要接種10-100CFU的菌液。菌株包括枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉等，以及環(huán)境別離菌。15微生物促生長試驗培養(yǎng)基接種的培養(yǎng)基必須在3天內(nèi)有微生物的生長。用于環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基也必須對其促生長特性進行測試。必須進行驗證證明培養(yǎng)基對殘留消毒劑的中和能力，能夠持在測試條件下的微生物的復(fù)活培養(yǎng)基中必須有中和劑 。外部購置的培養(yǎng)基也必須進行測試。用于培養(yǎng)基灌裝和環(huán)境監(jiān)測的培養(yǎng)基必須經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)來證明其無菌性。培養(yǎng)基必須有經(jīng)過驗證的保存期限

8、。16無菌檢測無菌檢測是無菌產(chǎn)品釋放時進行的一項質(zhì)量控制檢測該方法有有顯著統(tǒng)計學(xué)局限性 只能檢測大范圍的污染取樣藥典中規(guī)定了檢測樣品的數(shù)量及體積。在無菌工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，必須對灌裝過程的前、中、后以及生產(chǎn)過程有干擾和中斷后生產(chǎn)的產(chǎn)品進行取樣。對于最終滅菌的產(chǎn)品，必須在先前識別的冷點處進行取樣。取樣數(shù)量必須能夠滿足復(fù)檢。17無菌檢測設(shè)施無菌檢測必須在和無菌工藝生產(chǎn)過程相同的條件下進行。B級區(qū)背景的A級區(qū)層流也可以在隔離器中進行空氣經(jīng)過高效過濾器HEPA過濾，必須監(jiān)控壓差，并有超限報警進入該區(qū)域必須經(jīng)過氣閘室操作人員必須進行正確的無菌更衣操作人員必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)并對其進行人員資質(zhì)確認(rèn)必須制定相應(yīng)的

9、清潔，消毒，殺菌規(guī)程應(yīng)對其環(huán)境進行監(jiān)測18無菌檢測藥典中已規(guī)定了方法如果產(chǎn)品可以過濾，推薦使用膜過濾方法直接接種法可作為備選培養(yǎng)基類型通常使用大豆酪蛋白酶消化培養(yǎng)基 (SCD)和 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 (用于檢測需氧和厭氧微生物)必須驗證該培養(yǎng)基能夠支持產(chǎn)品中曾經(jīng)出現(xiàn)過的一系列微生物的生長，通常這些微生物數(shù)量濃度較少，可能需要中和抑菌劑。細(xì)菌3天內(nèi)能夠生長，霉菌5天內(nèi)能夠生長購置的或自制的培養(yǎng)基必須滅菌，滅菌程需經(jīng)過驗證。19無菌檢測培養(yǎng)基使用前必須通過營養(yǎng)試驗低數(shù)量的微生物必須有批號和有效期培養(yǎng)周期至少14天的培養(yǎng)培養(yǎng)基SCD中30-35C培養(yǎng), FTM培養(yǎng)基中20-25C 培養(yǎng)培養(yǎng)物進行定

10、期檢查對溫度進行監(jiān)控，溫度監(jiān)控設(shè)備必須經(jīng)過校驗如果產(chǎn)品產(chǎn)生渾濁、絮凝或沉淀，14天后應(yīng)將適當(dāng)比例的培養(yǎng)物2-5%接種到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天20無菌檢測陰性對照對于同一批培養(yǎng)基，應(yīng)局部或全部預(yù)先培養(yǎng)14天后才能使用 (也可以同無菌試驗一起進行)陰性產(chǎn)品對照 應(yīng)使用相似形式和包裝的實際產(chǎn)品進行對照檢測使檢測結(jié)果容易評價應(yīng)計算和記錄陰性對照的污染率陽性試驗對照抑細(xì)菌/抑真菌試驗應(yīng)證明培養(yǎng)基能支持產(chǎn)品中曾經(jīng)出現(xiàn)過的一系列微生物的生長，通常這些微生物數(shù)量濃度較少，可能需要中和抑菌劑細(xì)菌3天，霉菌5天內(nèi)應(yīng)有明顯生長21無菌檢測陽性對照應(yīng)在新產(chǎn)品和任變更時進行驗證應(yīng)每年進行再驗證含抗生素或防腐劑或會緩

11、慢釋放以上成分的產(chǎn)品推薦使用直接接種法證明即使在培養(yǎng)終點，培養(yǎng)基沒有受到產(chǎn)品影響，依然能支持生長結(jié)果任何培養(yǎng)出的微生物都應(yīng)被鑒定遺傳學(xué)就自動/半自動鑒定系統(tǒng)都應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌種進行定期確認(rèn)22無菌檢測解釋和復(fù)試不應(yīng)檢出污染菌除非能夠證明實驗失敗是由于與產(chǎn)品無關(guān)的原因引起的，方能進行復(fù)測歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)(a) 無菌檢查時環(huán)境監(jiān)控結(jié)果不符合要求(b) 回憶無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)使用了可疑的方法，導(dǎo)致結(jié)果不符合要求(c) 陰性對照有微生物生長(d)供試品中生長的微生物經(jīng)鑒定后確證是因無菌試驗中所使用的物品或無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。23無菌檢測解釋和復(fù)試當(dāng)出現(xiàn)情況(a), (b) 或 (c)時應(yīng)中止試驗如果試驗結(jié)束

12、進行的抑制試驗未出現(xiàn)挑戰(zhàn)菌的生長，也認(rèn)為試驗無效出現(xiàn)情況(d)時必須用細(xì)菌鑒定的方法證明無菌試驗別離的微生物經(jīng)鑒定來自試驗物料例如培養(yǎng)基和/或環(huán)境必須使用遺傳學(xué)基因鑒定方法取相同樣品數(shù)進行復(fù)試復(fù)試中有任何微生物生長，判產(chǎn)品不符合規(guī)定24微生物實驗室其他事項標(biāo)準(zhǔn)菌種的保藏標(biāo)準(zhǔn)菌種主要用于如下：培養(yǎng)基質(zhì)量控制檢測方法驗證檢測試劑的質(zhì)控必須保持其遺傳穩(wěn)定性，以維持它們的特性有些微生物培養(yǎng)物很容易發(fā)生變異/遺傳學(xué)變化，這可能會影響它的培養(yǎng)特性，此類菌種不能繼續(xù)使用菌種發(fā)生變異/遺傳變化的概率是隨著傳代次數(shù)的增加而增加的-工作菌種自原始菌種傳代后不應(yīng)超過5代25微生物實驗室其他事項標(biāo)準(zhǔn)菌種(2)實驗室必

13、須建立一套保藏和維持標(biāo)準(zhǔn)菌種原始特征的體系。實驗室必須:保存適宜的標(biāo)準(zhǔn)菌種用于培養(yǎng)基，檢測試劑的質(zhì)量控制、以及方法驗證；確保標(biāo)準(zhǔn)菌種可追溯到公認(rèn)的菌種保藏庫比方ATCC，NCTC確保標(biāo)準(zhǔn)菌種在實驗室內(nèi)的鑒定結(jié)果唯一性，可溯源26微生物實驗室其他事項標(biāo)準(zhǔn)菌種 (3)實驗室必須建立書面規(guī)程:必須對書面記錄標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代控制 (如原始菌種 轉(zhuǎn)接保存菌株和工作菌株);對于標(biāo)準(zhǔn)菌種的購置、保藏、維護、鑒定和傳代次數(shù)都要書面記錄防止將工作菌種用作已衰退的次代菌種或原始菌種株對各個標(biāo)準(zhǔn)菌株都有記錄:鑒定、來源、歷史和接受日期對于原始菌株、傳代菌株和工作菌株都有復(fù)活、保藏、保存和存放條件的記錄;對原始菌株和/

14、或傳代菌株記錄純化和鑒定的結(jié)果; 傳代菌株和工作菌株的配制日期。27微生物實驗室其他事項培養(yǎng)基質(zhì)量控制用于無菌試驗和培養(yǎng)基灌裝以外的培養(yǎng)基也必須進行質(zhì)量控制促生長/營養(yǎng)試驗是可用定量或半定量的方法對于選擇性培養(yǎng)基和/或特殊菌種的培養(yǎng)基，進行陰性陽性對照不同程度的質(zhì)量控制要求取決于培養(yǎng)基是否：自己配制每批都要檢測購置預(yù)澆制的培養(yǎng)基 (供給商檢測培養(yǎng)基，實驗室定期核對)28微生物實驗室其他事項培養(yǎng)基質(zhì)量控制(2)實驗室必須:培養(yǎng)基的配制、質(zhì)控、釋放和保存都要有書面規(guī)程;在常規(guī)存放條件下,培養(yǎng)基必須確立經(jīng)過驗證的有效期;對每批培養(yǎng)基的配制和質(zhì)量控制進行記錄; 確保每批培養(yǎng)基的配制記錄都能追溯到該批培

15、養(yǎng)基的微生物質(zhì)控記錄;根據(jù)接受標(biāo)準(zhǔn)來評估微生物質(zhì)量控制檢測結(jié)果29微生物實驗室其他事項培養(yǎng)基的滅菌程序培養(yǎng)基滅菌過程應(yīng)同產(chǎn)品滅菌一樣,都需對滅菌過程進行驗證和監(jiān)控設(shè)備校驗和檢查實驗室設(shè)備(比方移液槍、天平、培養(yǎng)箱、冰箱、溫度計、滅菌釜、層流臺等)都必須經(jīng)過校驗、定期復(fù)校和常規(guī)檢查如果條件允許人員必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和授權(quán)30微生物實驗室其他事項生物指示劑的測試如果進行內(nèi)控測試，應(yīng)包有熱處理步驟確保指示劑中只i存在孢子而并非營養(yǎng)型微生物必須抽查生物指示劑，確認(rèn)供給商提供的孢子濃度是否正確內(nèi)毒素檢測非腸道用藥不得檢出內(nèi)毒素內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁中的脂多糖物質(zhì)，其在人體內(nèi)會引起發(fā)燒對原材料

16、、注射用水和其他一些成品必須進行內(nèi)毒素檢測31微生物實驗室其他事項內(nèi)毒素檢測 (2)LAL (美洲鱟試劑) 測試用于檢測內(nèi)毒素 (以前是兔溫試驗)試驗基于內(nèi)毒素和鱟血液反響會產(chǎn)生凝結(jié)LAL測試的類型凝膠法濁度法比色法內(nèi)毒素檢測的設(shè)備必須無熱原必須針對每個產(chǎn)品進行檢測方法的準(zhǔn)確性和可靠性驗證32微生物實驗室其他事項凝膠法常規(guī)方法官方認(rèn)可的方法樣本轉(zhuǎn)入靈敏度的LAL試劑中恒溫培養(yǎng). 凝膠如果凝結(jié)表示內(nèi)毒素檢測成陽性。內(nèi)毒素檢測 (3)33微生物實驗室其他事項濁度法動力學(xué)方法樣品先轉(zhuǎn)入LAL試劑中，用分光光度計來測定增加混濁的速率或最終凝結(jié)所需的時間，然后再和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比對來判斷內(nèi)毒素檢測 (4)34微生物實驗室其他事項比色法內(nèi)毒素會催化LAL中一種酶的活性，該種酶會分解一種無色物質(zhì)成有色物質(zhì)，而它的顏色通過分光光度計來測定，然后和標(biāo)準(zhǔn)曲線來比對可以