食品沙門(mén)志賀氏菌

1、食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 1沙門(mén)氏菌檢驗(yàn) GB 4789.4-2010志賀氏菌檢驗(yàn) GB/T 4789.5-2003菌種傳代與保藏2沙門(mén)菌的分布沙門(mén)菌廣泛存在于自然環(huán)境中。通過(guò)沙門(mén)菌病患者或健康帶菌的人和動(dòng)物的排泄物污染環(huán)境和食品。易于污染的高危食物：畜禽肉類(lèi)、蛋、奶及其制品。沙門(mén)菌在肉類(lèi)中不分解蛋白質(zhì)，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，所以當(dāng)食品污染了沙門(mén)菌后，通常沒(méi)有感官性狀的改變。3沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)程序4目的：修復(fù)損傷的細(xì)菌細(xì)胞。緩沖蛋白胨水(BPW) 肉湯：是基礎(chǔ)增菌培養(yǎng)基，不含任何抑制成分，有利于受損傷的沙門(mén)菌復(fù)蘇。使受損傷的沙門(mén)菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。方法：25 g（mL）樣品置于盛有225 mL BPW的無(wú)

2、菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻，直接進(jìn)行培養(yǎng)。于36 1 培養(yǎng)8 h18h。前增菌5輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，移取1 mL, 轉(zhuǎn)種于10 mL TTB 內(nèi), 于42 1 培養(yǎng)18 24 h。同時(shí), 另取1 mL, 轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi), 于36 1 培養(yǎng)18 24 h。 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán), 劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或顯色培養(yǎng)基平板）。于36 1 分別培養(yǎng)18 24 h (XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、顯色培養(yǎng)基平板) 或40 h48 h (BS瓊脂平板)，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。 選擇

3、性增菌與分離6劃線接種，分離純化78典型菌落-BS 菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色, 菌落周?chē)囵B(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落, 周?chē)囵B(yǎng)基不變。國(guó)產(chǎn)BS進(jìn)口BS9典型菌落-XLD進(jìn)口XLD國(guó)產(chǎn)XLD菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心10典型菌落-CHRO菌落為紫紅色 11初篩微生物菌落顏色沙門(mén)氏菌紫色(直徑約1mm)檸檬酸桿菌屬藍(lán)色(直徑約1mm)變形桿菌無(wú)色或被抑制12注意事項(xiàng)亞硫酸鉍瓊脂（BS）：該培養(yǎng)基制備過(guò)程不宜過(guò)分加熱，以免降低其選擇性，應(yīng)在臨用時(shí)配制，超過(guò)48h不宜使用。

4、將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2 5 或室溫至少保留24 h，以備必要時(shí)復(fù)查。 13志賀氏菌需氧或兼性厭氧。在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、無(wú)色半透明、邊緣整齊、中等大小的菌落。在肉湯中呈均勻混濁生長(zhǎng)，無(wú)菌膜。14志賀氏菌檢驗(yàn)程序15 采樣樣品處理選擇性增菌選擇性平板分離生化試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告161.樣品處理：無(wú)菌操作稱(chēng)取檢樣25 g（mL），置于盛有225 mL GN增菌液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器以8 000 r/min10 000 r/min均質(zhì)拍打1 min2 min。2.增菌培養(yǎng)：置于36培養(yǎng)6-8h，培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)菌生長(zhǎng)情況而定，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微渾濁時(shí)即應(yīng)中止培養(yǎng)。3.分離

5、：分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán), 劃線接種于一個(gè)SS瓊脂平板和一個(gè)EMB平板。于36 1 分別培養(yǎng)18 24 h (觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無(wú)色透明不發(fā)酵乳糖的菌落）。志賀氏菌檢驗(yàn)17注意事項(xiàng)1.志賀菌在常溫存活期很短，因此，當(dāng)樣品采集后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢驗(yàn)，如果在24h內(nèi)檢驗(yàn)，樣品可保存在冰箱內(nèi)。 2.增加鑒別培養(yǎng)基的數(shù)目，可以增加志賀菌的陽(yáng)性檢出率，用于分離的鑒別培養(yǎng)基一般不少于兩個(gè)。中等選擇性的SS瓊脂平板一個(gè)，弱選擇性的EMB瓊脂平板一個(gè)。18鑒定API 20EVITEK 19菌種的傳代與保藏20 菌種保藏及應(yīng)用 干菌種（0代） 液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代） 液體培養(yǎng)基復(fù)

6、壯（2代），加等體積20%無(wú)菌甘油混勻，1ml/管 凍存管分裝，-20或-80保存 。 使用時(shí)取1支凍存管自然（室溫）解凍，接種至5ml液體培養(yǎng)基按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋?zhuān)?代）注意：已經(jīng)解凍的凍存管不能再冷凍保存，以免凍融！21我國(guó)提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常是以?xún)龈煞鄣男问桨b于熔封的厚玻璃容器中。 干菌種(安瓿)的開(kāi)啟：22 菌懸液的制備每次使用取分裝好的甘油凍存管移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后接種至已滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中( 5ml/支, 生孢梭菌用10ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基), 將已接種畢的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取出備用。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身操作習(xí)慣總結(jié)出一套切實(shí)可行、快速穩(wěn)定的菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程

7、序。23操作步驟1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面，然后開(kāi)紫外燈消毒30分鐘。2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘，溫度平衡后才能傳代。3、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入緩沖間，換鞋、穿無(wú)菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽(yáng)性菌接種室。4、接種后置規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長(zhǎng)良好，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?4 2-8可保存6個(gè)月；-20可保存12個(gè)月；-80可保存24個(gè)月。保存時(shí)挑取細(xì)菌新鮮純培養(yǎng)物，接入菌種保存管。擰緊保存管，來(lái)回顛倒幾次使細(xì)菌乳化，不能旋搖。用無(wú)菌移液器將菌種保存管內(nèi)的液體吸取干凈，妥善放置被吸出的液體。使用時(shí)無(wú)菌條件用滅菌的針或鑷

8、子取出小瓷珠。小瓷珠直接劃線或加到合適的液體培養(yǎng)基中。25保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。濃菌液一般于冰箱中保存可用7天。菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28的可以在24小時(shí)內(nèi)使用。對(duì)于具有穩(wěn)定的孢子形態(tài)的黑曲霉和枯草芽孢桿菌，可以使用孢子儲(chǔ)備液，在驗(yàn)證過(guò)的期間內(nèi)，其穩(wěn)定的孢子儲(chǔ)備液可以保存在28一直使用。注意事項(xiàng)26注意事項(xiàng)黑曲霉轉(zhuǎn)種操作應(yīng)在超凈工作臺(tái)（或相當(dāng)此環(huán)境）中進(jìn)行，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，靠近酒精燈操作；每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱(chēng)逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。保藏時(shí)，乙型溶血性鏈球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。27菌種保管菌種保管應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，專(zhuān)柜貯藏，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，