流式細胞儀原理及應用PPT通用通用課件

1、致：流式細胞術概述流式細胞術的基本概念流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量流式細胞儀的檢測范圍 細胞結構細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量 細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位 流式細胞儀的

2、原理液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。光學系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號電子系統(tǒng)：熒光信號和散射光信號經(jīng)二極管和PMT接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，以圖形的形式呈現(xiàn)給操作者散射光信號FALS SensorLaser散射光信號Right Angle Light Detector Cell ComplexityS

3、SCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytes流式細胞儀的檢測信號熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號雙色直接染色數(shù)據(jù)存儲FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：將

4、每個細胞的每個檢測參量依次排列順序存儲FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點圖（Dot Plot）等高線圖（Contour Plot）密度圖（Density）三維圖（3D Plot）等單參數(shù)直方圖分析數(shù)據(jù)分析直方圖分析多參數(shù)散點圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析數(shù)據(jù)分析三維圖分析流式細胞儀的應用流式細胞儀的臨床應用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)淋巴細胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關疾病流式細胞儀的科研應用免疫功能研究血小板分析（心腦血管疾?。┘毎芷?/p>

5、和倍體分析細胞凋亡干細胞研究樹突細胞研究腫瘤相關基因表達的研究抗腫瘤藥物作用機制以及多藥耐藥性的研究放療/化療療效的研究淋巴細胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標記的特異單克隆抗體，進行多色染色，同時分析淋巴細胞膜上多種白細胞分化抗原（CD分子）的表達，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分開，進行定性分析各淋巴細胞亞群的百分含量淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)，進行定量分析淋巴細胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（CD19+），與體液免疫有關T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫有關總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能， 能夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感

6、染細胞的細胞毒性作用。淋巴細胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達，T淋巴細胞又分為T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+）T抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評價那些自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)診斷原發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ缦忍煨詿o r 球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS）造血干細胞移植后免疫重建（6個月NK；9個月T、B）Th/Ts：機體免疫功能亢進：自身免疫性疾病，如SLE、類風濕性關節(jié)炎等（治療有效恢復正常）Th/Ts：機體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動性肝炎和活動性肝硬化、再障、結核、腫瘤等移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前

7、1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，1.2預示急排；Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2應停用免疫抑制劑；實體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴T 、Th/Ts，放/化療有效可恢復；淋巴細胞免疫表型正常或治療后能恢復正常者預后常較好；探索疾病發(fā)病機理、進程和預后（炎癥、腫瘤）臨床意義判斷病人的機體免疫狀態(tài)常見疾病的T 淋巴細胞的變化： CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類風濕性關節(jié)炎 （活動期） 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 - 或 （活動期） 多發(fā)性硬化癥 重癥肌無力 膜型腎小球腎炎 胰島素依賴性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性貧血 上呼吸道感染 常見疾病的T 淋巴細胞的變化 CD

8、3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤 再障及粒細胞減少癥 巨細胞病毒感染 血小板減少 活動性特應性皮炎 過敏性皮炎 淋巴細胞亞群雙色分析12%76%49%26%11%AIDS 病人T亞群分析27-51%15-44%50-84%先天性無 r 球蛋白血癥5-18%乳腺癌患者T淋巴細胞亞群變化TriTEST/MultiTest與T淋巴細胞絕對計數(shù)使用三色試劑或四色免洗試劑樣本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，減少細胞丟失絕對計數(shù)TruCOUNT管預先加有已知數(shù)量微球，在流式細胞儀上直接得到T淋巴細胞亞群的絕對含量，提高工作效率和計數(shù)的精確度單平臺計數(shù)報告T淋巴細胞及TH、T

9、S百分含量、絕對含量和H/S比值TriTEST CD4/CD8/CD3分析與T淋巴細胞絕對計數(shù)%T LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs CntT H/S RatioMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19淋巴細胞活化功能研究T淋巴細胞活化細胞數(shù)目增殖細胞表面表達活化標記分泌細胞因子CFSE示蹤原理羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細胞膜的熒光染料，CFSE進入細胞后可以不可逆地與

10、細胞內(nèi)的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分裂時，CFsE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。 體內(nèi)、體外實驗均可以應用Dilution of CFSE with cell divisionLyons and Parish, 1994JIM, 171;131Divisions:3 2 1 0CFSEFL-1 (Log)Divisions: 3 2 1 0葡萄球菌腸毒素刺激牛時間變化示意圖，T淋巴細胞活化細胞數(shù)目增殖細胞表面表達活化標記分泌細胞

11、因子T細胞激活抗原表達的動力學曲線FastImmune Assay System快速全面檢測淋巴細胞功能 BD FastImmune Activation System快速免疫活化檢測系統(tǒng)lymphocyte Activation 4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus優(yōu)點快速全程單核細胞成熟粒細胞原幼細胞，在紅細胞中不表達；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應細胞的顆粒度（成熟粒細胞單核細胞原幼細胞淋巴細胞）。目前，國際上采用CD45SSC設門（Gating），可非常輕松地將白血病細胞與正常細胞分開，增加白血病免疫分型的準確性CD45

12、的臨床應用用CD45-SSC設門尋找異常細胞，將細胞分為5個群體，當幼稚細胞達70-80%時，即可大致估計AL的類型。骨髓成分復雜，各種大小和分化程度的細胞均有，若不用CD45-SSC設門，我們檢測到的陽性細胞的百分率是以總細胞為分母來計算，當時以陽性細胞大于20%為界線，現(xiàn)在以CD45-SSC設門，排除了正常細胞的干擾，陽性細胞的百分率是以幼稚細胞為分母，因此再以陽性細胞20%作界線則不太合適了，所以，用CD45-SSC設門尋找異常細胞時，以定性比定量更重要。正常人血液白細胞免疫表型散點圖正常人血液細胞免疫表型T淋巴細胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+

13、，部分細胞CD（16+56）+，無CD4+CD8+雙陽性細胞B淋巴細胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK細胞：CD45+ 、CD（16+56）+/CD3-單核細胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒細胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達更高嗜酸性粒細胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達更高正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖正常人骨髓細胞免疫表型淋巴細胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/

14、CD7+（T淋巴細胞）；CD10-/CD19（B淋巴細胞）單核細胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系細胞:原粒細胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒細胞及其以下各階段中性粒細胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，與原粒細胞或更幼稚細胞的表型有明顯差異巨核細胞：CD45+、CD41+/CD61+幼紅細胞：CD45-、CD36+/GlyA+T-ALL免疫表型B-ALL免疫表型 HLA-DR CD19 CD1

15、0 CD20 CD22 CD79a 其它 早期前B-ALL + + - - C+/M- + 34/38+ 普通型ALL + + + - C-/M + 34/38 前B-ALL + + + + B-ALL + + - + + + Kappa+/ Lambda+ *CD10+的ALL療效好，有CD34+病人往往合并t(9,22),需強化治療 成熟AML免疫表型急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）骨髓細胞免疫分型散點圖急性早幼粒細胞白血病（AML-M3）骨髓細胞免疫分型散點圖FCM在臨床血液學中的應用能正確區(qū)別AML和ALL，并能進一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M

16、6、M7診斷雙系或雙表型白血病發(fā)現(xiàn)僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病診斷少見疑難白血?。ㄈ鏗CL）免疫分型 對下列情況具有重要意義 用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。形態(tài)學為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記?；旌闲园籽?。部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒-單核細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細胞白血病。微小殘留白血病。陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細胞膜的獲得性缺陷，對激活補體異常敏感的一種慢性血管內(nèi)溶血患者體內(nèi)紅細胞呈不均一性利用流式細胞術和CD55和CD59單克隆抗體，對PNH患者紅

17、細胞、粒細胞和血小板進行分析，證實存在膜蛋白表達缺陷的血細胞，并計算缺陷細胞在全血中所占比例陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH正常人紅細胞、粒細胞和血小板CD59表達完全陽性PNH患者血細胞分為三型：型：CD59表達完全陽性，熒光強度與正常人陽性峰熒光強度接近型：CD59表達部分陽性，熒光強度介于型與型之間 型：CD59表達完全陰性分析PNH患者各型細胞所占百分比，評估疾病的嚴重程度紅細胞 PNH分析 A 正常人B D 病人網(wǎng)織紅細胞計數(shù)Retic-COUNT操作快速、簡便計數(shù)精確低水平網(wǎng)織紅細胞檢測網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)IRF臨床應用：預測骨髓移植效果判斷貧血發(fā)病原因評價生物制劑的療效網(wǎng)織血小板的檢測人們最

18、先于1969年指出網(wǎng)織血小板是一類能被新亞甲藍深染的血小板。如網(wǎng)織紅細胞一樣它們是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織血小板為骨髓新釋放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中網(wǎng)織血小板的多少，可以間接反映骨髓巨核系造血的活躍程度。并能用常規(guī)的檢測網(wǎng)織紅細胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式細胞儀上方便、準確地檢測。臨床應用正常人網(wǎng)織紅細胞1.07% 缺鐵性貧血（IDA )4.78%臨床應用再障（AA)0.03% 溶血性貧血（HA)29.33%造血干細胞計數(shù)造血干細胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細胞。造血干細胞的特征是：大?。‵SC）和顆粒度（SSC）介于成熟

19、淋巴細胞、大淋巴細胞相似細胞內(nèi)含有較多核酸物質(zhì) CD34表達弱陽性或強陽性 CD45表達弱陽性在干細胞移植時需要做造血干細胞絕對計數(shù)造血干細胞計數(shù)干細胞移植應用血液系統(tǒng)病癥: L&L , 再生障礙想貧血惡性腫瘤:乳腺癌、兒童神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌遺傳性異常病變免疫缺陷:血紅蛋白病血小板檢測血小板膜糖蛋白復合物診斷血小板缺陷性疾病CD41-CD61復合物：血小板無力癥CD42a-CD42b 復合物：巨大血小板癥血小板活化的相關檢查血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病血小板自身抗體檢測網(wǎng)織血小板的檢測血小板脫落微粒的檢測血小板活化IIb/III

20、a復合物（CD41/CD61）在所有靜止和活化的血小板上都有表達血小板活化時發(fā)生的改變IIb/IIIa復合物發(fā)生變構，表達PAC-1血小板內(nèi)顆粒釋放，分泌促進凝血反應的物質(zhì)，這時表達CD62PCD61圈血小板門PAC-1/1：陰性對照，靜止的血小板PAC-1/CD62P：試驗管，ADP刺激下活化的血小板，報告血小板活化百分含量血小板活化血小板活化直接測量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應性可直接測定凝血酶等誘導劑活化的血小板血小板活化與臨床的關系：監(jiān)測血小板活化相關疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預測血栓形成心肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關預測冠狀動脈成形術后發(fā)生急性缺血事件的危

21、險性缺血性腦血管病與血小板活化有關子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治療療效監(jiān)測腦栓塞病人血小板活化檢測A CD61-SSC設分析門B 陰性對照C 治療前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12% 血小板無力癥（CD41缺陷，PAC-I下調(diào)）巨血小板癥藍陰性對照綠正常人紅病人CD41表達上調(diào)CD42a/CD42b缺失血小板自身抗體 ITP病人DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4NDNA細胞周期分析參數(shù)DNA倍體性Plo

22、idy 細胞內(nèi)染色體DNA含量二倍體Diploid 正常體細胞內(nèi)染色體DNA含量DNA指數(shù)（DI） 測定標本的G0/G1期細胞DNA含量 與同種系正常細胞的G0/G1期細胞 DNA含量的比值，表示細胞倍體性S期含量SPF S期細胞占總周期細胞的比例增殖指數(shù)PI 增殖細胞占總周期細胞的比例CV G0/G1期細胞DNA含量變異系數(shù)DNA分析的臨床意義DNA分析診斷腫瘤DNA非整倍體細胞峰或突出的四倍體細胞峰S期細胞含量10-15% DNA倍體分析：結合臨床病理的形態(tài)學診斷，對一些惡性腫瘤進行早期診斷，跟蹤隨訪和早期治療，提高治愈率和生存率。尤其對一些細胞抽吸物、體液、組織液、灌洗液脫落細胞的分析，

23、意義尤為重要。研究各期細胞比率與腫瘤組織分級的關系。提示腫瘤患者預后。增殖狀態(tài)分析：反映了腫瘤的生長速度和侵襲性，判斷臨床治療方法的療效或用于探討新藥新方法的作用機理和療效。FCM在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要標志在淋巴瘤（L&L）病理形態(tài)學不能做出診斷前可提供確切診斷信息DNA非整倍體的交界瘤應按惡性對待形態(tài)學表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標FCM參數(shù)的預后意義DNA及倍體分析在某些腫瘤有預后價值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、皮膚黑色素瘤S期比率與腫瘤組織學分級密切相關：

24、肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腦型星形細胞瘤細胞凋亡PI分析PI - Fluorescence# Events凋亡細胞正常G0/G1期細胞正常DNA倍體分析0 200 400 600 8001000PI Fluorescence2N4N1280 200 400 600 8001000PI FluorescenceAneuploid peakDNA index 1.21DNA異倍體129秋水仙素處理羅田甜柿獲得12 倍體再生植株正常人骨髓細胞DNA周期分析（ModFIT）腫瘤細胞SPF(S期含量)腫瘤細胞(單克隆)(14.18%)正常骨髓細胞(2.93%)腫瘤細

25、胞(多克隆)(28.52%)132乳腺癌及乳腺良性病變的流式檢測對比分析細胞凋亡細胞凋亡的分析細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學檢查DNA Ladders實驗流式細胞儀檢查與凋亡相關的病理過程（HIV、自身免疫性疾病、腫瘤）研究凋亡調(diào)控因素如癌基因、細胞因子及藥物等對凋亡的影響凋亡檢測-每一步都有檢測試劑盒細胞凋亡檢測凋亡相關細胞膜變化的檢測凋亡相關線粒體變化的檢測凋亡相關酶活性的檢測凋亡相關DNA片段的檢測凋亡相關基因蛋白的檢測細胞膜變化的檢測早期凋亡磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，DNA不斷裂線粒體膜電位變化的檢測細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測細胞膜變化的檢測磷脂酰絲氨

26、酸（PS）的檢測早期凋亡早期凋亡PS檢測及結果判斷早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是細胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒有發(fā)生斷裂 結果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+正常的活細胞： AnnexinV-/PI-ANNEXIN-V/PI檢測ANNEXIN-V/PI檢測control處理16h后處理24h后142線粒體水平檢測相關產(chǎn)品線粒體膜電位的檢測BD Mitoscreen（JC-1）Cat# 551302 25tests原理：熒光染料JC-1在活細胞中以聚體形式存在于線粒體基質(zhì)上產(chǎn)生紅色熒光，在凋亡細胞中，以單體形式存在不與線粒

27、體結合而產(chǎn)生綠色熒光。操作簡單，試劑直接加入細胞中，20分鐘后檢測JC-1 檢測結果流式圖凋亡相關酶活性的檢測背景知識細胞凋亡過程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是參與DNA維護和調(diào)控細胞的組分裂解 Caspase 3激活=細胞凋亡檢測原理：是通過特異性抗體檢測全長或者剪切后的caspase活性。CBA分析凋亡信號通路 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDETECTORANTIBODYLYSATE ORSUPERNATANTBEADSYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY

28、YYYYYYYYYYYYYYYYWashRead on Flow CytometerActive Caspase-3Bcl-2Cleaved PARP一系列熒光強度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與待測樣本和檢測抗體孵育后，形成“三明治”復合物Active Caspase-3Bcl-2Cleaved PARPBcl-2、Caspase-3、PARP構成的凋亡調(diào)控通道主要蛋白，對于凋亡研究具有特殊的意義(CBA Human apoptosis kit 557816)流式檢測活性Caspase-3相關產(chǎn)品：Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破

29、膜液，洗滌液和PE標記抗體； 特點：細胞需要固定破膜，然后才能染色化療前后胃癌活檢標本中Caspase-3+細胞化療前(3.49%)化療后(94.86%)149DNA水平的凋亡檢測-晚期檢測凋亡晚期DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段檢測方法Tunel流式法，通過在核酸片段末端標記，跟傳統(tǒng)相比優(yōu)點在于可以計算凋亡百分比DNA Ladder分析，但凋亡細胞太少時作不到TUNEL簡介通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通過熒光檢測定量分析結果。TUNEL（Terminal deoxynucleoti

30、dyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）DNA斷裂點檢測152TUNEL法流式分析凋亡結果BrdU-FITC/PI檢測S期154凋亡檢測總結檢測水平 細胞 核酸 細胞膜 胞內(nèi)通路 線粒體 檢測方法 免疫熒光 TUNEL法 Annexin V/PI Caspase通路 線粒體染料 微生物 微生物細菌的計數(shù)檢測與鑒定（CBA)血清血診斷(CBA)抗生素敏感性實驗細胞活力檢測（細菌活力）圖 流式細胞術分析GFP轉(zhuǎn)染效率和表達量調(diào)節(jié)性T細胞研究進展免疫耐受機制以往研究認為：（“被動”方式）胸腺細胞及前B（pre-B）細胞在中樞免疫器官中的克隆清除

31、 進入外周的成熟淋巴細胞表達針對自身抗原的識別受體被誘導進入免疫無能狀態(tài)而不表現(xiàn)任何自身反應性 部分淋巴細胞對自身抗原的免疫忽視 免疫耐受機制近年研究表明 ： （“主動”方式）調(diào)節(jié)性T（Tr）細胞以“主動”的方式維持自身免疫耐受 這一發(fā)現(xiàn)將改變我們對自身免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)機制的認識，并將對免疫學基本理論的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。 調(diào)節(jié)性T細胞的特異性標志 FOXP3（Forkhead box protein P3）是一個50kD的轉(zhuǎn)錄因子，也稱為Scurfin、JM2、IPEX。它是一個主要調(diào)節(jié)基因 。CD4+/CD25-細胞上FOXP3的轉(zhuǎn)錄表達可以誘導GITR、CD103和CTLA4的表達，并且

32、促使調(diào)節(jié)性T細胞表型形成。 FOXP3在X連鎖自身免疫過敏失調(diào)綜合征（XLAAD或IPEX）患者中發(fā)生突變。 FOXP3過度表達會引起機體的免疫應答下降，表明它是一個調(diào)節(jié)T細胞活性的主要轉(zhuǎn)錄因子。FOXP3表達于細胞內(nèi) 調(diào)節(jié)性T細胞分類根據(jù)來源、特異性及效應機制可分為天然調(diào)節(jié)性T細胞和獲得性調(diào)節(jié)性T細胞天然性調(diào)節(jié)性T細胞：在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細胞中約有510的細胞持續(xù)高表達CD25分子，該群細胞從胸腺中發(fā)育，組成性表達foxp3，在體內(nèi)外發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能獲得性調(diào)節(jié)性T細胞：是由外周T細胞在特定的條件下分化出來，通過分泌高水平的IL-10和 TGF-而發(fā)揮其抑制功能.Re

33、gulatory T Cells Background:its DevelopmentThymusPeripheryT cell precursorTr1Th3FoxP3-?iDC and/or in thePresence of IL-10And/or TGFbConventional T cellNave T cellNaturally occurring Treg cellAdaptive Treg cellCD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127CD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127FoxP3-人Tr細胞表達特征：CD127+CD127是非二聚體IL-7受體CD127表達于胸腺細胞，T、B祖細胞，成熟T細胞，單核細胞及其它淋巴細胞和骨髓細胞T細胞活化后CD127表達下調(diào)CD127表達下調(diào)發(fā)生在Tr細胞CD127下調(diào)同時CD25高表達、FoxP3+為Tr細胞CD127優(yōu)于傳統(tǒng)的FoxP3+保證了細胞的活性從Human PBMCs中分離Tr細胞FoxP3染色確認Tr細胞FoxP3染色確認Tr細胞小結CD127弱表達FoxP3+CD127loCD25hi-intCD127和FoxP3聯(lián)合應用于Tr細胞的功能性研究（體內(nèi)體外）樹突狀細胞（dendritic cell，DC）