凍干精制人白細(xì)胞干擾素制造及檢定規(guī)程

1、凍干精制人白細(xì)胞干擾素制造及檢定規(guī)程本品系用特定的誘生劑誘導(dǎo)健康人白細(xì)胞，經(jīng)提取后制成的凍干干擾素注射劑。用于某些病毒性疾病和腫HYPERLINK l m0-0 t _blank o 書(shū)籍相關(guān)：瘤 瘤的輔助治療，對(duì)免疫缺陷性疾病也有一定療效。1制造1.1制造要求1.1.1白細(xì)胞獻(xiàn)血員供血應(yīng)符合獻(xiàn)血員體檢及化驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。一次供血不超過(guò)400ml，供全血間隔在3個(gè)月以上。白細(xì)胞的分離，應(yīng)在采血后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到90%以上。1.1.2誘生病毒采用新城疫病毒（NDV）F株或仙臺(tái)病毒，經(jīng)檢定血凝效價(jià)達(dá)到適宜滴度，方可投產(chǎn)。1.1.3培養(yǎng)液采用RPMI-1640，內(nèi)含適量人血清和慶大霉素或卡那霉

2、素。不得使用椖邗防囁股亍部捎悶淥室伺嘌骸?/P1.1.4制造工作室的設(shè)置，應(yīng)符合工藝流程要求。冷庫(kù)及各種生產(chǎn)用具，必須專用，嚴(yán)禁與其他異種蛋白質(zhì)混用。制造工作室建筑應(yīng)便于清潔、消毒、防霉。在制造過(guò)程中，應(yīng)采取各種有效措施，防止細(xì)菌及熱原質(zhì)污染。直接接觸制品的用具，用后應(yīng)立即洗凈，用前應(yīng)除熱原質(zhì)及滅菌處理。1.1.5生產(chǎn)用水應(yīng)符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)，直接用于制品的水應(yīng)符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)。所用各種化學(xué)藥品應(yīng)符合中國(guó)生物制品主要原材料試行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，未納入試行標(biāo)準(zhǔn)者應(yīng)不低于分析純。1.2制造工藝1.2.1誘生病毒采用910日齡健康雞胚，于尿囊腔接種適量病毒，37培養(yǎng)4872小時(shí)，雞胚發(fā)育良好，病毒達(dá)到適宜滴度后

3、，收集尿囊液，并做無(wú)菌試驗(yàn)，合格后合并，抽樣做滴度測(cè)定，放?/FONT20待用。亦可用其他適宜方法制備誘生病毒。1.2.2白細(xì)胞懸液用離心法分離血漿，吸取白細(xì)胞層，用氯化銨液裂解紅細(xì)胞，或用其他適宜方法分離白細(xì)胞。然后用培養(yǎng)液稀釋，以每ml含活細(xì)胞1.0107為宜。1.2.3起動(dòng)與誘生白細(xì)胞懸液中加入少許白細(xì)胞干擾素，于37水浴攪拌培育2小時(shí)，加入適量誘生病毒，待干擾素效價(jià)達(dá)到最高峰時(shí)，收集上清，即為粗制干擾素，置?/FONT20保存。1.2.4純化在粗制干擾素（效價(jià)應(yīng)在1.0104IU以上）中加入硫氰酸鉀鹽析，然后分別在酸性和堿性條件下用乙醇分級(jí)沉淀，去除雜蛋白，再用硫氰酸鉀提純一次。亦可采

4、用經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)的其他適宜方法。1.2.5溶解、透析或超濾檢查硫氰酸鉀為陰性，除菌過(guò)濾后進(jìn)行半成品檢定。合格后方可分裝、凍干。1.2.6半成品檢定半成品應(yīng)做理化檢查和比活性測(cè)定，比活性應(yīng)1.0106IU/mg蛋白。加入人血白蛋白作保護(hù)劑后，應(yīng)做無(wú)菌試驗(yàn)、安全試驗(yàn)和熱原質(zhì)試驗(yàn)。試驗(yàn)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)同成品檢定。1.2.7凍干按人血白蛋白（低溫乙醇法）制造及檢定規(guī)程1.2.5項(xiàng)規(guī)定進(jìn)行凍干，但制品溫度不得超過(guò)35。2成品檢定2.1外觀本品應(yīng)為白色或淡黃色疏松體，加水溶解后，為無(wú)色或淡黃色澄清液體，不得有搖不散的顆粒。2.2化學(xué)檢定按生物制品化學(xué)檢定規(guī)程進(jìn)行。2.2.1水分測(cè)定水分含量應(yīng)3%（g/g）。2

5、.2.2pH值pH值應(yīng)為6.87.8。2.2.3硫氰酸鉀殘余量測(cè)定。取2滴干擾素原液加2滴9%三氯化鐵溶液，不呈現(xiàn)微紅色為合格。2.3無(wú)菌試驗(yàn)按生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。每批抽樣品不少于10支。2.4熱原質(zhì)試驗(yàn)按生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。每只家兔靜脈注射0.2ml（2105IU）。判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程4.1項(xiàng)要求進(jìn)行。2.5全試驗(yàn)2.5.1豚鼠試驗(yàn)用體重300400g豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注HYPERLINK t _blank o 中藥材：射干 射干擾素1ml（1.0106IU），觀察7天，動(dòng)特健存，每只體重增加者為合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠復(fù)試一次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。2.5.2小白鼠試驗(yàn)用

6、體重1820g小白鼠5只，每只腹腔注HYPERLINK t _blank o 中藥材：射干 射干擾素0.5ml（5105IU），半小時(shí)內(nèi)動(dòng)物不應(yīng)有明顯的異常反應(yīng)，繼續(xù)觀察7天，動(dòng)物均健存，每只體重增加者判為合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠復(fù)試一次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。2.6HBsAg檢測(cè)每安瓿凍干制品（1ml裝）加0.1ml滅菌注射用水溶解，用敏感性為1ng/ml以下的試劑盒測(cè)定，應(yīng)為陰性。2.7效價(jià)測(cè)定按附錄方法測(cè)定，應(yīng)為標(biāo)示量的80%150%。2.8殘余牛血清蛋白含量測(cè)定如采用組織培養(yǎng)法制備誘生病毒，則成品中殘余牛血清蛋白含量應(yīng)50ng/支。3規(guī)格1.0106IU/支4保存與效期應(yīng)保存于1

7、0以下。有效期自品效價(jià)檢定合格之日起為1.5年。附錄干擾素效價(jià)測(cè)定采用CPE（細(xì)胞致病效應(yīng)）抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測(cè)定法，以每ml干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞（50）免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)定為干擾素單位。以國(guó)際單位（IU）表示，并用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校正結(jié)果。1細(xì)胞培養(yǎng)將新鮮傳代2448小時(shí)的Wish細(xì)胞（人羊膜細(xì)胞）以約35萬(wàn)/ml的濃度另入96孔組織培養(yǎng)板上，每孔100l，置375%CO2孵箱中培養(yǎng)46小時(shí)。2樣品稀釋與細(xì)胞混合干擾素檢品做4倍系列稀釋，每份檢品做6個(gè)稀釋度（如100萬(wàn)單位，則測(cè)4-124-7）每個(gè)稀釋度加2孔，與培養(yǎng)板中的細(xì)胞等量混合，置375%CO25%CO2孵箱培

8、養(yǎng)1824小時(shí)。3加病毒倒掉培養(yǎng)板中的上清液，以100CCID50/ml的濃度加入VSV（水泡性口腔炎病毒），每孔100l，375%CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)左右。4觀察結(jié)果顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，若病毒對(duì)照各孔細(xì)胞出現(xiàn)75%1000%的明顯病變和死亡（變圓、死亡、脫落（，而細(xì)胞對(duì)照組中的細(xì)胞仍生長(zhǎng)良好（病變=0），則表明對(duì)照系統(tǒng)合格，結(jié)果成立。5計(jì)算通?？砂碦eed?/FONTMuench法計(jì)算，其步驟如下：（1）計(jì)算保護(hù)百分比稀釋度病變平均值（每孔）正常平均值（每孔）累積數(shù)比例百分比（%）病變正常正常/病變+正常4-10401313/131004-203099/91004-312155/6834-422322/5404-540704-640110（2）求出干擾素單位距離比=（高于50%的百