酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）在抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用(-47)

1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法ELISA)在抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用 藥物殘留快速檢測(cè)試劑盒 實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法ELISA簡(jiǎn)介1.1、根本概念：抗原、抗體、抗原抗體的特性1.2、ELISA方法簡(jiǎn)介：1.3、ELISA方法的原理1.4、ELISA方法的分類(lèi)2、ELISA試劑的組成2.1、 ELISA試劑盒的組成、已包被抗原或抗體的固相載體免疫吸附劑，俗稱(chēng)酶標(biāo)板；、酶標(biāo)記的抗原或抗體酶標(biāo)記物；、酶的底物；、參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定；、酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；、洗滌液；、酶反響終止液。 2.2、各ELISA組成試劑的作用、固相載體、免疫吸附劑、酶標(biāo)記物、酶的底物、洗滌液、反響終止液、參考標(biāo)準(zhǔn)品 3、EL

2、ISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程3.1 、試劑的準(zhǔn)備3.2 、加樣3.3 、保溫3.4、 洗滌3.5 、顯色和比色4、ELISA試驗(yàn)的質(zhì)量控制4.1、分析前質(zhì)控、人員培訓(xùn)、儀器質(zhì)控、標(biāo)本采集及處理過(guò)程的質(zhì)控4.2、分析中質(zhì)控4.3、幾種常用的質(zhì)控方法、灰區(qū)概念、外添加回收率試驗(yàn)方法、確證陽(yáng)性樣品質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng)的方法 ：發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查 5、膠體金試紙5.1、免疫層析法簡(jiǎn)介及特點(diǎn)5.2、免疫層析法的結(jié)構(gòu)及原理二、培訓(xùn)內(nèi)容操作局部6、操作過(guò)程演示7、計(jì)算軟件應(yīng)用說(shuō)明1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法ELISA簡(jiǎn)介1.1、根本概念：抗原：抗原是指進(jìn)入人或動(dòng)物機(jī)體后，可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，從而引起動(dòng)物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋

3、巴細(xì)胞，并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反響的物質(zhì)?？贵w：是由抗原刺沖動(dòng)物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。抗原抗體的根本特性：a、反響的特異性；b、反響的等比例性1.2、ELISA方法簡(jiǎn)介：ELISA屬于標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，由于其操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行并可以定量，從而使其在食品平安和衛(wèi)生檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。目前市場(chǎng)上有多種基于ELISA方法開(kāi)發(fā)的用于食品中抗生素檢測(cè)的試劑盒產(chǎn)品。 返回1.3、ELISA方法的原理基于抗原抗體反響的特異性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板又稱(chēng)酶標(biāo)板為載體，在適當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下使抗原

4、或抗體包被吸附在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上成為所謂的包被固相抗體或抗原，沒(méi)有被吸附游離的抗原或抗體通過(guò)洗滌除去，然后直接參加酶標(biāo)記抗體或抗原或先參加適當(dāng)?shù)目贵w或抗原與包被抗原或抗體反響后，再參加相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體或抗原，形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)記物洗滌去除，參加底物溶液于微孔中，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化或復(fù)原成為有色的底物。在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反響的抗原和抗體的量。這就是ELISA的原理。 返回1.4、ELISA方法的分類(lèi)ELISA可以分為直接法、間接

5、法和夾心法等幾種。直接法：直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，參加酶反響底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見(jiàn)圖2-17a間接法：是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體一抗和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反響產(chǎn)物的顏色可以間接反響一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量。見(jiàn)圖2-17b夾心法：是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反響形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以象間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物

6、，見(jiàn)圖2-17C。前者稱(chēng)為直接夾心法，后者稱(chēng)為間接夾心法。 返回ELISA原理及分類(lèi)圖2-17上述三種方法又可以分為競(jìng)爭(zhēng)法和非競(jìng)爭(zhēng)法。由于我公司的試劑盒產(chǎn)品絕大局部屬于直接法中的競(jìng)爭(zhēng)法。下面對(duì)直接法中的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法作重點(diǎn)說(shuō)明。在進(jìn)行測(cè)定時(shí)首先將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中參加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物；在測(cè)定孔中同時(shí)參加酶標(biāo)記物和非酶標(biāo)抗原通常來(lái)自于待測(cè)樣品，酶標(biāo)記物和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，經(jīng)過(guò)溫浴后，沒(méi)有結(jié)合到包被抗體上的酶標(biāo)記物和樣品經(jīng)過(guò)洗滌去除。拍干后參加底物溶液，經(jīng)溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。其反響原理如圖2-18 返回競(jìng)爭(zhēng)法EL

7、ISA原理圖2-18如下圖.在進(jìn)行測(cè)定時(shí)首先將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中參加濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物；在測(cè)定孔中同時(shí)參加酶標(biāo)記物和待檢樣本抗原，酶標(biāo)記物和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)記物通過(guò)洗滌去除，參加底物溶液于微孔中，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化復(fù)原成為有色的產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)記物結(jié)合參加底物后呈色較深，當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原和酶標(biāo)記物共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，酶標(biāo)抗原的比例越高，結(jié)合在固相抗體上的酶標(biāo)抗原就越多，酶標(biāo)抗原的比例越低，結(jié)合在固相上的抗體就

8、越少，而在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反響的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。這就是競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的原理。測(cè)定孔EEEEE酶標(biāo)記物底物溶液對(duì)照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標(biāo)記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA原理簡(jiǎn)述 如下圖.在進(jìn)行測(cè)定時(shí)首先將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中參加濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物；在測(cè)定孔中同時(shí)參加酶標(biāo)記物和待檢樣本抗原，酶標(biāo)記物和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物固定

9、在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)記物通過(guò)洗滌去除，參加底物溶液于微孔中，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化復(fù)原成為有色的產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)記物結(jié)合參加底物后呈色較深，當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原和酶標(biāo)記物共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，酶標(biāo)抗原的比例越高，結(jié)合在固相抗體上的酶標(biāo)抗原就越多，酶標(biāo)抗原的比例越低，結(jié)合在固相上的抗體就越少，而在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量也反映了固定化的抗原抗體復(fù)合物的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反響的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。這就是競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的原理。樣本濃度的計(jì)算所獲得的

10、每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值B 除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)O 標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值B 。再乘以100 % ，即百分吸光度值。百分吸光度值% ) = ( B / BO ) / 100 % 公式中B 為樣本溶液的平均吸光度值，B0為0PPb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以克倫特羅濃度的半對(duì)數(shù)值為x 軸，百分吸光度值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖一相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中殘留的克倫特羅的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，在實(shí)際的計(jì)算中只需用酶標(biāo)測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值，其他過(guò)程可通過(guò)專(zhuān)用的計(jì)算軟件完成。 返回2、ELISA試劑的組成2.1、完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含以下各組分：1已包被抗原或抗體的固相載體免疫吸附劑，

11、俗稱(chēng)酶標(biāo)板；2酶標(biāo)記的抗原或抗體酶標(biāo)記物；3酶的底物；4系列參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定；5酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；6洗滌液；7反響終止液。 返回 2.2、ELISA試劑的作用、固相載體：固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反響。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱(chēng)為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為812的96孔式。2.2、免疫吸附劑：已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。 返回2.3、酶標(biāo)記物：即酶標(biāo)記的抗原或抗體，是ELISA中最關(guān)鍵

12、的試劑。良好的酶標(biāo)記物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。酶標(biāo)記物中酶與抗體或抗原之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在酶?biāo)記物中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的未結(jié)合的酶或游離的抗體或抗原。此外酶標(biāo)記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 返回2.4、酶的底物、HRP的底物HRP催化過(guò)氧化物的氧化反響，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反響式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般

13、為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反響后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方

14、便。過(guò)氧化氫那么配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中那么直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需參加OPD后即可作為底物應(yīng)用液。TMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視比照鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反響用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-N

15、PP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反響后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。 AP也有發(fā)熒光底物磷酸4-甲基傘酮，可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 返回2.5、洗滌液洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高

16、于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。 返回2.6酶反響終止液常用的HRP反響終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。2.7參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。 返回3、ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程3.1 試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用蒸餾水或去離子水，。自配的緩沖液的PH應(yīng)用pH計(jì)進(jìn)行較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的局部應(yīng)及

17、時(shí)放回冰箱保存。 返回3.2 加樣在ELISA實(shí)驗(yàn)中一般有5次加樣步聚，即加標(biāo)準(zhǔn)品、加樣本、加酶標(biāo)記物、加底物、加反響終止液。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)一般用微量加樣器，按規(guī)定的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。 返回3.3 保溫在ELISA中一般加標(biāo)本和加酶標(biāo)記物后會(huì)有一次抗原抗體反響?？乖贵w反響的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相外表上發(fā)生

18、。參加板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的時(shí)機(jī)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能到達(dá)反響的終點(diǎn)。在其后參加的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反響總是需要一定時(shí)間的溫育。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4冰箱溫度等。為了便于操作目前絕大局部的試劑盒均采用室溫進(jìn)行溫育反響，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。3.4 洗滌洗滌在ELISA過(guò)

19、程中雖不是一個(gè)反響步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以去除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反響過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過(guò)程如下： a.吸干或甩干孔內(nèi)反響液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍將洗滌液注滿(mǎn)板孔后，即甩去；c.浸泡，即將洗滌液

20、注滿(mǎn)板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次或按說(shuō)明規(guī)定。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。3.5 顯色和比色、 顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反響，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反響的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在定量測(cè)定中，參加底物后的反響溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。底物顯色一般在室外溫或37反響20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將到達(dá)顯色的頂峰，再延長(zhǎng)反響時(shí)間，可使本底值增高。底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反響應(yīng)避光進(jìn)

21、行，顯色反響結(jié)束時(shí)參加終止液終止反響。產(chǎn)物用各類(lèi)酸性終止液終止后會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)450nm測(cè)讀吸光值。3.5.2 比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度oplical density，OD，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度absorbence，A，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角，如TMB的吸收波長(zhǎng)為450nm，表示方法為A450nm或OD450nm。3.6.3 酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指專(zhuān)用于測(cè)讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，有特制的適用于板、珠和

22、小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供給酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說(shuō)，假設(shè)某孔測(cè)得的A值為1.083，那么該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.0830.011.0731.093，重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.0830.051.0781.088在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。酶標(biāo)儀的檢測(cè)范圍一般在0.0003.000之間，甚至更高。超出可測(cè)上限的A值常以*或over或其它符號(hào)表示。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在1530，使用前先預(yù)熱

23、儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，用單波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)讀。也可用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)讀，即每孔先后測(cè)讀兩次，第一次在最適波長(zhǎng)W1，第二次在不敏感波長(zhǎng)W2，兩次測(cè)定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如TMB用450nm為W1，625nm為W2，最終測(cè)得的A值為兩者之差W1-W2。雙波長(zhǎng)式測(cè)讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀使用說(shuō)明書(shū)。 返回4.ELISA試驗(yàn)的質(zhì)量控制4.1、分析前質(zhì)控、人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)人員操作的技巧及熟練程度直接影響到檢驗(yàn)結(jié)果，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過(guò)培訓(xùn)，熟練掌握相關(guān)的技術(shù)知識(shí)和操作要點(diǎn)：檢驗(yàn)工程的根本原理 ELIS

24、A原理；熟悉檢測(cè)技巧，了解實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及操作要點(diǎn)；熟悉檢測(cè)試劑性能包括試劑盒組成，包被片段及其組成；、儀器質(zhì)控 為使儀器保持最正確工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序SOP，所要控制的儀器包括移液器加樣槍?zhuān)∠錅叵?，洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。移液器：ELISA加樣量小5-100l，其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱(chēng)重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在2%以?xún)?nèi)；水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中或溫箱內(nèi)實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有1的誤差；洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過(guò)2ul ，人工扣板時(shí)，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標(biāo)儀

25、：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)局部，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。 、標(biāo)本采集及處理過(guò)程的質(zhì)控取樣：保證取樣有代表性，即要遵循一定的取樣方法又要保證一定的取樣比例如：隨機(jī)多點(diǎn)取樣、四分法等樣品選取過(guò)程中需要防止產(chǎn)生交叉污染。如：處理不同批次的樣品時(shí)應(yīng)更換使用的工器具或?qū)κ褂玫墓ぞ哌M(jìn)行徹底的清洗。4.2、分析中質(zhì)控ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)工程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。加樣加樣應(yīng)用微量移液器加樣槍)按規(guī)定的量參加微孔板的底部防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，

26、不可產(chǎn)生氣泡。加樣槍的槍頭不要觸及微孔的內(nèi)壁。每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一樣一吸頭，以免發(fā)生交叉污染。溫育大多數(shù)的試劑盒抗原抗體反響需要在室溫度下，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能到達(dá)反響的平衡點(diǎn)ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反響液溫度迅速到達(dá)平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。洗滌ELISA是靠洗滌來(lái)到達(dá)別離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時(shí)洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細(xì)菌中的酶干擾去除掉。手工洗滌一般采用浸泡方法：1甩去孔內(nèi)反響液； 2用洗滌液過(guò)洗一遍即注滿(mǎn)孔后即甩去； 3微孔重

27、新注滿(mǎn)洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動(dòng)； 4甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。 重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，防止堵孔。顯色HRP催化底物是一步呈色反響，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，一定要按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定的時(shí)間溫度一般為室溫C，15-20分鐘。到達(dá)規(guī)定的反響時(shí)間后需要立即終止。酶標(biāo)儀判讀結(jié)果顯色反響終止后應(yīng)立刻比色一般在30分鐘內(nèi)有效。 常見(jiàn)的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，

28、以后者最為常見(jiàn)，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。TMB終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為450nm， 參比波長(zhǎng)為630nm。使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反響板條上的劃痕手印的干擾。同時(shí)要注意反響孔底部應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否那么吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。 返回4.3、幾種常用的質(zhì)控方法、灰區(qū)概念 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽(yáng)性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測(cè)以確定其陰陽(yáng)性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)那么報(bào)告+陽(yáng)性?；覅^(qū)的設(shè)置方法為：C.O1CVCV為該試劑的批內(nèi)CV (一般為510%；、外添加回收率試驗(yàn)方法A、什么是外添加回收率外添加回收率

29、是指向陰性樣中參加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使之到達(dá)某一確定濃度稱(chēng)為加標(biāo)樣，然后將其與該陰性樣同時(shí)測(cè)定，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，以觀察參加的標(biāo)準(zhǔn)品的量能否認(rèn)量回收，以回收率表示。B、如何添加標(biāo)準(zhǔn)品原那么上我們建議使用較高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外添加，下面以我公司的試劑盒為例進(jìn)行說(shuō)明：假設(shè)使用4.05ppb標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，一般魚(yú)肉的檢測(cè)下限為0.1ppb，建議將魚(yú)肉添加到0.1ppb作為回收樣品進(jìn)行檢測(cè)。所以假設(shè)需要添加X(jué) ml 4.05ppb的標(biāo)準(zhǔn)品于1克魚(yú)肉中，得到0.1ppb的魚(yú)肉樣本。按公式(1)計(jì)算X值1+X0.1=4.05X (1)那么X即為所添加的4.05PPb標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。C、如何計(jì)算回收率添加前

30、的陰性魚(yú)肉設(shè)為樣品A，添加后的魚(yú)肉設(shè)為樣品B，將A和B同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果分別為CA、CB，按公式(2)進(jìn)行計(jì)算回收率回收率=CB CA/0.1100% (2)D、外添加回收率的意義。外添加回收率的意義在于，通過(guò)外添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，從而驗(yàn)證試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和有效性。、用確證樣品質(zhì)控選取與被測(cè)樣本性質(zhì)接近的經(jīng)過(guò)確證的樣本為質(zhì)控樣本，在每次進(jìn)行檢測(cè)時(shí)將該樣本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)判斷該樣品檢出值與確證值之間的變異度來(lái)判斷檢驗(yàn)結(jié)果的有效性。、室間質(zhì)評(píng)的方法 ：發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查 這是國(guó)內(nèi)外室間質(zhì)評(píng)的常用形式。有關(guān)管理部門(mén)或相關(guān)的行業(yè)檢驗(yàn)協(xié)會(huì)采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)至部管理中心。由管理中心進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將評(píng)價(jià)結(jié)果寄回各實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)評(píng)價(jià)，各實(shí)驗(yàn)室了解本室工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差距，并設(shè)法改進(jìn)，以不斷提高檢驗(yàn)質(zhì)量。 返回 5、膠體金