《致瀉性大腸桿菌檢驗》課件PPT

1、致瀉性大腸桿菌檢驗技術(shù)概 念 大腸桿菌的部分血清型可引起腸道感染，稱為致瀉性大腸桿菌致瀉性大腸桿菌按照毒力因子、致病機理和流行病學(xué)特征分為5類腸致病性大腸桿菌（EPEC）腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）腸出血性大腸桿菌（EHEC）腸聚集性粘附大腸桿菌（EAggEC）生物學(xué)性狀形態(tài)大腸桿菌是革蘭氏陰性短桿菌，大小為1.01.5m2.0 6.0m多有鞭毛，約為4 6根，為周毛菌。沒鞭毛的細菌也可使人或動物致病大腸桿菌具有菌毛，分為性菌毛、普通菌毛和與致病性有關(guān)的菌毛。與細菌致病性有關(guān)的菌毛有：K88、K99、987P、CFA、 F41 CFA等培養(yǎng)特性大腸桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂

2、上生長良好，最適生長溫度為37， 42 44 仍能生長。兼性厭氧菌，氧氣充足生長較好。最適生長pH為6.8 8.0，低于6.0或高于8.0生長緩慢。在普通培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑，呈灰色，在生理鹽水中容易分散。粗造型：菌落扁平，邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。粘液型：常為含有莢膜的菌株。生化特征-1分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖等多種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在腸道鑒別培養(yǎng)基上形成有色菌落。吲哚試驗、甲基紅試驗陽性；V-P試驗陰性；不能利用檸檬酸鹽作為碳源；分解葡萄糖銨鹽；不分解尿素；明膠液化陰性；不分解側(cè)金盞花醇；在氯化鉀培養(yǎng)基上不生長。生化特征

3、-2EIEC：不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)氣，除O124外無動力；乳糖、蔗糖不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S陰性，靛基質(zhì)陽性，酒石酸鹽陰性，賴氨酸脫羧酶陰性。O157：H7大腸桿菌不發(fā)酵山梨醇或遲緩發(fā)酵，在CT-SMAC平板上菌落為白色；絕大多數(shù)不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基傘形花內(nèi)酯-D葡萄糖酸苷，不能產(chǎn)生熒光；絕大多數(shù)EHEC發(fā)酵棉子糖、衛(wèi)矛醇，能夠利用鳥氨酸賴氨酸，其他大腸桿菌中20%左右發(fā)酵棉子糖，50%左右發(fā)酵衛(wèi)矛醇，有部分大腸桿菌不能利用鳥氨酸賴氨酸?？乖Y(jié)構(gòu) 大腸桿菌的表面抗原包括菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、莢膜抗原（K抗原）O抗原即細胞壁外膜上的脂多

4、糖（LPS），目前已發(fā)現(xiàn)O抗原有170多個血清型，H抗原有55種左右。最初分離的菌株動力往往較差，與H抗血清的反映凝集差，需在半固體培養(yǎng)基上傳代以利于鞭毛的生長。致病物質(zhì)與所致疾病在腸道內(nèi)一般不致病，但如果移位侵入腸道外的組織或器官可引起腸外感染，以化膿性炎癥最為多見。引起泌尿系統(tǒng)感染的大腸桿菌稱為泌尿道致病性大腸桿菌（UPEC），引起尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎。一些大腸桿菌還引起腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎、手術(shù)創(chuàng)口感染等。在嬰幼兒、老年人或免疫力極低的病人中可引起敗血癥。 腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ETEC是第三世界國家細菌性腹瀉和旅游者腹瀉的主要病原之一ETEC分泌耐熱腸毒素（ST）、不耐熱腸毒素（LT）

5、，具有與致病性相關(guān)的菌毛等。ETEC通過菌毛粘附在小腸上皮細胞，釋放毒素ST和LT，刺激腺苷環(huán)化酶或鳥苷環(huán)化酶的生產(chǎn)，引起腸液分泌和聚積，產(chǎn)生水樣腹瀉。 腸侵襲性大腸桿菌EIEC的毒力因子和致病機制志賀氏菌基本一致，臨床癥狀與細菌性痢疾不易區(qū)分，主要是發(fā)燒、腹部劇烈疼痛與不適、毒血癥、水樣腹瀉，糞便中有少量粘液和血。EIEC通常侵犯大腸，使大腸上皮細胞刷狀緣發(fā)生局部破壞，細菌被攝入細胞內(nèi)，侵犯并破壞細胞基底膜，在細胞內(nèi)擴散、繁殖，并在細胞間擴散，引起細胞的死亡，造成炎癥和潰瘍。EIEC的侵襲力由120140MD的大質(zhì)粒編碼，與編碼志賀氏菌侵襲力的大質(zhì)粒高度同源，丟失了質(zhì)粒的菌株也隨之喪失。 腸

6、致病性大腸桿菌EPEC是嬰幼兒腹瀉的主要病原菌，主要臨床癥狀是發(fā)燒、嘔吐、腹瀉，糞便中含有大量粘液而無血，癥狀可持續(xù)兩周以上，多引起社區(qū)的小型暴發(fā)。主要毒力因子包括5070KD大質(zhì)粒編碼的束狀菌毛介導(dǎo)的粘附作用、噬菌體編碼的志賀毒素及LEE毒力島介導(dǎo)的A/E損傷。 腸出血性大腸桿菌EHEC是指能引起出血性腸炎的一群大腸桿菌，包括、026:H11、0111:H8、O125：NM、 O122:H19等血清型的部分菌株。目前認為EHEC的主要毒力因子有志賀毒素、致病性大質(zhì)粒和LEE毒力島。腸聚集性粘附大腸桿菌（EAggEC）EAggEC主要與小兒頑固性腹瀉有關(guān) EAggEC產(chǎn)生束狀菌毛（AFF/ ）

7、和聚集性粘附大腸桿菌毒素（EAST ）AFF/ 和EAST 的基因位于60MD質(zhì)粒上樣品的采集與處理腸道外感染患者，應(yīng)根據(jù)感染情況采取中段尿、血液、膿液、腦脊液、膽汁等。食品樣品采集后應(yīng)盡快檢驗，易腐食品在檢驗之前應(yīng)予冷藏。糞便標本一般采集13ml水樣便或血樣便，成形便約25g左右或用棉拭子采樣，糞便標本應(yīng)盡快送檢，如運送時間超過2h，標本應(yīng)放在Cary-Blair運送培養(yǎng)基內(nèi)，4條件下送檢。EPEC：嬰幼兒水樣或蛋花樣便EIEC：細菌性痢疾樣便ETEC：霍亂樣水樣便EHEC：早期為水樣便，后為血便檢驗程序腸道增菌肉湯檢樣麥康凱371 18-24h乳糖發(fā)酵或不發(fā)酵的菌落3-5個、氧化酶，G桿菌

8、TSI、靛基質(zhì)、pH7.2尿素、KCN、賴氨酸、動力TSI底部+，H2S-，KCN-，尿素-如非左述的反應(yīng)結(jié)果血清學(xué)試驗進一步鑒定非大腸埃希氏菌報告直接分離培養(yǎng)新鮮糞便標本接種下列培養(yǎng)基麥康凱（Mac）或伊紅-美藍等弱選擇性鑒別培養(yǎng)基。山梨醇-麥康凱瓊脂或O157顯色培養(yǎng)基，腸出血性大腸桿菌及某些致病性大腸桿菌不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇，菌落為無色。血瓊脂平板，用于觀察腸致病性大腸桿菌的溶血及其他菌落的鑒別，37培養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果。增菌培養(yǎng) 對于懷疑腸出血性大腸桿菌O157:H7感染標本，應(yīng)無菌稱取25g食品或環(huán)境采集樣品，加入225ml mEC+n（m為modified“改良的”的縮寫，n

9、為novobiocin“新生霉素”的縮寫）肉湯中， 37增菌培養(yǎng)6h，免疫磁珠捕獲后轉(zhuǎn)種于改良的O157顯色培養(yǎng)基或CT-SMAC， 37培養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果。 注：C：頭孢克肟0.05mg/L T：亞碲酸鉀2.5mg/L n：新生霉素0.02g/L磁珠分離將Ep管按樣品和質(zhì)控菌株進行編號，每個樣品使用1只Ep管，然后插入到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每個Ep管的蓋子，每管加入20LE.coli O157免疫磁珠懸液。 注意：磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，避免產(chǎn)生泡沫。取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL，加入到Ep管中，蓋上

10、蓋子，然后輕微振蕩10s。每個樣品更換1只加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。注意: 取樣前混勻，避開脂肪層與雜質(zhì)，必要時使用濾網(wǎng)。 加樣后立即混勻。對照同時做。結(jié)合：在1830環(huán)境中，將上述Ep管連同磁板架放在適合的裝置上轉(zhuǎn)動或用手輕微轉(zhuǎn)動10min，使E.coli O157與免疫磁珠充分接觸。 注意：室內(nèi)溫度 ，保證結(jié)合時間。結(jié)合時不要將磁鐵插入到磁板架中。用手轉(zhuǎn)動時應(yīng)輕輕顛倒Ep管架，不可劇烈搖動。保證磁珠與O157的結(jié)合。 捕獲：將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中和蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時，在Eppendorff管壁中間明

11、顯可見的圓形或橢圓形棕色聚物。吸取上清液：取1支滅菌的加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側(cè)深入液面，輕輕吸走上清液。當吸到液面通過免疫磁珠積聚物時，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到Eppendorff管中，并重復(fù)2. 4步驟。每個樣品換用1支加長吸管。免疫磁珠的滑落：某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品，其磁珠積聚物易于滑落到管底。在吸取上清液時，很難做到不丟失磁珠，在這種情況下，可保留50100L上清液于Eppendorff管中。如果在后續(xù)的洗滌過程中也這樣做的話，脂肪的影響將減小，也可達到充分捕獲的目的。洗滌：從磁板架上移走磁板，在每個Eppendorff

12、中加入1mL PBS-Tween20洗液，轉(zhuǎn)動磁板架3次以上，洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟2.42.6。重復(fù)上述步驟2.42.5 注意: 洗滌共3次，動作要輕柔。 吸取上清液至磁珠聚集物處時，應(yīng)放慢速 度。上清液的吸取應(yīng)盡量完全。 使用多塊磁珠分離裝置時，磁鐵與磁鐵應(yīng) 遠離放置。免疫磁珠懸?。阂谱叽虐?，將免疫磁珠重新懸浮在100L PBS-Tween20洗液中。涂布平板 用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50L免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分

13、完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于361培養(yǎng)1824h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157顯色瓊脂平板表面水分過多時，應(yīng)在37下干燥1020min，涂布時避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。大腸桿菌在選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板菌落特征麥康凱瓊脂大腸桿菌發(fā)酵乳糖，在麥康凱瓊脂上呈桃紅色不透明菌落伊紅美藍瓊脂黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落O157顯色培養(yǎng)基腸出血性大腸桿菌O157：H7呈紫紅色或淺紫色菌落山梨醇麥康凱瓊脂腸出血性大腸桿菌O157：H7呈不發(fā)酵山梨醇的乳白色菌落或遲緩發(fā)酵山梨醇的紅色菌落大腸桿菌在MAC上生化反應(yīng)從鑒別平板上