微生物遺傳學(xué)復(fù)習(xí)考題

1、簡述題串聯(lián)親和純化方法 (Tandem affinity purification , TAP)串聯(lián)親和純化技術(shù)是一種能快速研究體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)，經(jīng)過兩步特異性親和純化可快速得到生理?xiàng)l件下與靶蛋白質(zhì)存在真實(shí)相互作用的蛋白質(zhì)。串聯(lián)親和純化技術(shù)特別適用于研究蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的相互作用。該技術(shù)通過在靶蛋白質(zhì)一端嵌入一個(gè)特殊的蛋白質(zhì)標(biāo)簽不破壞靶蛋白質(zhì)調(diào)控序列且靶蛋白質(zhì)表達(dá)量與體內(nèi)水平相當(dāng)經(jīng)過兩步連續(xù)的親和純化獲得接近自然條件的特定蛋白質(zhì)復(fù)合體后用質(zhì)譜技術(shù)或Edmn降解法進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。與傳統(tǒng)的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)相比，TAP技術(shù)具有周期短、假陽性結(jié)果少等優(yōu)點(diǎn)。顯性失活突變 (Domin

2、ant Negative Mutation) 即顯性負(fù)突變 只有單個(gè)基因拷貝即可導(dǎo)致野生型基因產(chǎn)物失去活性的突變體。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域中指本身失去轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)功能，而且同時(shí)能使野生型蛋白也失去活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變體?？蓪?dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路的組成性阻斷?；蚯贸蛔?(gene knockout)即用一個(gè)突變的基因去修飾其對(duì)應(yīng)的野生基因，以觀察中止原基因正常功能時(shí)的生物學(xué)變化?；蛑赣肈NA重組技術(shù)敲除宿主基因組中的某一靶基因。以小鼠為例，先將待敲除基因制成缺失突變而代之以一個(gè)選擇基因(如neo )，同時(shí)再接上另一個(gè)選擇基因(如tk)，然后將這一段已失去靶基因功能的DNA插入載體，轉(zhuǎn)入在體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干

3、細(xì)胞ES細(xì)胞。通過細(xì)胞內(nèi)同源重組將基因組中有功能的靶基因置換掉，也就是敲除了靶基因。只有同源重組的整合，才能把接在靶基因旁邊的選擇基因去掉;非同源重組則會(huì)把失去功能的靶基因序列連同兩個(gè)選擇基因一起整合在ES細(xì)胞基因組里。這樣，用選擇培養(yǎng)基就可選出敲除了靶基因的胚胎干細(xì)胞克隆。將這種胚胎干細(xì)胞注入小鼠早期胚胎。由于胚胎干細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，所以靶基因被敲除的干細(xì)胞是該基因的雜合體，即只有一個(gè)等位基因被敲除。功能互補(bǔ)(complementation)實(shí)驗(yàn)如果在某個(gè)敲除突變株細(xì)胞中導(dǎo)入一個(gè)外源基因后可以使得該敲除突變株恢復(fù)為野生型,則認(rèn)為導(dǎo)入的外源基因與敲除基因是功能互補(bǔ)的,這個(gè)方法可以預(yù)測外源蛋白的

4、生物學(xué)功能合成遺傳列陣分析(Synthetic genetic array, SGA)聯(lián)合致死/致病作用(synthetic lethal/sick interaction) 帶有兩種不同突變的細(xì)胞雜交,重組產(chǎn)生的后代不能存活或活力減弱的現(xiàn)象被稱為聯(lián)合致死/致病作用. 溫度敏感突變株 (temperature-sensitive mutant)在正常培養(yǎng)溫度下，菌體生長良好，當(dāng)溫度提高到一定程度時(shí)（如30提高到40），停止生長，而只產(chǎn)酸，具有這種特性的菌株就稱為溫度敏感型突變株酵母的生活周期 (life cycle of fission yeast)裂殖酵母的營養(yǎng)體主要以單倍體形式存在和生活；

5、以裂殖方式進(jìn)行無性繁殖。在特定條件下進(jìn)行有性生殖。生活周期受到營養(yǎng)條件的調(diào)控: 在營養(yǎng)豐富的條件下, 細(xì)胞生長和進(jìn)行有絲分裂。在營養(yǎng)缺乏的條件下，細(xì)胞終止在細(xì)胞周期中的G1期，進(jìn)行性別上分化，不同性別的單倍體細(xì)胞交配，形成二倍體的接合子, 經(jīng)減數(shù)分裂和萌發(fā), 形成四個(gè)孢子。最有效的引導(dǎo)有性繁殖的方法是氮饑餓。9. 非接合子型子囊 (Azygotic asci) asci are linear, and are produced by sporulation of a diploid strain. The ascus looks like a single cell. The spores l

6、ook more tightly packed. 子囊是線性的,是由一個(gè)二倍體孢子形成的。這個(gè)子囊看起來像一個(gè)單一的細(xì)胞。孢子很緊湊10. 什么是蛋白質(zhì)標(biāo)簽 (tag),用途是什么?是基因移植到一個(gè)重組蛋白。通常,這些標(biāo)簽是可移動(dòng)的化學(xué)制劑或酶的手段,如蛋白質(zhì)水解或蛋白拼接。標(biāo)簽是基于各種目的而附在蛋白質(zhì)上的用途:分離和純化蛋白(包括蛋白復(fù)合物)并鑒定與YFP結(jié)合的蛋白(TAP) 亞細(xì)胞定位（GFP)測定YFP的表達(dá)（FLAG, HA, Myc)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用（FLAG, HA, Myc) 11. 易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高鎂

7、離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴(kuò)增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。其關(guān)鍵在于對(duì)合適突變頻率的選擇，突變頻率太高會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯瑹o法篩選到有益突變;突變頻率太低則會(huì)導(dǎo)致文庫中全是野生型群體。理想的堿基置換率和易錯(cuò)的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。12. 無效突變(null mutation) 由于大片段插入、缺失或重排而導(dǎo)致基因產(chǎn)物完全無效13. 顯性負(fù)突變(dominant-negative mutation)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變后不僅自身無功能，還能抑制或

8、阻斷同一細(xì)胞內(nèi)的野生型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用。這種作用被稱為顯性負(fù)性作用。具有顯性負(fù)性作用的突變體被稱為顯性負(fù)性突變體14. 獨(dú)特的分子條碼(unique bar codes)15. 合成基因陣列(synthetic genetic array)16. 通過微陣列分析合成致死(synthetic lethality analyzed by microarray)微陣列(micmarray)包括cDNA微陣列(cDNA microarray)和DNA芯片(DNA chips)。它是近年來發(fā)展起來的可用于大規(guī)?？焖贆z測基因差別表達(dá)、基因組表達(dá)譜、DNA序列多態(tài)性、致病基因或疾病相關(guān)基因的一項(xiàng)新的基因功

9、能研究技術(shù)其基本原理是：將成千上萬條DNA片段、cDNA、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)或特異性的寡核甘酸片段1按橫行縱列有序地點(diǎn)樣在固相支持物上，固相支持物為硝酸纖維膜或尼龍膜時(shí)，稱為微陣列。把固相支持物改為指甲蓋大小的玻片或硅片時(shí)所形成的微陣列就稱為DNA芯片檢測時(shí)，首先以來自不同生理狀態(tài)和發(fā)育階段的mRNA為模板。以放射性同位素或熒光物標(biāo)記的dNTP為底物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA再用合成出的cDNA與微陣列或DNA芯片進(jìn)行雜交。然后通過計(jì)算機(jī)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀和處理，就可以知道芯片上的哪些基因在細(xì)胞里表達(dá)，哪些基因不表達(dá)；同樣也可以測知哪些基因的表達(dá)水平高，哪

10、些基因的表達(dá)水平低 二、比較題簡述正向遺傳學(xué)（forward genetics）和反向遺傳學(xué)（reverse genetics）的不同之處。正向遺傳學(xué)是指，通過生物個(gè)體或細(xì)胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個(gè)體或細(xì)胞中找到對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其功能。反向遺傳學(xué)的原理正好相反，人們首先是改變某個(gè)特定的基因或蛋白質(zhì)，然后再去尋找有關(guān)的表型變化。簡單地說，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化，反向遺傳學(xué)則是從基因變化研究表型變化。2. 簡述蛋白質(zhì)在遺傳上的相互作用（genetic interaction）和物理相互作用（physical interac

11、tion）的區(qū)別。 eq oac(,1)兩基因通過比較二者共同突變的表型，與二者單獨(dú)突變的表型。這種相關(guān)作用指重復(fù)的生物過程或并行途徑中的重復(fù)功能所需基因，不需要蛋白之間有直接的作用。蛋白遺傳相互作用指兩種基因同時(shí)存在成刪除后表型表現(xiàn)出來。 eq oac(,2)指當(dāng)兩種蛋白質(zhì)直接或間接接觸時(shí)他們之間的相互作用，當(dāng)兩種蛋白質(zhì)存在生理上的相互接觸時(shí)，蛋白質(zhì)間的相互作用，無論之間或間接的（如在同一蛋白質(zhì)復(fù)合體中）。3. 簡述合成或聯(lián)合致病作用（synthetic sick interaction）和致死作用（synthetic lethal interaction）的不同。 聯(lián)合致病作用和致死作用就

12、是帶有兩種不同突變的細(xì)胞雜交，重組產(chǎn)生的后代不能存活或獲利減弱的現(xiàn)象。最普遍的聯(lián)合作用是合成致死作用，在兩個(gè)基因中的任何一個(gè)突變單獨(dú)存在都不會(huì)致死，但是一個(gè)菌株中這兩個(gè)突變基因同時(shí)存在則會(huì)致死。4. 基因顯隱性分析(dominance/recessiveness) 和上位性分析(epistasis analysis)的不同顯隱性是用來描述等位基因之間的關(guān)系。如果野生型基因存在時(shí),突變型的表型不表達(dá)，則突變型相對(duì)于野生型是隱性的,反之是顯性的。 上位性是用來描述不同基因之間的相互作用。指一獨(dú)立基因能直接改變另一獨(dú)立基因的表形型(或指一獨(dú)立遺傳基因?qū)α硪华?dú)立基因的表現(xiàn)有遮蓋作用)。上位分析可以用于

13、建立基因功能的上下游順序關(guān)系。 顯隱性分析是通過構(gòu)建帶有野生型和突變型基因的雙倍體菌株來分析發(fā)生在同一基因突變的顯隱性。上位性分析是通過構(gòu)建帶有雙突變型基因的單倍體菌種來分析不同基因的遺傳相互作用。 5. 分析比較失去功能突變(loss-of-function mutation)與獲得功能突變(gain-of-function mutation)的異同 獲得功能突變：就是指基因突變后使蛋白獲得一種新的功能或使蛋白的某種功能得到了加強(qiáng)。其中一類是突變后的基因產(chǎn)物擁有一種新的分子功能或是有一套新的基因表達(dá)模式。獲得功能能突變總是顯性的。 失去功能突變：是指突變后使得蛋白功能減弱或完全消除的一種突變

14、。突變后的基因產(chǎn)物缺少野生型基因的分子功能。失去功能突變總是隱性的。6. 比較裂殖酵母和芽殖酵母的異同相同：裂殖酵母和芽殖酵母在3億年-4億年以前分化，都是酵母 不同： 芽殖酵母 裂殖酵母 測序 1997 2002基因組大小 （Mb) 12 13.8染色體數(shù)目 16 3基因/蛋白 6000/6217 4900/5002 基因大小 1.5, 1 exon 3Kb, 3 exon 含內(nèi)含子的基因數(shù) 5% 43營養(yǎng)細(xì)胞 雙倍體 單倍體 主要細(xì)胞周期時(shí)期 G1(70) G2(70)細(xì)胞周期緊密調(diào)控 G1-S G2-M裂殖酵母的細(xì)胞周期：細(xì)胞經(jīng)較長的伸長生長后進(jìn)入有絲分裂期芽殖酵母的細(xì)胞周期：細(xì)胞是從S

15、期直接進(jìn)入有絲分裂期7. 比較整合型質(zhì)粒與自主復(fù)制質(zhì)粒的異同由可選擇的酵母基 因插入大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和pBR322質(zhì)粒而構(gòu)成的.典型的YIp如CV9，其上含有克隆進(jìn)pBR322的酵母leu2基因，它可整合在受體細(xì)胞第染色體上的非功能性leu2基因中自主復(fù)制，指質(zhì)粒及其他染色體外DNA或RNA分子所進(jìn)行的不依賴于染色體DNA復(fù)制的復(fù)制。這些分子在一定條件下能夠控制自身合成的時(shí)間和頻率。自我復(fù)制，即染色體自我復(fù)制。在細(xì)胞分裂過程中，每一個(gè)染色體包括染色體上的染色粒和全部基因都要分裂為兩個(gè)。這樣，一個(gè)染色體便分為質(zhì)量上完全相同的兩個(gè)、點(diǎn)誘變(site-directed

16、 mutagenesis)與隨機(jī)誘變 (random mutagenesis)點(diǎn)誘變又稱位點(diǎn)專一誘變。一種將克隆的基因在體外作專一突變，然后再置換受體生物該基因拷貝的技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：獲得所需突變的幾率高，有時(shí)甚至可達(dá)活細(xì)胞的50%;整個(gè)生物體其他基因都是非突變的，故可保留全部所希望的特性。定點(diǎn)誘變的具體方法很多。隨機(jī)誘變，random mutagenesis，非定點(diǎn)地誘發(fā)基因產(chǎn)生突變。亞效等位基因突變(hypomorphic mutation)與超形態(tài)突變(hypermorphic mutation)超形態(tài)突變此種突變與次形態(tài)突變相反，會(huì)使基因的表現(xiàn)加強(qiáng)。單倍體與雙倍體單倍體即體細(xì)胞中含有與本物種

17、正常個(gè)體生殖細(xì)胞的染色體組數(shù)目相同的染色體組的生物。雙倍體生物就是由精卵發(fā)育成生物體的。基因內(nèi)互補(bǔ)(intragenic complementation)與基因間(intergenic complementation)基因內(nèi)互補(bǔ)：帶有處于反式(即相斥）狀態(tài)的兩個(gè)擬等位基因的個(gè)體呈現(xiàn)接近正常表型的現(xiàn)象。可能是由于兩個(gè)突變基因所產(chǎn)生的失活產(chǎn)物結(jié)合而成為具有活性的蛋白質(zhì)的結(jié)果。如果將兩個(gè)有關(guān)的同質(zhì)結(jié)合子的抽提物混合時(shí)可以看到互補(bǔ)現(xiàn)象，叫離體互補(bǔ)。等位基因間互補(bǔ)：指異源多具體蛋白質(zhì)由兩個(gè)不同突變等位基因編碼的亞單位間作用引起的性質(zhì)改變?；旌闲偷鞍踪|(zhì)可能比一種類型亞單位構(gòu)成的蛋白質(zhì)活性強(qiáng)或者弱三、思考題

18、1yfg（your favorite gene）的功能未知,需要該基因的功能. 如果知道yfg（your favorite gene）是必需基因，如何研究yfg的功能？請(qǐng)寫出具體方案.如果知道yfg（your favorite gene）是非必需基因，如何研究yfg的功能？請(qǐng)寫出具體方案.回復(fù)突變有哪幾種? 如果發(fā)現(xiàn)你構(gòu)建的溫度敏感突變株發(fā)生了回復(fù)突變,如何確定是那種回復(fù)突變? 如果是非等位基因抑制突變 (extragenic suppression), 如何克隆該抑制子(suppressor)Arevertant is a mutation that restores the phenotype to the wild type(most prevalent form).野生型基因經(jīng)過突變成為突變性基因的過程成為正向突變。正向突變的稀有性說明野生型基因是一個(gè)比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。預(yù)報(bào)基因又可以通過突變而成為野生型基因，這一過程成為回復(fù)突變。第一種：真正的回復(fù)突變突變(mutant)體經(jīng)過第二次突變又完全地或部分地恢復(fù)為原來的基因型和表型。完全恢復(fù)時(shí)由于突變的堿基順序經(jīng)第二次突變后又變?yōu)樵瓉淼膲A基順序