Western印跡雜交

1、Western Western是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定融為一體的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，又稱蛋白印跡或免疫印跡，是一種檢測(cè)固定在固相基質(zhì)上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)方法，是當(dāng)代分析和鑒定蛋白質(zhì)的最有效的技術(shù)之一。100102051002111基本原理在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異性抗體來(lái)檢測(cè)。 2基本步驟1.水溶液提取法 針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液 對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。2.有機(jī)溶劑提取法 對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品

2、制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量的差異 ，分子量小的蛋白質(zhì)比分子量大的走得快，從而在凝膠上形成一系列分子量大小不同的條帶，達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交4因?yàn)楣滔噍d體能以非共價(jià)鍵的形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性，所以可以把經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上。顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交5酶標(biāo)顯色蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉

3、雜交膜選擇的根據(jù)主要有：a. 膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力，（決定單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量)，以及膜的孔徑,（決定攔截蛋白的大?。?；b. 不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)，也就是適和用于所選的顯色方法Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜和PVDF膜6半干式轉(zhuǎn)膜將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交7將膜浸泡在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，將膜上的非特異性位點(diǎn)封閉，防止其與下一步反應(yīng)中的一抗結(jié)合，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交8加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)行一抗雜交，然后二抗再與一抗結(jié)合，進(jìn)行二抗雜交。酶標(biāo)顯色蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交9二抗與底物反應(yīng)顯色顯色發(fā)光蛋白質(zhì)樣品制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜封閉雜交10應(yīng)用可以非常有