地中海貧血基因檢測(cè)和結(jié)果分析課件

1、主要內(nèi)容一、什么是地中海貧血及分布二、地中海貧血的致病機(jī)制三、地中海貧血的基因診斷四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法五、檢測(cè)結(jié)果分析及報(bào)告一、什么是地中海貧血定義：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋 白肽鏈合成減少或缺失，導(dǎo)致血紅 蛋白的鏈/非鏈比例失衡，而引起 的一組遺傳性溶血性疾病，亦稱(chēng)海洋性貧血。 血紅蛋白病：由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷，致使珠蛋 白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致血紅 蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的一組遺傳性疾病。 地中海貧血是最常見(jiàn)的血紅蛋白病，珠蛋白合成障礙性貧血為國(guó)內(nèi)稱(chēng)呼，國(guó)外不用。地中海貧血分類(lèi)地中海貧血地中海貧血地中海貧血地中海貧血地中海貧血地中海貧血地中海貧血血紅蛋白變異體溶

2、血性異常血紅蛋白（如HbS、C等）地中海貧血樣變異（如Hb CS、E等）其他異常血紅蛋白（如Hb M、Coimbra等）地中海貧血分類(lèi)1、按照一個(gè)單倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定義0地貧（也有稱(chēng)地貧1） ：-珠蛋白基因完全 基因記為-/ 喪失功能。 +地貧（也有稱(chēng)地貧2）： -珠蛋白基因保 基因記為-/ 留有部分功能。地中海貧血分類(lèi) 2、按照肽鏈內(nèi)切酶分型缺失型地貧：珠蛋白肽鏈存在片段缺失而造 成功能缺陷非缺失型地貧：珠蛋白肽鏈上不存在缺失，而是 （點(diǎn)突變） 由于基因的點(diǎn)突變?cè)斐傻碾逆湽δ?缺陷地中海貧血分類(lèi) 3、根據(jù)基因缺失或突變個(gè)數(shù)可分為：靜止型： 缺失1個(gè)基因，基因型記為-/ 1個(gè)基因

3、突變，基因型記為/T輕型： 缺失2個(gè)基因，基因型記為：-/或-/- 2個(gè)基因突變，基因型記為： T/T 中間型： 缺失3個(gè)基因，基因型記為：-/- 缺失與突變混合，基因型為：-/T或純合突變重型： 缺失4個(gè)基因，基因型記為：-/- 缺失與突變混合，基因型為：-/T地中海貧血分類(lèi)1、根據(jù)肽鏈的功能缺失0地貧 ： 珠蛋白基因功能完全喪失，不能合成肽鏈地貧 ： 珠蛋白基因尚保留部分功能2、根據(jù)臨床癥狀靜止型地貧： 突變雜合子（ N/ +），中國(guó)人少見(jiàn)輕型型地貧：突變雜合子（ N/ +、 0/ N）中間型地貧：突變雙重雜合子/突變純合子 （ +/ +、 0/ +）重型地貧： 突變雙重雜合子/突變純合子

4、 （ 0/ 0、 0/ +）中國(guó)人HPFH和-地貧的基因突變類(lèi)型及表型特征 突變類(lèi)型缺失長(zhǎng)度(kb，缺失型)或受累基因(非缺失型)Hb F(%)G(%)其它種族缺失型G+(A)0-地貧中國(guó)型1009.321.283100廣州型4319.495云南型909.316.77290GA-HPFH東南亞型29.70.514.127.05763越南、柬埔寨人A-HPFH-196(CT)A14.320.98195意大利人GA-地貧-29(AG)22.340世界地中海貧血的流行分布廣西地中海貧血的流行分布853共5789例224例834例790例1033例1349例1559例Baise Hezhou Yuli

5、n Fangchengguang LiuzhouNanning Xiong , et al. Clin Genet 2010廣西地中海貧血的流行分布血紅蛋白病分 組陽(yáng)性樣本數(shù)%-地中海貧血88615.32 靜止型攜帶者3636.27 -地中海貧血特征4988.6 Hb H 病 250.43-地中海貧血3706.39 攜帶者2874.96 復(fù)合-地中海貧血791.36 中間型地中海貧血40.07-地中海貧血90.16 攜帶者60.1 復(fù)合-地中海貧血30.05血紅蛋白結(jié)構(gòu)變異220.38 攜帶者170.29 復(fù)合-地中海貧血40.07 復(fù)合-地中海貧血10.02總 計(jì)128722.25引起珠蛋白

6、表達(dá)降低的常見(jiàn)缺失突變類(lèi)型分布 MC10kb0kb20kb 30kb 40kb10kb3HVRinterHVR53 2 1 2 1 THAI BRIT FIL MED SEA 4.2 3.7 2.7 SPAN HW 27.6 11.1 2.4BlackBelgianIndianMalaysian 2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese 0kb 50kb 100kb 150kb G A LCR引起地中海貧血常見(jiàn)的基因缺失突變類(lèi)型分步12 種見(jiàn)于中國(guó)人群的 2/ 1珠蛋白基因點(diǎn)突變 CD31CD125 EXO

7、N I EXON II EXON IIIIVS IIVS II UTRUTR53CD13CD59 CD122 CD142 CD44CD49CD30 2 1Missense mutationMini deletion or insersionTermination mutationFrameshiftCD78 CD74 CD118 啟動(dòng)子突變異常剪接起始密碼突變移碼突變無(wú)義突變3UTR突變EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2顯性突變53 46 種見(jiàn)于中國(guó)南方人群的-珠蛋白基因點(diǎn)突變 中國(guó)南方人群最為常見(jiàn)的地貧類(lèi)型二、地中海貧血的致病機(jī)制胎兒血紅蛋白主要由兩條珠蛋白鏈、兩條

8、珠蛋白鏈組成，還含有 鏈、鏈、鏈組成成年人的血紅蛋白由兩條珠蛋白鏈和兩條珠蛋白鏈組成血紅蛋白紅細(xì)胞鏈鏈血紅素鐵鏈鏈二、地中海貧血的致病機(jī)制11p15.3珠蛋白基因簇16p13.3珠蛋白基因簇HbA HS40 2 1 2 1 HS 5 4 3 2 1 G A 二、地中海貧血的致病機(jī)制人體不同發(fā)育時(shí)期的珠蛋白生成變化規(guī)律二、地中海貧血的致病機(jī)制靜態(tài)突變點(diǎn)突變 片段突變 動(dòng)態(tài)突變 堿基替換移碼突變串聯(lián)重復(fù)的三核苷酸序列隨著世代的傳遞而拷貝數(shù)逐代累加 缺失重復(fù)重排基因突變的分子機(jī)制基因致病突變是地貧發(fā)生的分子基礎(chǔ)二、地中海貧血的致病機(jī)制三、地中海貧血基因分析1、Gap-PCR 用于和等缺失型地貧的檢測(cè)

9、211 211 SEA3.74.2ABCDEFG原理：普通的酶無(wú)法擴(kuò)增出長(zhǎng)距離的片段，通過(guò)設(shè)計(jì)出與缺失序列的兩側(cè)翼序列互補(bǔ)的引物，當(dāng)存在缺失時(shí)，由于肽鏈靠近從而擴(kuò)增出片段。三、地中海貧血基因分析2、PCR-RDB 用于檢測(cè)和點(diǎn)突變PCR膜條雜交顯色三、地中海貧血基因分析地貧基因檢測(cè)的策略：地貧：先檢測(cè)常見(jiàn)缺失型，然后檢測(cè)非缺失（點(diǎn) 突變），最后是未知的缺失和突變位點(diǎn)。 因?yàn)?0% 地貧為常見(jiàn)的三種缺失型 （-sea,-3.7,-4.2)。地貧：先檢測(cè)點(diǎn)突變，然后檢測(cè)少見(jiàn)的缺失型。 大部分地貧都是點(diǎn)突變型。 血紅蛋白病的篩查及基因診斷的技術(shù)流程遺傳咨詢(xún) 產(chǎn)前地貧攜帶者篩查策略同時(shí)正常產(chǎn)檢對(duì)象（孕

10、婦及其配偶）地貧分子診斷 知情同意選擇 胎兒產(chǎn)前基因診斷血液五分類(lèi)分析（關(guān)注MCV和MCH）+血紅蛋白電泳（Hb A2)雙方某項(xiàng)指標(biāo)均同時(shí)降低一方正常，另一方的指標(biāo)降低地貧全套檢查異常的一方做地貧全套檢查-地貧特征-地貧特征ID雙方均為-地貧特征一方為-地貧特征，另一方為ID或-地貧特征+-單純性ID或單純性-地貧雙方均為-地貧特征ID或-地貧特征的一方做地貧分子診斷 夫婦雙方基因診斷血R正常的一方做地貧分子診斷 -單純性ID或單純性-地貧-+僅異常血紅蛋白必要時(shí)測(cè)序或選擇其中一種地貧檢測(cè)四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法1、融鏈曲線(xiàn)分析法 用于檢測(cè)或缺失和點(diǎn)突變Thongperm, et al.

11、Journal of Molecular Diagnostics .2010Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011Christina V，et al. Clinical Chemistry. 2003原理：根據(jù)每條肽鏈都有自己的Tm值，從而可以通過(guò)溫度差來(lái)判斷四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法2、MLPA（多重連接探針擴(kuò)增） 用于尋找未知缺失斷裂點(diǎn)Xiao-Feng Wei，et al. Ann Hematol. 2011四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法3、毛細(xì)管電泳 可以檢測(cè)非缺失CS（Hb CS)和 E地貧Hb AHb EHb A2Can Liao, et al. Eur

12、opean Journal of Haematology. 2010 四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法4、DHPLC（變性高效液相色譜） 用于缺失型和突變型地貧都可以李倩，南方醫(yī)科大學(xué)論文，2010四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法5、基因序列測(cè)定（PCR+毛細(xì)管電泳） 用于未知突變位點(diǎn)或確定缺失片段的位置 由于儀器比較貴重，技術(shù)要求高，目前尚未在臨床一線(xiàn) 推廣，只在科研實(shí)驗(yàn)室里開(kāi)展。Azam Amirian MSc， et al. Archives of Iranian Medicine. 2011四、最新的地中海貧血檢測(cè)方法6、母體血漿中胎兒游離核酸的測(cè)定嚴(yán)提珍，國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2009嚴(yán)提珍

13、，國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2009五、檢測(cè)結(jié)果分析及報(bào)告（一）地貧基因診斷1、 - -SEA /2、 /3、 / 4、- -SEA /-4.25、- -SEA /-4.26、- -SEA /-3.7 7、 /8、 - -SEA /9、 DNA Marker缺失型地貧電泳結(jié)果 1 2 3 4 5 6 7 8 9非缺失雜交結(jié)果CS純合WS雜合未檢測(cè)到6種突變（注意不是正常）41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M 28/N IVS-II-654 /N CD17/N CD4142/ N 28/ 28CD17/IVS-II-654ABCDEF地中海貧血點(diǎn)突變分析結(jié)果血涂片染色（包涵體）Cornelis L H，Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010五、檢測(cè)結(jié)果分析及報(bào)告（三）基因診斷報(bào)告單1、臨床地