獸醫(yī)生物制品學(xué)第四章-生物制品生產(chǎn)基本技術(shù)課件

1、第四章 生物制品生產(chǎn)基本技術(shù)第一節(jié) 菌種與毒種選育技術(shù)1一、生物制品毒種的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)性狀明顯，歷史清楚：形態(tài)、生理、生化典型、血清學(xué)、來源、代數(shù)等清楚。遺傳學(xué)純一穩(wěn)定：穩(wěn)定純一的菌種，才能制造出高質(zhì)量穩(wěn)定的疫苗。免疫抗原、反應(yīng)抗原好：高質(zhì)量疫苗的基礎(chǔ)。毒力在適當(dāng)范圍內(nèi)：滅活疫苗應(yīng)該是強(qiáng)毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。測(cè)定毒力要用敏感動(dòng)物進(jìn)行。234二、強(qiáng)毒種的選育1、強(qiáng)毒種的用途：滅活疫苗、診斷試劑、抗血清、攻毒試驗(yàn)。2、強(qiáng)毒種來源：典型傳染病分離培養(yǎng); 保藏中心提供。3、強(qiáng)毒種分離：56B、致病力（動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞試驗(yàn)）。C、抗原性（免疫及反應(yīng)抗原試驗(yàn)）D、穩(wěn)定性

2、（傳代不變異）7(一)純粹試驗(yàn)（分離培養(yǎng)、鑒定）。(二)致病力測(cè)定 菌(毒)種的致病力(或稱毒力)常用易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、本動(dòng)物(原宿主動(dòng)物)、禽胚或細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，用半數(shù)致死量(LD50)、半數(shù)感染量(ID50)、禽胚半數(shù)致死量(ELD50)、胚半數(shù)感染量(HD50)、組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)等來表示。(三)抗原性測(cè)定 反應(yīng)原性測(cè)定，一般采用血清學(xué)方法，以抗體滴度或效價(jià)表示。 免疫原性測(cè)定，通常采用的方法是將菌(毒)株制成疫苗，免疫動(dòng)物，經(jīng)13 周后用致死劑量的強(qiáng)毒攻擊，以保護(hù)率表示?？怪滤懒繌?qiáng)毒越多，保護(hù)率越高者，免疫原性越好?？乖缘臏y(cè)定，也需設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，否則無(wú)效。(四)穩(wěn)定性測(cè)

3、定 一般采用培養(yǎng)基或動(dòng)物、禽胚、細(xì)胞對(duì)菌(毒)株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其生物學(xué)特性，測(cè)定其致病力和抗原性，以證明其遺傳性狀的穩(wěn)定。8達(dá)到：毒力強(qiáng)，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種，最后凍干保藏。這就是強(qiáng)毒菌種的標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)壯：弱毒菌種在敏感動(dòng)物或細(xì)胞上多次傳代，達(dá)到毒力增強(qiáng)的目的（日本731部隊(duì)用人試驗(yàn)，目的是增強(qiáng)細(xì)菌毒力，做細(xì)菌武器使用。）。9三、弱毒種的選育1、用途：弱毒疫苗，診斷試劑，免疫血清。2、來源：自然界篩選和人工誘變。3、弱毒篩選途徑：1011自然界弱毒篩選： 同源弱毒新城疫I系 異源弱毒火雞皰疹病毒疫苗，它們都是在自然界尋找發(fā)現(xiàn)的。人工誘變篩選： 12人工致弱強(qiáng)毒株 (1) 物理途徑：高溫、干

4、燥、射線等1881年，巴斯德將炭疽強(qiáng)毒菌在42.5高溫下長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，育成了炭疽弱毒菌株。巴斯德又將含有狂犬病病毒的腦脊髓置干燥條件中處理，獲得了狂犬病病毒弱毒株。日本乙型腦炎病毒強(qiáng)毒株經(jīng)紫外線照射后能引起基因突變，從而出現(xiàn)遺傳性狀分離，再進(jìn)行蝕斑挑選，育成弱毒株用于制造弱毒疫苗。13(2)化學(xué)途徑：化學(xué)誘變劑如通過亞硝基胍處理支原體己育成了雞支原體疫苗株和肺炎支原體突變株；將豬副傷寒沙門氏菌強(qiáng)毒株在含有150011000 醋酸鉈的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳50 代后，育成了弱毒株。14(3)生物學(xué)途徑 適應(yīng)鈍感動(dòng)物(非自然宿主)：我國(guó)的豬瘟兔化弱毒株，是將豬瘟病毒強(qiáng)毒株通過兔體傳400 余代后育成的

5、。適應(yīng)鈍感禽胚： 鴨瘟雞胚化弱毒株，是將鴨瘟病毒強(qiáng)毒株經(jīng)鴨胚傳9 代和雞胚傳23 代后育成的。羊痘弱毒株-強(qiáng)毒株,雞胚傳代;雞痘弱毒株強(qiáng)毒株,鵪鶉傳代;適應(yīng)細(xì)胞：多采用同源或異源動(dòng)物組織的原代細(xì)胞。我國(guó)的馬傳染性貧血病驢白細(xì)胞弱毒株，是將馬傳染性貧血病驢白細(xì)胞強(qiáng)毒株通過驢白細(xì)胞傳代育成的。豬丹毒弱毒株(GC42)-強(qiáng)毒株-豚鼠370代,雞2代.15雜交減毒：流行性感冒弱毒株的育成是將溫度敏感株(毒力弱，抗原性弱)與流行株(毒力強(qiáng)，抗原性強(qiáng))進(jìn)行混合培養(yǎng)傳代，兩者毒力基因發(fā)生交換產(chǎn)生毒力低、抗原性強(qiáng)的毒株。(4) 基因工程途徑偽狂犬病病毒，去除決定其致病力的TK 基因獲得偽狂犬病病毒TK 突變株

6、，用該突變株制成的疫苗是第一個(gè)商品化的基因缺失疫苗，預(yù)防偽狂犬病效果十分理想。164、初選的依據(jù)：生物性狀改變豬丹毒桿菌變長(zhǎng)絲狀，菌落光滑變粗糙。病毒蝕斑變異。溫度敏感變異。藥物敏感變異營(yíng)養(yǎng)變異宿主變異17第三節(jié) 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)是生物制品制造的基礎(chǔ)，一些內(nèi)容在微生物學(xué)已經(jīng)學(xué)習(xí)過，這里主要講一些重要的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)。18一、細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律與條件 大家一定要熟悉細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，因?yàn)椴煌纳镏破?，要用不同時(shí)期的細(xì)菌，如細(xì)菌疫苗，要對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期細(xì)菌；芽孢疫苗，要衰老期細(xì)菌；外毒素要老齡細(xì)菌。19其次，要根據(jù)不同細(xì)菌用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用不同的培養(yǎng)方法（需要氧氣，微需氧，厭氧。另培養(yǎng)溫度

7、，pH，滲透壓等。）。20二、細(xì)菌培養(yǎng)的基本技術(shù) 步驟：先分離出單個(gè)菌落斜面培養(yǎng)基生化或血清鑒定菌種保存生產(chǎn)生物制品先接種到斜面菌種小三角瓶肉湯大三角瓶肉湯。21（一）細(xì)菌分離培養(yǎng)（目的是稀釋病料，得到單個(gè)典型菌落）。1、需氧菌分離培養(yǎng)：分段劃線、傾注培養(yǎng)。2、微需氧培養(yǎng)：鴨疫巴氏桿菌，牛布氏桿菌病，豬傳染性胸膜肺炎菌等，用蠟燭缸方法。3、厭氧菌培養(yǎng)：用皰肉基，物理除氧氣（加氮?dú)?，氫氣），化學(xué)除氧：焦性沒食子酸加燒堿。222324厭氧罐252627厭氧培養(yǎng)箱28（二）細(xì)菌的規(guī)模培養(yǎng)生物制品是產(chǎn)品，一般要大規(guī)模培養(yǎng)，才能滿足基層需要。1、菌種接種量：1-3%，過少生長(zhǎng)慢，過度帶入有害產(chǎn)物多，影響

8、生長(zhǎng)。2、培養(yǎng)時(shí)間：菌苗，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的細(xì)菌好；芽孢疫苗：衰老期細(xì)菌；外毒素：需要1周時(shí)間培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，如果有少量污染，可以提前滅活終止培養(yǎng)。29液體靜止培養(yǎng)：一般細(xì)菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或發(fā)酵罐，裝入培養(yǎng)基1/2-2/3量，需氧培養(yǎng)，要5小時(shí)搖動(dòng)一次，增加氧氣濃度。培養(yǎng)厭氧細(xì)菌，可以裝滿培養(yǎng)基，上面加少量石蠟油，隔絕空氣，下加肝塊或肉渣（皰肉基），它們氧化，吸收氧氣，達(dá)到除氧氣目的。液體培養(yǎng)含菌量低，多需要濃縮。303、培養(yǎng)方法：根據(jù)不同制品的性質(zhì)和要求，選育不同方法。固體表面培養(yǎng)：多用于診斷劑，也有菌苗生產(chǎn)?？呻S意調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度，但操作麻煩，勞動(dòng)量大。培養(yǎng)方法有克氏瓶

9、，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接種，培養(yǎng)后加生理鹽水，再用L棒刮洗下細(xì)菌混懸液。313233液體深層通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）：可自動(dòng)調(diào)節(jié)溫度、氧氣、pH、營(yíng)養(yǎng)、攪拌，注意消泡沫和污染。透析培養(yǎng)：半滲透膜作用，營(yíng)養(yǎng)可以不斷補(bǔ)充，可以提高細(xì)菌和毒素含量。連續(xù)培養(yǎng)：營(yíng)養(yǎng)不斷加入，培養(yǎng)好的細(xì)菌不斷流出。34KRH-PB-6L 玻璃發(fā)酵罐 35（三）細(xì)菌計(jì)數(shù)技術(shù) 細(xì)菌疫苗必須有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，應(yīng)該對(duì)生產(chǎn)的疫苗計(jì)算含菌量。1、直接顯微鏡檢查計(jì)數(shù)定量定面積染色計(jì)數(shù)：10ul菌液，涂抹1cm2面積的載玻片上，干燥固定染色，油鏡下觀察，油鏡直徑是0、16mm，視野面積是0、02mm2，1cm2面積

10、有50萬(wàn)個(gè)油鏡視野，多觀察幾個(gè)視野，算出一個(gè)視野細(xì)菌平均數(shù)X50萬(wàn)X100，即每ml含細(xì)菌量。36比例法計(jì)數(shù)（也叫對(duì)照法）如用已知人紅細(xì)胞為500萬(wàn)/mm3（可以把紅細(xì)胞0、4%甲醛固定，長(zhǎng)期使用），取一環(huán)紅細(xì)胞放在載玻片上，另取一環(huán)菌液與紅細(xì)胞混勻涂片，干燥固定染色，顯微鏡下檢查，如果平均每個(gè)視野是一個(gè)紅細(xì)胞，10個(gè)細(xì)菌，那么，被檢查細(xì)胞為5000萬(wàn)/ mm3，1ml是500000萬(wàn)個(gè)細(xì)菌。37估計(jì)計(jì)數(shù)法接種環(huán)直徑在0.5cm，取一環(huán)細(xì)菌液，涂抹在載玻片上，大約0.51 cm2，干燥固定染色，顯微鏡檢查，如果每個(gè)視野平均是19個(gè)細(xì)菌，菌液含量是105-6個(gè)/ml，1099為107-8個(gè)/ml

11、，100以上為109-10個(gè)/ml，密不可計(jì)為1010個(gè)以上/ml。38紅細(xì)胞計(jì)數(shù)室法：（細(xì)菌量）Y/80X400X稀釋倍數(shù)X10=細(xì)菌數(shù)/ mm3，變ml乘1000。（Y是5個(gè)中方格細(xì)菌總數(shù)，乘10是計(jì)數(shù)室的高度為0、1mm，計(jì)數(shù)室1mm2，有400個(gè)小格，有25個(gè)中格，每個(gè)中格是16個(gè)小格）。該方法多用于計(jì)數(shù)大的細(xì)菌或酵母菌、細(xì)胞。3940412、比濁比色法比濁管法 含菌量與渾濁度正比，用已知菌含量的試管與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比，找出規(guī)律，如1億細(xì)菌=1號(hào)比濁管顏色，10億等10號(hào)，以后，用未知細(xì)菌液與標(biāo)準(zhǔn)管比色，得出大致細(xì)菌含量。 42美藍(lán)還原褪色法：含細(xì)菌多，使美藍(lán)褪色快。10ml牛奶，加1m

12、l美藍(lán)液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分鐘，細(xì)菌多于2000萬(wàn)/ml，20-2小時(shí)，為4002000萬(wàn)；2-5、5小時(shí)為50400萬(wàn)；5、5小時(shí)以上，為少于50萬(wàn)/ml，為一級(jí)牛奶；如果用于細(xì)菌苗，應(yīng)先用已知細(xì)菌找出規(guī)律。433、活菌計(jì)數(shù)：原理，一個(gè)菌落是一個(gè)細(xì)菌的后代，數(shù)菌落就知道含菌量，也叫菌落形成單位CFU：colony format unite。傾注法（GB方法）：菌液10倍遞減稀釋，選2-3個(gè)稀釋度，各取1ml于平皿，加45-50營(yíng)養(yǎng)瓊脂15-20ml，搖勻37度培養(yǎng)，計(jì)算菌落，乘稀釋倍數(shù)，即每ml細(xì)菌數(shù)。44平板表面涂布法：先做好營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將不同稀釋度菌液0、1ml

13、加上，玻璃棒刮勻，37度24h培養(yǎng)，計(jì)算菌落乘稀釋度乘10=菌數(shù)/ml微量滴板法：將不同稀釋度菌液，各取0、02ml滴在營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，一板可以滴多點(diǎn)，自然擴(kuò)散，37度培養(yǎng)，計(jì)算每點(diǎn)菌落乘50乘稀釋度=菌數(shù)/ml。45三、培養(yǎng)基微生物學(xué)已經(jīng)學(xué)過，自己溫習(xí)，重點(diǎn)熟悉：不同微生物用不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度配比調(diào)節(jié)合適的pH范圍46第三節(jié) 病毒的增殖技術(shù)一、病毒的復(fù)制與培養(yǎng)病毒為專性細(xì)胞寄生物，必須在活細(xì)胞內(nèi)生存，其復(fù)制過程是：吸附，進(jìn)入，脫殼，生物合成，裝配和釋放。微生物已經(jīng)講，自己復(fù)習(xí)。 二、病毒的動(dòng)物接種增殖（一）、病毒材料的處理 1、病毒的釋放：剪碎研磨， 1：5-10稀釋，冰凍

14、融及超聲波處理。 2、除雜菌：細(xì)菌過濾器過濾，高速離心取上清液；其次是抗生素處理，加5001000u/ml青霉素和鏈霉素，4度過夜殺菌。47（二）動(dòng)物選擇健康動(dòng)物、SPF動(dòng)物；未接種相應(yīng)病毒疫苗動(dòng)物適宜年齡和體重易感動(dòng)物。（三）接種方法：皮下，肌肉，靜脈，腹腔，腦，胸腔等48三、雞胚的接種（一）雞胚的選擇1、健康的SPF雞胚2、白殼，薄殼消毒蛋3、沒免疫相應(yīng)病毒疫苗4、5-7天照蛋，去無(wú)精、死胚雞蛋5、畫出氣室，接種24h照蛋，定時(shí)收病毒。49（二）雞胚的接種和收獲避開血管和心臟，確定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱針或12號(hào)針頭鉆孔，然后可以接種。預(yù)先準(zhǔn)備好病料，注射器，融化的石蠟。

15、1、卵黃囊接種：用5-8天雞胚，在氣室中心，胚胎對(duì)側(cè)刺入3cm（先用三棱針鉆孔）。用于病毒，立克次氏體，衣原體接種。2、尿囊腔接種，用9-11日雞胚，在氣室邊緣下2cm，避開血管，40進(jìn)針0.5-1.5cm。適應(yīng)雞新城疫，鴨肝炎，雞傳染支氣管炎病毒接種。505152方法：(a)將蛋胚在檢卵燈上照視，標(biāo)出氣室與胚胎位置，并在絨毛尿囊膜血管較少的地方作記號(hào)。(b)將蛋胚鈍端向上豎放在蛋座木架上。用碘酒消毒氣室蛋殼，并用鋼針在記號(hào)處鉆一小孔。(c)用帶18mm長(zhǎng)針頭的1ml注射器吸取雞新城疫病毒液，針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)絨毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液。(d)用石蠟封孔后于37孵卵器孵育72小時(shí)。

16、53收獲尿囊液：(a)將蛋胚放在冰箱內(nèi)冷凍半日或一夜，使血管收縮，以便得到無(wú)胎血的純尿囊液。(b)用碘酒消毒氣室處的卵殼，并用滅菌剪刀除去氣室的卵殼。切開殼膜及其下面的絨毛尿囊膜，翻開到卵殼邊上。(c)將雞卵傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液。一個(gè)蛋胚約可收獲6ml左右尿囊液。若操作時(shí)損傷了血管，則病毒會(huì)吸附在紅細(xì)胞上，尿囊液成為無(wú)用。收獲的尿囊液經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)后可在4以下的溫度中保存。觀察雞胚，看有無(wú)典型的癥狀。543、羊膜腔接種：用10-12日雞胚，在胚胎對(duì)側(cè)進(jìn)針，有抵抗時(shí)注入病毒。4、絨毛尿囊膜接種：選1113日雞胚，先造人工氣室，然后在人工氣室內(nèi)注射，適合痘病毒，皰疹病毒等。另外，還有腦，胚體

17、，靜脈接種，難度大，科研使用。不同病毒用不同接種途徑，培養(yǎng)時(shí)間不同，收獲組織也不同。555657（三）影響禽胚增殖病毒的因素 1、種蛋質(zhì)量：要用SPF蛋，母源抗體存在，抗生素（對(duì)立克次氏體和衣原體）。 2、孵化環(huán)境：溫度是37.8-38，濕度53-57%，通風(fēng)，定時(shí)翻蛋。 3、接種技術(shù)：無(wú)菌操作和消毒，收獲根據(jù)不同病毒，收獲病毒時(shí)間不同，不要臭蛋和渾濁蛋。收獲后測(cè)效價(jià)，加雙抗-20保存。58四、細(xì)胞增殖病毒技術(shù) 1、細(xì)胞培養(yǎng)概念：利用機(jī)械、酶、化學(xué)方法使組織或單層細(xì)胞分散成單個(gè)或2-4個(gè)細(xì)胞的懸液，進(jìn)行培養(yǎng)。原代細(xì)胞：新鮮組織制備的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，一般僅可以傳代3代。二倍體細(xì)胞：自繼代細(xì)胞選出

18、的也特殊生物學(xué)標(biāo)志的細(xì)胞，染色體是二倍體，可傳代50-100代，主要做疫苗生產(chǎn)。細(xì)胞株傳代細(xì)胞：非二倍體，多為癌細(xì)胞，可無(wú)限生長(zhǎng)，如Hela細(xì)胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生產(chǎn)。細(xì)胞系592、細(xì)胞培養(yǎng)的方法靜止培養(yǎng)：細(xì)胞懸液接入培養(yǎng)瓶中，密封置溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞沿瓶子壁長(zhǎng)成單層，為最簡(jiǎn)單培養(yǎng)病毒方法。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)：細(xì)胞懸液在轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，10-20轉(zhuǎn)/h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，需要營(yíng)養(yǎng)液少。懸浮培養(yǎng)：通過震蕩，轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞懸浮于液體中培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)：以固體小顆粒為載體，便于細(xì)胞附著，載體擴(kuò)大了表面積。中空纖維培養(yǎng)：細(xì)胞在中空纖維內(nèi)生長(zhǎng)。微囊化培養(yǎng)：細(xì)胞在微囊中生長(zhǎng)。603、細(xì)胞的制備1)細(xì)胞間有膠原蛋白，要破

19、壞它們才變成分散單細(xì)胞。機(jī)械分散：將組織剪碎成1mm3小塊，再擠壓通過銅絲網(wǎng)孔，可得到單細(xì)胞。酶消化法：常用胰酶破壞細(xì)胞間質(zhì)，活力1：250，濃度是0.25%，pH7.4-7.6。鰲合劑分散法：EDTA可除去維護(hù)細(xì)胞間結(jié)合的Ga+和Mg+，常用于單層細(xì)胞的分散。612)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇慢凍快融法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后離心，將細(xì)胞沉淀用凍存液(10DMSO，20犢牛血清，70MEM)懸浮至細(xì)胞密度為200 萬(wàn)500 萬(wàn)/ml。分裝于細(xì)胞凍存管后4放置lh，然后-20放置2h，再放入-70：冰箱46 h 后放入液氮中保存。 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，通常將從液氮中取出的細(xì)胞管置于3740水浴4060s 使細(xì)胞

20、融化，離心后除去凍存液，然后將細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。必要時(shí)待細(xì)胞完全貼壁后換液1次，以防止殘留的DMSO 對(duì)細(xì)胞有害。 細(xì)胞在液氮中可貯存35 年，但為妥善起見，每?jī)龃?年應(yīng)復(fù)蘇1 次。624、細(xì)胞培養(yǎng)的要素營(yíng)養(yǎng)物資：培養(yǎng)液（含氨基酸，犢牛血清，維生素，鹽，糖等成分）。現(xiàn)多用成品細(xì)胞培養(yǎng)基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。接種量：與單細(xì)胞生長(zhǎng)成正比，量過大，因細(xì)胞碎片產(chǎn)生毒性作用，過小，不易長(zhǎng)成單層。不同細(xì)胞 有不同接種量，如鼠腎細(xì)胞50萬(wàn)/ml，雞成纖維細(xì)胞2040萬(wàn)ml，豬腎細(xì)胞80萬(wàn)/ml，血球計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)。63血清：使用前須經(jīng)56滅活30min，國(guó)內(nèi)多用犢牛血清。 生

21、長(zhǎng)液一般血清含量為520，大部分細(xì)胞生長(zhǎng)液中加入10血清已能滿足細(xì)胞生長(zhǎng)要求。維持液中血清量為05，盡可能不加入血清以維持細(xì)胞活力并避免血清對(duì)病毒增殖的抑制作用。pH、溫度、氣體環(huán)境：pH7.2-7.4，不低于6.8，不高于7.6；培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和氫離子緩沖劑HEPES。溫度一般是37，過高容易死亡，過低生長(zhǎng)慢，20-25，細(xì)胞緩慢長(zhǎng)。氣體環(huán)境，一是橡皮塞密封培養(yǎng)；二是CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。64 5、污染問題：細(xì)菌、真菌、支原體污染，加一定量抗生素可殺菌，如加青鏈霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。病毒污染：有組織代毒和培養(yǎng)帶毒，前者用SPF動(dòng)物組織可以解決，后者注意滅

22、菌和消毒。 膠原蟲：（存在犢牛血清），血清37培養(yǎng)1個(gè)月以上，高速離心，檢查沉淀物。 656、病毒增殖技術(shù)選敏感動(dòng)物細(xì)胞。注意營(yíng)養(yǎng)，溫度和pH。接種量和方法：1-10%接種，V/V；分同步和異步接種。病毒接種方法有兩種：異步接毒和同步接毒。異步接毒是細(xì)胞長(zhǎng)成單層后倒去生長(zhǎng)液，按維持液的110接種病毒，37吸附1h 后加入維持液。多數(shù)病毒采用這種接毒方式。同步接毒是在種植細(xì)胞同時(shí)或在種植細(xì)胞4 h 內(nèi)接種病毒，主要用于病毒復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂盛期的病毒，如細(xì)小病毒等。支原體污染，加抗生素。66細(xì)胞病變：細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)是判定病毒增殖情況的重要指標(biāo)。多數(shù)病毒在敏感細(xì)胞上增殖可引起CPE在顯

23、微鏡下主要表現(xiàn)為：細(xì)胞圓縮，如痘病毒、呼腸孤病毒、披蓋病毒等；細(xì)胞聚集，如腺病毒；細(xì)胞融合形成合胞體，如副黏病毒、皰疹病毒；輕微病變，如正黏病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等。但有些病毒杠細(xì)胞上增殖不產(chǎn)生CPE，如豬瘟病毒。除CPE 外，包涵體和血凝性也可作為判定指標(biāo)。病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖一般在CPE 達(dá)80左右時(shí)收獲，感染細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融使病毒充分釋放，然后3000r/min 離心1520 min 去除細(xì)胞碎片，上清病毒液-20、凍存。對(duì)于細(xì)胞結(jié)合型病毒，如馬立克氏病病毒，收獲的感染細(xì)胞直接于液氮中保存。67收獲：CPE到80%收獲，反復(fù)凍融，離心取上清夜，測(cè)效價(jià)，加雙抗，-20保存。68

24、疫苗生產(chǎn)工藝流程 菌（毒）種 培養(yǎng)物（培養(yǎng)基、動(dòng) 物、禽胚或細(xì)胞等） 收獲抗原（培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細(xì)胞液等） 配苗 分裝 凍干成活疫苗或滅活后制成滅 活疫苗。第四節(jié) 疫苗制造流程69一、細(xì)菌滅活疫苗制造1、種子：毒力強(qiáng)，免疫原性好，13個(gè)菌株，菌種逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。2、培養(yǎng)：選適當(dāng)培養(yǎng)基和方法，如固體或液體培養(yǎng)，要計(jì)數(shù)活菌和觀察純度。3、滅活和無(wú)菌檢查：加適量甲醛37度滅活24h，接種斜面培養(yǎng)基無(wú)菌檢查，4、濃縮提高含菌量：離心或沉淀方法。5、配佐劑分裝：加20%鋁膠，或油2：1水油乳化，無(wú)菌分裝，加塞，封蠟，標(biāo)簽和裝箱。6、動(dòng)物安全試驗(yàn)，接種小白鼠0、2ml觀察3天，健活。70二、細(xì)菌弱毒

25、疫苗制造 1、菌種：中監(jiān)所提供凍干種。 2、培養(yǎng)：1-3%量接種，檢查純度和計(jì)數(shù)。 3、濃縮：離心或吸附沉淀法（用0、2-0、 25%羧甲基纖維素濃縮。 4、配苗和凍干：加入合適濃度保護(hù)劑，分裝，凍干，加塞，封口，標(biāo)簽和裝箱。 5、動(dòng)物安全試驗(yàn)。71細(xì)菌疫苗的制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培養(yǎng)基配制、滅菌菌種生產(chǎn)用種子培養(yǎng)菌液菌苗原液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗原料佐劑滅活菌液配苗乳化分裝、扎蓋、帖簽滅活疫苗滅活檢驗(yàn)配制、滅菌保護(hù)劑原料配制、滅菌72三、病毒性動(dòng)物組織苗制造 病毒在易感動(dòng)物體內(nèi)增殖，用含毒量高的組織制造疫苗，叫滅活組織苗，如兔瘟，自家組織滅活苗；弱毒疫苗有豬瘟兔化弱毒疫苗。（一）

26、自家組織滅活苗 1、選癥狀典型、含毒量高的組織。 2、稱重和打勻：切碎組織，搗碎機(jī)打勻，一般按組織和生理鹽水按1：58打勻加生理鹽水，加青鏈霉素各1000u/ml。 3、凍融和過濾：冰柜反復(fù)冰凍和融化三次，釋放病毒，8層紗布過濾。73 4、滅活：加0.4%甲醛滅活，37度24h， 5、無(wú)菌檢查：接種斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。菌苗8層紗布再過濾一次。 6、加佐劑分裝：加20%鋁膠，分裝。 7、動(dòng)物安全檢查:接種小白鼠0、2ml，觀察3天，無(wú)反應(yīng)，安全。 8、 場(chǎng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)：先注射兩頭豬，觀察三天，無(wú)反應(yīng)，全場(chǎng)使用。9、使用方法：8、18日齡仔豬每次注射2-3ml；大豬發(fā)病前1個(gè)月、半月各注

27、射5ml。10、保存：2-15一年。74（二）病毒弱毒疫苗選易感的SPF動(dòng)物，年齡大小一致。毒種：選適宜毒力的病毒，減少傳代次數(shù)，選適宜接種途徑。觀察、收獲和測(cè)效價(jià)：觀察食欲、體溫、精神等，符合癥狀者剖殺，取含度高組織測(cè)效價(jià)，符合效價(jià)可以做疫苗。研磨、稀釋和殺菌：將組織剪碎研磨，按1：101：100加入稀釋劑，過濾，加雙抗500-1000u/ml，0-4度處理過夜。75無(wú)菌檢查，半成品疫苗接種適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。加保護(hù)劑凍干分裝。動(dòng)物安全試驗(yàn)，接種適宜動(dòng)物10倍量，3天安全 。保存：-15一 年。（使用：弱毒疫苗一般3-5天產(chǎn)生免疫。）76病毒性組織疫苗的制造工藝流程感染動(dòng)物或胚胎分裝

28、、扎蓋、貼簽健康動(dòng)物或SPF雞胚等健康動(dòng)物或SPF雞胚等動(dòng)物或SPF雞胚等基礎(chǔ)種毒生產(chǎn)用種毒收獲感染組織或胚液純化配制成含毒懸液配苗分裝凍干活疫苗保護(hù)劑原料配制檢驗(yàn)滅活病毒液配苗、乳化滅活疫苗原料佐劑配制滅活檢驗(yàn)77四、病毒禽胚疫苗的制備 除禽病可以用禽胚外，其它正粘病毒（流感）、副粘病毒等，都可以用禽胚培養(yǎng)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，質(zhì)量容易控制。78雞胚的選擇：SPF、未免疫、未用抗生素，適宜的雞胚齡。種毒和繼代：凍干毒要雞胚活化三代以上，效價(jià)合格方可使用。接種與收獲 :接種合適部位、合適時(shí)間，適宜濃度和量，如ND 系，為10-3 、0.1ml接種。ND 系是用10-4 、0.1ml接種.培育及收獲：

29、ND系，為38、5-39,60-70%濕度培育，收24-48h的雞胚，0-4冷卻，收尿囊液。79檢查無(wú)菌和效價(jià)。ND ND系效價(jià)是1：80以上合格。配疫苗：濕疫苗：尿囊液加雙抗，-20保存1-2年，0-8保存3-6個(gè)月。用時(shí)按10-4稀釋，每雞一滴。凍干疫苗：尿囊液適當(dāng)稀釋10-2，加等量保護(hù)劑，雙抗，分裝凍干，-15一年保存。油乳滅活疫苗：尿囊液適當(dāng)稀釋10-2，加0.1%甲醛滅活，加雙抗，按油：水疫苗，3-1：1乳化即成，3-15度保存半年，小雞0、1-0、2ml，大雞0、51ml。 80五、病毒細(xì)胞疫苗的制備(一)種毒和繼代：毒種要經(jīng)過毒力、安全、無(wú)菌檢查合格才可以做毒種。其次，毒種要細(xì)

30、胞適應(yīng)后可以大規(guī)模培養(yǎng)。（二）營(yíng)養(yǎng)液：多用專門商品培養(yǎng)基。（三）細(xì)胞制備：多用原代細(xì)胞和二倍體細(xì)胞，選擇依據(jù)：病毒適應(yīng)性高、毒價(jià)高，細(xì)胞來源方便、制備簡(jiǎn)單，生命力強(qiáng)。不能用癌細(xì)胞或其它含逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞。81（四）接毒和收獲：接毒分同步和異步，同步即細(xì)胞分裝后不久接種，如細(xì)小病毒。異步是細(xì)胞形成單層后接種，如豬水泡病病毒。一般按12%量接種，70-85%細(xì)胞病變時(shí)收獲。（五）配疫苗：1、滅活苗，加入滅火劑，阻滯劑，再加佐劑混合而成。 2、凍干疫苗，加保護(hù)劑混合，分裝凍干。82病毒性細(xì)胞疫苗的制造工藝流程健康動(dòng)物（或胚胎）組織原料細(xì)胞懸液生長(zhǎng)細(xì)胞病毒液配苗分裝凍干、扎蓋帖簽活疫苗基礎(chǔ)種毒生產(chǎn)用種

31、毒原料保護(hù)劑配制滅菌細(xì)胞培養(yǎng)液傳代細(xì)胞滅活病毒液配苗（混勻、乳化）分扎蓋帖簽裝滅活疫苗檢驗(yàn)原料佐劑配制滅菌滅活檢驗(yàn)配制培養(yǎng)收獲83六、寄生蟲疫苗 是新發(fā)展的疫苗，臨床主要用的有雞球蟲疫苗及原蟲疫苗。大寄生蟲因?yàn)榭乖瓘?fù)雜，不可做疫苗。致弱疫苗蟲體致弱，篩選天然弱毒蟲株做疫苗。人工致弱：體內(nèi)傳代致弱，牛巴貝斯蟲在犢牛傳15代成弱毒。 84 體外傳代致弱，如艾美爾球蟲通過雞胚傳代，牛泰勒蟲是淋巴細(xì)胞傳代致弱，還有放射線和藥物致弱?？乖呙纾捍罅刻崛〖纳x有效保護(hù)性抗原制成。寄生蟲抗原苗：獲取大量蟲體-機(jī)械粉碎裂解-提取抗原浸出物-濃縮配苗。分子水平寄生蟲疫苗；通過基因生物工程，獲取大量純化的寄生蟲功

32、能抗原，制成疫苗。85第四節(jié) 診斷用生物制品制造技術(shù) 診斷劑；是利用微生物，寄生蟲，及其代謝產(chǎn)物，及高免血清制成,用于鑒定微生物以及診斷動(dòng)物傳染病的試劑。分診斷抗原、診斷抗體和標(biāo)記抗體三類，原理是根據(jù)抗原抗體特異反應(yīng)。86（一）診斷抗原：用已知抗原成分，來檢測(cè)血清未知抗體的方法。 1、凝集反應(yīng)抗原：常見有雞白痢、布氏、馬流產(chǎn)，雞支原體，豬萎鼻抗原?？乖穷w粒狀，加被檢查血清，如果反應(yīng)，出現(xiàn)大顆?；蚱瑺钅?下面講雞白痢沙門氏菌全血平板抗原制備步驟；雞白痢沙門氏菌-固體平板培養(yǎng)2%甲醛生理鹽水洗菌苔滅活離心沉淀比濁（100億/ml-加結(jié)晶紫染色（3/10000）-加10%甘油混勻即成。 使用：

33、取被檢母雞翅下靜脈血一滴在玻璃板上，加一滴抗原攪和勻,310分鐘出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性。87 2、沉淀抗原：是可溶抗原（細(xì)菌浸出物，病毒），炭疽沉淀抗原、馬立克氏抗原，法氏囊抗原等。炭疽沉淀抗原：懷疑炭疽病料剪碎研磨1：10加入生理鹽水煮半小時(shí)濾紙過濾-即成。使用：將炭疽沉淀素加入直徑0.5厘米試管-上面慢慢加入制備的沉淀抗原，3-10分鐘，兩液界面出現(xiàn)白色沉淀環(huán)沉淀。88雞法氏囊病抗原：取典型病變法氏囊數(shù)個(gè)稱重剪碎研磨-加0.5%石炭酸生理鹽水1：5量?jī)鋈谌胃咚匐x心取上清液即成。使用：制備1%瓊脂板（5%氯化鈉液，加1%瓊脂糖，煮3-5分鐘，倒平板）-在板上打梅花孔7個(gè)（孔間距離35mm，孔底火焰

34、封底），中央孔加抗原，外周孔加不同稀釋的抗體，30-371-3天觀察，如果出現(xiàn)沉淀線，說明抗體的效價(jià)。特異線是內(nèi)彎弧，非特異是外彎或直線。89人醫(yī)用非特異抗原，牛心肌浸出物，測(cè)定人血清梅毒抗體，是康氏反應(yīng)。 3、補(bǔ)體結(jié)合抗原（制備同凝集反應(yīng)抗原）：因補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)需57天時(shí)間，準(zhǔn)備要5種材料，現(xiàn)很少使用。90（二）變態(tài)反應(yīng)抗原；獸醫(yī)經(jīng)常用測(cè)牛結(jié)核病，布氏病，馬鼻疽。 原理：是傳染性變態(tài)反應(yīng)，屬遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)，多用于胞內(nèi)細(xì)菌感染，寄生蟲病測(cè)定；方法有滴眼、觀察眼紅腫流淚；皮內(nèi)注射、觀察皮膚增厚。 布氏桿菌水解素：菌種固體表面培養(yǎng)0.5%石炭酸生理鹽水洗下離心洗滌濃縮高壓滅菌水解蔡氏濾器過濾剴氏定氮0

35、.40.5mg/ml。91二、診斷抗體有診斷血清和單克隆抗體血清，原理：已知血清+未知細(xì)菌-凝集為陽(yáng)性。診斷血清制備：用已知細(xì)菌疫苗-多次免疫兔子-取血清加0.5%石炭酸即成。如沙門氏菌AF多價(jià)血清，可以檢測(cè)97%范圍的沙門氏菌，不可以定是什么群沙門氏菌，要用因子血清、H血清、VI血清才可以確定是什么血清的沙門氏菌。92因子血清：是僅含某主要抗原的抗體血清。細(xì)菌有主要抗原和次要抗原，如沙門氏菌A群的甲型副傷寒菌，O抗原有1、2、12；B群的得爾俾沙門氏菌O抗原是1、4、12；它們兩重復(fù)的抗原是1、12，是次要抗原，單獨(dú)有的O2，O4是主要抗原，可以區(qū)別它們。93因子血清制備：用甲型副傷寒細(xì)菌免

36、疫兔子多次取血清然后和B群得爾俾沙門氏菌混合凝集除去凝集顆粒和片（除去了O1、O12血清）剩下即只有O2的抗體血清。一般血清為多克隆抗體，是多個(gè)不同B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，所以反應(yīng)不準(zhǔn)確。單克隆抗體是一個(gè)B細(xì)胞后代產(chǎn)生的純一抗體。94三、標(biāo)記抗體 抗體經(jīng)過標(biāo)記后，增強(qiáng)了反應(yīng)靈敏性和準(zhǔn)確性；由于標(biāo)記復(fù)雜，保質(zhì)期短和使用少，多為買商品，一般單位不自己制備。 常見有熒光抗體、酶標(biāo)抗體和同位素抗體等。 951)HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記抗體的方法：戊二醛二步法戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的

37、利用率低，一般只有24的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。2)熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC)或羅達(dá)明（RB200)963)放射性同位素標(biāo)記抗體技術(shù)（一）氯胺T法：氯胺T法標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標(biāo)記方法。原理：氯胺T（Chloramine-T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個(gè)或兩個(gè)氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。（二）乳過氧化物酶法（LPO）本法反應(yīng)溫和，對(duì)抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低，一般為2040%。原理此法是利用乳過氧化物酶（Lact

38、operoxidase）有促進(jìn)微量過氧化氫對(duì)125I-的氧化作用，生成125I+，并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上（三）Iodogen碘化法：氯甘脲是70年代中期發(fā)展起來的蛋白質(zhì)碘化試劑,在多肽激素標(biāo)記中日益廣泛采用。97免疫血清制造流程一、動(dòng)物的選擇與管理二、免疫原三、免疫程序四、血液的采集與血清提取五、幾種重要畜禽用免疫血清、卵黃抗體的制備方法六、免疫血清及卵黃抗體使用注意事項(xiàng)第六節(jié) 治療用生物制品的制造技術(shù)981、免疫血清的概念又稱高免血清、抗血清、免疫血清、被動(dòng)免疫制品。利用病原微生物或其代謝產(chǎn)物等作為免疫原，經(jīng)過反復(fù)多次注射同一動(dòng)物體，促使動(dòng)物不斷產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在血清中含有大量對(duì)應(yīng)的

39、特異性抗體而制成。分類（據(jù)免疫血清作用的對(duì)象不同）：抗病血清和抗毒素。992、作用機(jī)理含有特異性的免疫球蛋白抗體輸入動(dòng)物體后，動(dòng)物即可被動(dòng)地獲得抗體，從而形成免疫力，即所謂的人工被動(dòng)免疫。當(dāng)動(dòng)物已感染某種病原微生物發(fā)生傳染病時(shí)，注射大量抗病血清后，由于抗體的作用，可抑制動(dòng)物體內(nèi)的病原體繼續(xù)繁殖，并協(xié)助體內(nèi)正常防御機(jī)能，消滅病原微生物，使病畜逐漸恢復(fù)健康。特點(diǎn)：具有很強(qiáng)的特異性，一種血清只對(duì)相應(yīng)的一種病原微生物或毒素起作用。1003、應(yīng)用用作緊急預(yù)防注射，通常是在已經(jīng)發(fā)生傳染病或受到傳染病威脅的情況下使用。優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生免疫力快，缺點(diǎn)：持續(xù)期短（一般僅23周）。目前生產(chǎn)較多的抗病血清有：破傷風(fēng)抗毒素

40、、1014、免疫血清制造流程動(dòng)物的選擇與管理免疫原的制備免疫程序血液采集與血清提取102一、動(dòng)物的選擇與管理（一）動(dòng)物的選擇1、動(dòng)物的品種用于制備免疫血清的動(dòng)物有馬、牛、山羊、綿羊、豬、兔、犬、雞和鵝等。用同種動(dòng)物產(chǎn)生的稱同源血清，用異種動(dòng)物生產(chǎn)的稱異源血清。103（1）制備抗菌和抗毒素血清多用異種動(dòng)物，通常用馬和牛等大動(dòng)物制備。如破傷風(fēng)抗毒素多用青年馬制備，抗豬丹毒血清多用牛制備。 抗病毒血清的制備多用同種動(dòng)物。如犬瘟熱血清用犬制備，抗豬瘟血清用豬制備。（2）制備免疫血清用馬較多，也可使用多種動(dòng)物（如馬、牛、羊三種動(dòng)物）制備一種抗毒素血清。（3）選定動(dòng)物應(yīng)有一定的數(shù)量，一個(gè)批次應(yīng)用多頭動(dòng)物。

41、1042、動(dòng)物的年齡及健康情況（1）通常選擇體型較大、性情溫馴、體制強(qiáng)健的青壯年動(dòng)物為宜。馬以年齡38歲、體重350kg以上者為宜；牛以310歲、體重300400kg以上為宜；豬以50kg以上，年齡612月齡為宜；家兔體重需達(dá)2kg以上為好。（2）供制造免疫血清的動(dòng)物，必須從非疫區(qū)選購(gòu)，經(jīng)過嚴(yán)格檢疫，并經(jīng)隔離觀察，每日測(cè)溫兩次，觀察2周以上，確認(rèn)健康者方可應(yīng)用。105（二）動(dòng)物的管理1、動(dòng)物應(yīng)在隔離條件下飼養(yǎng)，杜絕高免時(shí)強(qiáng)毒及發(fā)病時(shí)散毒。2、應(yīng)詳細(xì)登記每頭動(dòng)物的來源、品種、性別、年齡、體重、特征及營(yíng)養(yǎng)狀況、體溫記錄和檢疫結(jié)果等，建立制造血清動(dòng)物的檔案，只有符合要求的動(dòng)物才能投入生產(chǎn)。3、加強(qiáng)日

42、常飼養(yǎng)管理，給適量的食鹽和含鈣的補(bǔ)充飼料。1064、在高度免疫和采血期間，每日要檢測(cè)體溫兩次，隨時(shí)觀察其健康情況。每日至少運(yùn)動(dòng)4h。動(dòng)物采血前1d禁食喂水，避免血中出現(xiàn)乳糜。5、在生產(chǎn)過程中，若發(fā)現(xiàn)健康狀況異?；蛴谢疾】梢蓵r(shí)，應(yīng)停止注射抗原和采血，并進(jìn)行隔離治療。107二、免疫原（一）免疫原的基本要求一般來說，顆粒性抗原較可溶性抗原的抗原性強(qiáng)，聚合狀態(tài)的蛋白質(zhì)較單體狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫原性強(qiáng)。相對(duì)分子質(zhì)量較小和抗原性較低的蛋白質(zhì)應(yīng)吸附于載體上，才可獲得較高的免疫原性。異物性、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、分子量大、一定的物理性狀。108（二）免疫原的制備1、抗細(xì)菌免疫血清制備基礎(chǔ)免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度免

43、疫的抗原，一般選用毒力較強(qiáng)的毒株。多價(jià)抗病血清用的抗原，要求用多血清型菌株。細(xì)菌抗原：培養(yǎng)洗菌苔離心計(jì)數(shù)稀釋為含菌100億/毫升滅活（水浴802h或加0.4%甲醛372448h）。1092、抗病毒免疫血清制備以病毒為免疫原，須通過反復(fù)凍融或超聲裂解方法，將病毒從細(xì)胞中釋放出來，并盡可能地提高病毒滴度和免疫原性。如抗豬瘟血清，基礎(chǔ)免疫的抗原，可用豬瘟兔化弱毒疫苗；高度免疫抗原，則用豬瘟血毒或臟淋毒乳劑等強(qiáng)毒。病毒抗原：離心：8000轉(zhuǎn)/min20min取上清液超速離心2萬(wàn)轉(zhuǎn)/min2h病毒沉淀下來。聚乙二醇吸附：聚乙二醇+NDV尿囊液NDV。透析袋：將病毒培養(yǎng)液放入透析袋中，用蔗糖吸收水分。11

44、03、抗毒素血清制備免疫原可用類毒素、毒素或全培養(yǎng)物（活菌加毒素），但后兩者只有在需要加強(qiáng)免疫刺激的情況下才應(yīng)用，一般多用類毒素作免疫原。111三、免疫程序基礎(chǔ)免疫高度免疫（加強(qiáng)免疫）免疫途徑：皮下或肌肉注射，如劑量較大時(shí)，采用多部位注射法。1121、基礎(chǔ)免疫：注射死苗或弱毒苗，一般23次，間隔時(shí)間12周，劑量逐漸加大。首免1頭份12周后二免5頭份12周后三免20頭份。可為高度免疫產(chǎn)生有效的回憶應(yīng)答打下基礎(chǔ)。1132、加強(qiáng)免疫：（高度免疫）：攻強(qiáng)毒（攻多次，一般35次），間隔1周?；A(chǔ)免疫后2周第一次加強(qiáng)免疫1周后第二次加強(qiáng)免疫1周后第三次加強(qiáng)免疫抗體水平升高測(cè)抗體效價(jià)符合要求采血制備血清。（

45、高免的注射次數(shù)要視血清抗體效價(jià)而定。有的只要大量注射12次強(qiáng)毒抗原，即可完成高度免疫；有的則要注射10次以上，才能產(chǎn)生高效價(jià)的免疫血清。 ）114初次及再次免疫應(yīng)答抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律115（三）制定原則1、免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫劑量大，應(yīng)采用多部位注射法，尤其在應(yīng)用佐劑抗原時(shí)更應(yīng)注意此點(diǎn)。2、免疫程序?qū)χ苽涓呙庋宸浅Ｖ匾?，掌握抗體消長(zhǎng)規(guī)律，適時(shí)免疫和采血尤為重要。不能機(jī)械地定期免疫和采血。3、如有的動(dòng)物在長(zhǎng)期免疫和采血過程中，可能在抗體達(dá)到一定水平后，反而逐漸降低，對(duì)免疫原的刺激無(wú)應(yīng)答反應(yīng)，這可能與免疫劑量、免疫間隔時(shí)間和免疫原中混雜免疫抑制物有關(guān)。此時(shí)，應(yīng)給免疫動(dòng)物

46、足夠時(shí)間休息，解除免疫抑制作用，并調(diào)整免疫程序。116四、血液采集與血清提?。ㄒ唬┎裳螖?shù)和方法1、采血時(shí)間一般血清抗體的效價(jià)高峰在最后一次免疫后的710d。按照免疫程序完成免疫的動(dòng)物，經(jīng)采血檢驗(yàn)（試血），血清效價(jià)達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，即可采血。不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。1172、采血次數(shù)采血可以全放血或部分采血，即一次采集或多次采集，采血時(shí)應(yīng)盡可能地作到無(wú)菌操作。3、采血方法放血前，動(dòng)物應(yīng)禁食24h，但需飲水以防止血脂過高。多次采血者，按體重每千克采血約10ml，經(jīng)35d第二次采血，按體重每千克采810ml。第二次采血后經(jīng)23d，注射足量免疫原。如此循環(huán)免疫和采血。全放血者，在最

47、后一次高免之后的811d進(jìn)行放血。1184、采血部位豚鼠由心臟穿刺采血；家兔可以從心臟采血或頸靜脈、頸動(dòng)脈放血，少量采血可通過耳靜脈采?。获R由頸動(dòng)脈或頸靜脈放血；羊可從頸靜脈采血或頸動(dòng)脈、頸靜脈放血；家禽可以心臟穿刺采血或頸動(dòng)脈放血。119（二）血清的分離采血時(shí)一般不加抗凝劑，全血在室溫中自然凝固，在滅菌容器中使之與空氣有較大的接觸面。待血液凝固后進(jìn)行剝離或者將凝血切成若干小塊，并使其與容器剝離。先置于37 12h，然后置于4冰箱過夜，次日離心收集血清。如果采集的血量較大時(shí)，可采用自然凝固加壓法。即將動(dòng)物血直接集于事先用滅菌生理鹽水或PBS液濕潤(rùn)的玻璃筒內(nèi)，置室溫自然凝約24h，有血清析出時(shí)，

48、每采血筒中加入滅菌的不銹鋼壓鉈，經(jīng)24h后，用虹吸法將血清吸入滅菌瓶中。120提取的血清放入滅菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞防腐。放置數(shù)日作無(wú)菌檢驗(yàn)。無(wú)菌的血清，組批分裝，保存于15半成品庫(kù)，待抽檢合格后交成品庫(kù)保存出廠。121基礎(chǔ)免疫用抗原多為疫苗或死菌，而高度免疫的抗原，一般選用毒力較強(qiáng)的毒株。五、幾種重要畜禽用免疫血清、卵黃抗體的制備方法（一）豬瘟抗血清1、動(dòng)物的選擇選用60kg左右，健康、營(yíng)養(yǎng)良好的豬；2、免疫原基礎(chǔ)免疫：豬瘟兔化弱毒疫苗高度免疫：血毒抗病毒血清的制備多用同種動(dòng)物；通常選擇體型較大、體質(zhì)強(qiáng)健的青壯年動(dòng)物。1223、免疫程序（1）基礎(chǔ)免疫注射豬瘟兔化弱毒疫苗

49、2ml（2）高度免疫基礎(chǔ)免疫后隔1421d后，用強(qiáng)毒進(jìn)行高度免疫，第一次高免，肌肉注射血毒100ml；第二次，肌肉注射血毒200ml；第三次，肌肉注射血毒300ml；每次間隔10d。4、血液采集第三次高免后911d放血，也可以多次采血。基礎(chǔ)免疫抗原無(wú)須過多過強(qiáng)免疫原注射途徑一般采用皮下或肌肉注射免疫劑量逐漸增加123（二）破傷風(fēng)抗毒素1、動(dòng)物的選擇選擇512歲營(yíng)養(yǎng)良好的馬匹；2、免疫原基礎(chǔ)免疫：破傷風(fēng)類毒素高度免疫：血毒1243、免疫程序（1）基礎(chǔ)免疫第一次，注射精制破傷風(fēng)類毒素油佐劑抗原1ml；第二次，注射2ml。125（2）高度免疫基礎(chǔ)免疫13個(gè)月后進(jìn)行第一程高度免疫，第一程高度免疫，一般

50、注射58針，14針各針之間間隔23d，58針各針之間間隔46d?？乖棵酷樳f增12ml。第5次開始試血至第8次。第一程采血后，休息1416d后進(jìn)行第二程高度免疫，第二程高度免疫，一般免疫3次，間隔57d，最后一次免疫后79d采血。1264、血液采集第一程高免最后一次免疫后67d采血，第二程高免最后一次免疫后79d采血，隔1天再次采血，檢測(cè)效價(jià)。5、血清的純化破傷風(fēng)血清，用胃酶消化，按次序加入15%、20%硫酸銨進(jìn)行沉淀，然后加入10%的明礬使明礬含量為1%，靜置使之沉淀。取沉淀后的上清加38%的硫酸銨沉淀，沉淀物經(jīng)透析即成精制破傷風(fēng)抗毒素。掌握抗體消長(zhǎng)規(guī)律，適時(shí)免疫和采血。血清效價(jià)達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)

51、時(shí)，即可采血。127（三）抗炭疽血清1、動(dòng)物的選擇選擇健壯馬匹2、免疫原基礎(chǔ)免疫：炭疽疫苗（無(wú)毒炭疽芽孢苗或號(hào)炭疽芽孢苗）高度免疫：炭疽強(qiáng)毒或炭疽疫苗1283、免疫程序（1）基礎(chǔ)免疫用炭疽疫苗（無(wú)毒炭疽芽孢苗或號(hào)炭疽芽孢苗）于第1、9、11、13日共進(jìn)行4次基礎(chǔ)免疫。（2）高度免疫用炭疽強(qiáng)毒或炭疽疫苗，于第15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37日共高免12次，劑量遞增。1294、血液采集和血清分離第45日試血，試血合格后，再按最后一次的劑量免疫一次，78d后采血分離血清，加防腐劑，密封于冷暗處，靜置12個(gè)月使之澄清，經(jīng)檢驗(yàn)合格后分裝。130（四）卵黃抗體1、定義

52、通過免疫注射產(chǎn)蛋雞，即可由其生產(chǎn)的蛋黃中提取相應(yīng)得抗體，并可用于相應(yīng)疾病的預(yù)防和治療，該類制劑稱為卵黃抗體。優(yōu)點(diǎn)：成本較低、生產(chǎn)周期較短，能用同批動(dòng)物連續(xù)生產(chǎn)。缺點(diǎn)：有潛伏野毒的危險(xiǎn)。1312、制備過程例如：IBD （雞傳染病法氏囊?。?）選擇健康無(wú)病的產(chǎn)蛋雞群，開產(chǎn)前或開產(chǎn)后，以免疫原性良好的IBD油佐劑滅活苗肌肉注射，2ml/只；（2）710d后，重復(fù)注射一次；（3）再過710d再注射一次，油苗劑量適度遞增；（4）第三次免疫后定期檢測(cè)卵黃抗體水平，待瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1：128時(shí)開始收集高免蛋，4貯存?zhèn)溆?。瓊擴(kuò)效價(jià)降到1：64時(shí)停止收蛋，可再進(jìn)行加強(qiáng)免疫。高免蛋合格時(shí)間大約持續(xù)1個(gè)月。132（5）將高免蛋用0.5%新潔爾滅溶液浸泡或清洗消毒，再用酒精棉擦拭蛋殼，打取雞卵分離蛋黃。（6）根據(jù)卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)水平