唐山師范學(xué)院綜合性

1、唐山師范學(xué)院綜合性-設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目申報(bào)表作者:日期:唐山師范學(xué)院綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目申報(bào)表申報(bào)單位名稱(chēng)：生命科學(xué)系2007年月曰實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱(chēng)唾液淀粉酶活性分析實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)V綜合性設(shè)計(jì)性所屬課程生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)學(xué)期第3學(xué)期綜合/設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)數(shù)5實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)生物化學(xué)及植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室地點(diǎn)5401每組人數(shù)4項(xiàng)目負(fù)責(zé)人李春香聯(lián)系電話經(jīng)費(fèi)預(yù)算（兀）500詳細(xì)說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)涉及哪些知識(shí)點(diǎn)1、唾液淀粉酶的制備2、環(huán)境條件對(duì)唾液淀粉酶活性的影響3、唾液淀粉酶的專(zhuān)一性4、唾液淀粉酶活性的測(cè)定參加實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)人員李春香、張淑紅、咼鳳菊實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目建設(shè)進(jìn)度安排2007年6月：申報(bào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目2007年6月2007年9月：準(zhǔn)備試驗(yàn)

2、材料及儀器，完善各項(xiàng)準(zhǔn)備工作2007年10月：首次開(kāi)設(shè)試驗(yàn)項(xiàng)目，進(jìn)行效果分析主要儀器設(shè)備分光光度計(jì)恒溫水浴鍋電爐實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及擬達(dá)到的培養(yǎng)目標(biāo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：學(xué)生自制唾液淀粉酶，分析影響唾液淀粉酶活性的環(huán)境條件，并在得出的最適條件下測(cè)定唾液淀粉酶的活性。培養(yǎng)目標(biāo)：通過(guò)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的學(xué)習(xí)，使學(xué)生從整體掌握酶學(xué)的基本知識(shí)以及測(cè)定酶活性的基本思路和方法；通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問(wèn)題的能力。系論證意見(jiàn)系主任簽名：（蓋章）年月日主管部門(mén)意見(jiàn)（蓋章）年月日綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)書(shū)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：唾液淀粉酶活性分析張淑紅編寫(xiě)適用專(zhuān)業(yè)：生物科學(xué)生物技術(shù)唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系2007年5月實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：5學(xué)

3、時(shí)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：綜合性每組人數(shù)：_5_人/組一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握酶學(xué)的基本知識(shí)，特別是唾液淀粉酶酶活性的測(cè)定方法。2、通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析問(wèn)題的能力，為今后的學(xué)習(xí)和科研工作奠定基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、影響酶促反應(yīng)的因素淀粉受唾液淀粉酶的作用水解成麥芽糖和少量葡萄糖。通常以測(cè)定淀粉水解的程度（底物減少）或麥芽糖生成的數(shù)量（產(chǎn)物增加）來(lái)衡量淀粉酶的活性。淀粉經(jīng)淀粉酶水解后得到分子大小不相同的糊精，糊精遇碘生成不同的顏色。隨著糊精分子量的降低依次為藍(lán)色、紫色、暗褐色或紅色、無(wú)色。酶的活性受溫度的雙重影響。低溫時(shí)酶活性表現(xiàn)較低，在一定范圍內(nèi)，酶活性隨溫度上升而增高。通

4、常每升高10C，反應(yīng)速度增加一倍左右；另一方面，溫度越高使酶蛋白變性越快，致使酶活性隨溫度上升而降低，以致完全喪失活性。當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值時(shí)的溫度，稱(chēng)為酶作用的最適溫度。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶對(duì)淀粉的水解作用為例，觀察0C、37C和100C三種溫度對(duì)酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)中各管除溫度外，其它反應(yīng)條件皆相同。唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成各種不同大小的糊精及麥芽糖。它們遇碘呈現(xiàn)不同的顏色反應(yīng)，故可利用碘反應(yīng)的顏色對(duì)比來(lái)判定不同溫度下酶活性的大小。酶的活性受環(huán)境pH的影響極為顯著。因pH影響酶蛋白和底物的解離狀態(tài)，從而明顯改變酶與底物的結(jié)合和催化作用。每一種酶在一定的條件下都有它發(fā)揮作用的最適pH，

5、此時(shí)酶的活性最大。當(dāng)其它條件相同時(shí)，離最適pH越近，其活性越大，即所催化的反應(yīng)速度越快。本實(shí)驗(yàn)利用唾液淀粉酶對(duì)淀粉的水解作用，在其它條件相同時(shí)，對(duì)比觀察pH變化對(duì)酶活性的影響，用碘反應(yīng)判斷結(jié)果。另外激活劑和抑制劑對(duì)酶活也具有一定的影響，能增高酶活性的物質(zhì)稱(chēng)為酶的激活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質(zhì)叫酶的抑制劑。2、酶作用的專(zhuān)一性2+麥芽糖和葡萄糖都具有還原性，能使班氏試劑中的二價(jià)銅離子（Cu）還原成一價(jià)銅離子（Cu+）生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。而蔗糖不能被水解也不具有還原性，故不能被班氏試劑還原。利用此性質(zhì)可以檢測(cè)唾液淀粉酶的專(zhuān)一性。3、酶活性的測(cè)定酶活力也稱(chēng)酶活性，是以在最適溫度、最適p

6、H等條件下，催化一定的化學(xué)反應(yīng)的初速度來(lái)表示。本實(shí)驗(yàn)是以一定量的唾液淀粉酶液在實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件下，在一定的初始時(shí)間里將淀粉還原為還原糖，然后通過(guò)與DNS試劑作用，比色測(cè)定，求得還原糖的生成量，從而計(jì)算出酶反應(yīng)的初速度，即酶的活力。這里規(guī)定，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖作為一個(gè)淀粉酶活力單位，記為1U。在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過(guò)量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測(cè)定樣品中的含糖量。三、實(shí)驗(yàn)方案（一）唾液淀粉酶

7、的制備1、每人取一個(gè)干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。2、先用蒸餾水漱口，將口腔內(nèi)的食物殘?jiān)宄蓛簟?、口含約5mL蒸餾水，做咀嚼動(dòng)作12min，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾液吐入一個(gè)干凈的小燒杯中。稀釋至100mL，備用。（二）溫度對(duì)酶活性的影響1、準(zhǔn)備好37C水浴、冰水浴及沸水浴，白瓷板中加碘液備用。2、取小試管4支，編號(hào)，各加1%淀粉溶液30滴，pH6.8緩沖液10滴。1號(hào)管做對(duì)照，2號(hào)管放37C水浴，3號(hào)管放冰水浴，4號(hào)管放沸水浴中，各預(yù)溫10min3、向1號(hào)管加蒸餾水10滴，向2、3和4號(hào)管各加稀釋唾液10滴，混勻，仍放原水浴中。4、5min后由2號(hào)管每隔一定時(shí)間（1或2min），取

8、液一滴于白瓷凹板上做碘反應(yīng)，觀察并記錄顏色變化情況，到碘反應(yīng)接近淺紅色時(shí)，取出各管，包括1號(hào)管，分別各取1滴做碘反應(yīng)，觀察對(duì)比結(jié)果。5、把4支試管均放入37E水浴中，510min后取出，向各管內(nèi)加碘液2滴，混勻，觀察結(jié)果。綜合分析所測(cè)三種溫度下的酶活性情況，并以1號(hào)管為對(duì)照說(shuō)明冰水浴及沸水浴兩溫度對(duì)酶活性影響的異同，得出唾液淀粉酶的最適反應(yīng)溫度。（三）pH對(duì)酶活性的影響1、白瓷板中加碘液備用，準(zhǔn)備好37C水浴。2、取小試管4支，編號(hào)，按下表加入試劑，混勻。AvV口呂號(hào)12341%淀粉（d）303030300.1mol/L磷酸鹽緩沖液（d）10101010(pH5.0)(pH6.8)(pH8)(

9、pH6.8)3、4號(hào)管加稀釋唾液10滴,放37E水浴中，記時(shí)，每隔1由第4號(hào)試管中取出1滴溶液做碘反應(yīng)，待碘反應(yīng)呈淺紅色或橙黃色時(shí)，取出試管，記錄保溫時(shí)間。4、13號(hào)試管放入37E水浴中，以1min間隔，并記錄時(shí)間，依次向1至3號(hào)管中加入稀釋唾液10滴，搖勻，按照4號(hào)管的保溫時(shí)間，以1min間隔，依次取出各管，并立即加碘液2滴，混勻。觀察各管呈現(xiàn)的顏色，判斷在不同pH下淀粉被水解的程度，分析pH對(duì)淀粉酶活性的影響，并確定其最適pH。（四）取4支試管，按下表編號(hào)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AvV口呂號(hào)12340.1%淀粉溶液（d）30303030稀釋的新鮮唾液（d）101010101%NaCI溶液（d）101%

10、CuS04溶液（d）一10一一1%Na2SO4溶液（d）一一10一蒸餾水（d）一一一1037C恒溫水浴中保溫10minKI12溶液（d）23232323現(xiàn)象）酶的專(zhuān)一性取試管3支，編號(hào)，按下表操作：AvV口呂號(hào)1231%淀粉（d）1010一1%蔗糖（d）一一10pH6.8緩沖液（d）101010稀釋唾液（d）5一5煮沸的唾液（d）5班氏試劑（202020各管混勻后，置37C水浴中保溫10min將上述各管放沸水浴中煮沸35分鐘，觀察結(jié)果。（六）唾液淀粉酶活性的測(cè)定1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取6支試管，按下表加入1.0mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水項(xiàng)目空白12345葡萄糖溶液（mL）00.20.30.40

11、.50.6蒸餾水（mL）32.82.72.62.52.4葡萄糖的濃度（mg/mL）01/151/102/151/63/15加熱沸水浴加熱5分鐘冷卻立即用冷水冷卻光密度（OD540）取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線2、唾液淀粉酶活性的測(cè)定1234最適pH值緩沖液（mL）11111%淀粉溶液0.3%NaCI(mL)1111唾液淀粉酶（mL）1110蒸餾水（mL）0001酶促反應(yīng)搖勻，最適溫度下水浴5minDNS試齊U(mL)2222顯色反應(yīng)沸水浴5min取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，稀釋一定倍數(shù)，搖勻，在540nm

12、波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值。測(cè)定后，取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖含量，計(jì)算酶的活性。四、主要儀器及試劑（一）試劑1、1%淀粉2、0.1mol/LpH5-8磷酸鹽緩沖液：分別配制下列二液，再按下表混合后加水稀釋一倍即可。（1）0.2mol/LNaH2PO4液：稱(chēng)取NaH2PO4-2H2O31.2g，加水準(zhǔn)確定溶至1000mL。（2）0.2mol/LNa2HPO412H2O71.64g，加水準(zhǔn)確定溶至1000mL。pH0.2moI/LNaH2PO4(mL)0.2moI/LNa2HPO4(mL)598.11.96.851.049.085.394.73、碘液：碘化鉀1g加少許水溶解后，再加碘0

13、.5g，溶后加水至100mL，混勻。用時(shí)加水稀釋10倍。4、0.1%淀粉溶液5、1%NaCI溶液6、1%CuSCh溶液7、1%Na?SO4溶液81%蔗糖9、班氏試劑：檸檬酸鈉173g和碳酸鈉100g溶于約700mL水中，另將硫酸銅17.3g溶于100mL水中。可分別加熱助溶。冷卻后將兩液混合，再加水至1000mL混勻。10、3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱(chēng)取6.5gDNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325mL,再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000mL。11、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，即含葡萄糖為1.0mg/mL。12、1%淀粉0.3%NaCl（二）儀器水浴鍋；電爐；分光光度計(jì)五、實(shí)驗(yàn)要求要求學(xué)生預(yù)習(xí)生物化學(xué)教材中酶學(xué)一章的內(nèi)容，特別是影響酶促反應(yīng)因素一節(jié)。并且查閱資料了解DNS法測(cè)定還原糖的原理。六、思考題1、比色時(shí)為什么要設(shè)計(jì)空白管？2、進(jìn)行酶學(xué)實(shí)驗(yàn)必須注意控制哪些條件？為什么？七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告是實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和匯報(bào)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫(xiě)作可以分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)和問(wèn)題，學(xué)會(huì)處理各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法，加深對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的理解和掌握，同時(shí)也是學(xué)習(xí)撰寫(xiě)科學(xué)研究論文的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式應(yīng)為：1、實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>