遺傳性疾病的分子診斷ppt課件

1、分子診斷的臨床運用上海交通大學醫(yī)學院檢驗系 樊綺詩 用分子生物學技術(shù)經(jīng)過檢測基因此到達診斷疾病的目的是生物學者在分子生物學技術(shù)開展的最初階段就有的想象。 上世紀70年代人們開場在實驗室進展研討，80年代以來，基因檢測在許多國家已成為常規(guī)檢驗工程，主要用于感染性和遺傳性疾病等的診斷。1953年Watson 和Crick 提出脫氧核糖核酸的雙螺旋構(gòu)造模型。1990年人類基因組方案正式啟動。2001年2月科學家宣布完成人類基因組的全部序列圖。 DNA重組技術(shù)(DNA recombination) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technique) 基因組學(genomics) 蛋白質(zhì)組學(pro

2、teomics) 基因治療(genotherapy) 生物芯片(biochip)等技術(shù) 已運用到醫(yī)學領(lǐng)域，對疾病機理的認識、疾病的診斷、預防和治療產(chǎn)生了深化的影響。分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診 斷，也能確定個體對疾病的易感性，判別 致病基因攜帶者并對疾病的分期、分型、 療效監(jiān)測和預后作出判別。分子診斷已成為實驗診斷學的一個重要組 成部分，成為一門新的學科。 Molecular diagnosis Molecular diagnostics 一、基因檢測在感染性疾病中的運用SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研討者Peiris等報告了50 例嚴重型急性呼吸道綜合征(seri

3、ous acute respiratory syndrome, SARS) 病人的臨床表現(xiàn)和病毒學研討結(jié)果。一種新的冠狀病毒 (Coronavirus) 是SARS的致病緣由。 (Lancet, 2003, 361: 9365)2003年4月，德國漢堡Bernhard-Nocht熱帶醫(yī) 學研討所學者Drosten等用隨機擴增技術(shù)，獲 得一段長度為300bp的核苷酸序列。根據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀病毒的逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR和實時定量PCR技術(shù)。 on April 10, 2003檢測標本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液 、 血漿、糞便。檢測方法 1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PC

4、R (Reverse-Nested PCR) 2. 逆轉(zhuǎn)錄-實時PCR (Reverse-Real time PCR)有報道顯示，在能夠SARS病人中病毒的檢出 率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。一切安康接觸者中未檢測到病毒。另一項研討顯示 檢測病毒的3種方法血清學檢測、病毒分別、PCR技術(shù)中，PCR技術(shù)的檢出率最高。討 論PCR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期。SARS患者中的陽性率約為80%， 提示(當時的)PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。對照中的陰性率約為98%100%。討 論痰液中病毒RNA濃度極高，闡明病毒從呼吸道排放

5、是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復晚期的糞便中存在病毒RNA，闡明糞便能夠也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適宜作為標本有能夠漏檢。SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必需留意的問題必需在規(guī)范的基因擴增實驗室中進展。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。陽性結(jié)果時必需對原始樣本反復檢驗： 或者擴增另一個基因片段 或在另一個實驗室對同一樣本進展檢測。HPV基因的檢測 在預防宮頸癌中的作用 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬左右新發(fā)病例。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬

6、，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。 繼續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要要素，93.0%-99.7%的宮頸癌組織中均可檢測到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的 50%和14%。高危型HPV的繼續(xù)感染可使患 宮頸癌的風險添加250倍。 HPV DNA的檢測方法實時定量PCR (Real time PCR) 核酸擴增技術(shù)核酸雜交捕獲Hybrid Capture，HC核酸雜交+信號放大技術(shù)HC 可一次檢測一切致癌的13種高危型HPV。敏感度：對CIN 、和癌的檢出率為 98%。陰性預期值：對高度鱗狀上

7、皮細胞病變或更高度 病變的陰性預期值99.9%細胞學檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細胞時，HPV基因的檢測能預測受檢者患宮頸癌的風險。細胞學檢查+HPV基因的檢測是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的最正確方法，成為預防宮頸癌的關(guān)鍵?；驒z測在監(jiān)測移植物排斥中的作用 關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見的3種病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年初次從腎臟移植受體的尿液中分別出。病毒主要在宿主的細胞核內(nèi)進展復制。在美國，10歲以上的正常人群中60%80%有BK病毒感染史。感染的病毒多埋伏于腎小管上皮細胞和尿道上皮細胞中。BK病毒的重新激活大部分是由于免疫機制缺陷或大量運用免疫抑制劑后。 腎臟移植術(shù)后大

8、量運用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復制。BK病毒復制進一步開展，成為BK病毒感染的腎間質(zhì)性腎病BKVAN。BKVAN患者中60%70%會發(fā)生遠期的腎臟移植失敗。BK病毒感染曾經(jīng)成為腎臟移植遠期失敗的重要緣由之一。BK病毒感染越來越遭到關(guān)注。早期無臨床病癥，后期病癥與腎移植排斥和藥物毒性反響類似，易引起漏診和誤診。BK病毒感染和移植排斥治療原那么相反：BK病毒感染需求降低免疫抑制劑量，而移植排斥那么應(yīng)加大用量。因此，建立有效的BK病毒檢測和監(jiān)測體系是非常必要的。decoy細胞BK病毒感染的腎臟小管上皮細胞零落至尿液。形狀學檢測敏感性較好，但特異性差。細胞形狀在尿液中很容易破壞。BK病毒感

9、染的檢測BK病毒復制的檢測血、尿中BK病毒核酸定量檢測尿液中decoy細胞檢查尿沉渣涂片原位雜交組織病理學檢查判別腎臟間質(zhì)性腎病腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研討對象瑞金醫(yī)院腎臟移植術(shù)后2個月3年的患者95例正常人標本60例研討方法尿沉渣細胞形狀學檢測血、尿中BK 病毒DNA的定量檢測結(jié) 果 95例患者的尿沉渣形狀學檢查，35例患者的尿沉渣中出現(xiàn)可疑的病毒感染腎小管上皮細胞decoy細胞。尿液中BK病毒核酸定量檢測14例尿液中檢測到BKV DNA，病毒載量為41032109拷貝/ml，平均為5.6105拷貝/ml。發(fā)生病毒尿的中位時間為移植術(shù)后14個月。3例患者在臨床上出現(xiàn)不明緣由的發(fā)熱、白細

10、胞降低、緩慢的肌酐升高等病癥，有1例甚至出現(xiàn)了尿道阻塞。臨床上以為發(fā)生BKVAN的能夠性較大，給予抗病毒治療。病例1、2治療前：尿液和血漿病毒核酸載量在104/ml105/ml血肌酐分別為181mol/L和168mol/L治療后：血漿和尿液中BK病毒已檢測不出血肌酐降為160mol/L和129mol/L病例3治療前尿液中BK病毒核酸載量為2109拷貝/ml尿沉渣細胞中見到大量decoy細胞和炎性細胞治療后尿液中BK病毒核酸載量降至105拷貝/ml尿沉渣細胞中decoy細胞明顯減少討 論文獻報道BK病毒的復制感染率為5%60%，本研討中發(fā)生BK病毒復制的占14.7%。35例患者中發(fā)現(xiàn)decoy細

11、胞，僅14例被證明存在病毒核酸，提示形狀學檢查特異性差。腎臟移植的患者容易導致包括BK病毒在內(nèi)的多種病毒感染。因此能否存在BK病毒感染，形狀學僅作為篩查實驗。病毒核酸定量可有效地動態(tài)察看病毒核酸的復制。BK病毒核酸定量檢測用于檢測BK病毒能否復制為能否需求進展病理學檢查提供根據(jù)監(jiān)測疾病和評價治療效果預防間質(zhì)性腎病，防止移植遠期失敗二、遺傳性疾病的分子診斷 分子診斷可以檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個體，可以在胎兒出生前判別其能否為患者，因此分子診斷是降低單基因遺傳病發(fā)病率的根本措施。單基因遺傳病是由于某一基因構(gòu)造的變化或基因表達異常而導致的疾病用分子生物學技術(shù)檢測致病基因的遺傳缺陷是診斷這類

12、疾病最根本的手段。遺傳性疾病中常見的分子異常致病基因異常而導致所載有的遺傳信息遭到改動，而疾病的發(fā)生那么是經(jīng)過遺傳物質(zhì)的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)或酶等的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕c突變、片段性突變和動態(tài)性突變。點突變 (point mutation)包括錯義突變、無義突變、移碼突變。各種點突變所呵斥的后果： 蛋白質(zhì)分子量改動 蛋白質(zhì)合成量下降 無蛋白質(zhì)合成片段性突變(fragememtal mutation)核苷酸的喪失和增多缺失：基因中鹼基遺傳物質(zhì)的喪失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生反復基因重排：基因組中原來不在一同的基來由于某些緣由組合陳列在一同動態(tài)性突變(dy

13、namic mutation)以三核苷酸為單位的反復序列在傳送過程中 不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的反復次數(shù)往 往較親代大為添加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG反復 少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA反復 Huntington?。篊AG反復 遺傳性疾病基因診斷的戰(zhàn)略一直接診斷戰(zhàn)略 基因診斷的直接戰(zhàn)略是經(jīng)過各種分子生物學技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和構(gòu)造必需被闡明。 直接診斷由于是直接提示遺傳缺陷，因此比較可靠。 DMD的基因檢測 Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一種 高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性 疾病，在3

14、500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者。 DMD基因的全長為250kb，有79個外顯子。 DMD 的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占 60%70%。二間接診斷戰(zhàn)略 間接診斷的本質(zhì)是在家系中進展連鎖分析，經(jīng)過分析，可確定被檢個體來自雙親的同源染色體中的哪一條與疾病連鎖致病染色體，從而判別該個體能否帶有致病基因。 間接診斷不是尋覓DNA的遺傳缺陷，而是經(jīng)過分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性估計被檢者患病的能夠性。間接診斷：分析DNA的遺傳標志的多態(tài)性 真核生物染色體DNA中存在許多不同程度的反復序列，根據(jù)DNA序列出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型。單拷貝序列 在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%-80

15、%)在單倍體中都為單拷貝。中度反復序列 反復次數(shù)為數(shù)十至數(shù)萬(105)次，長度多在 300-7000bp，多為不編碼序列，與單拷貝基因間隔陳列。如Alu家族、Kpn I家族、rRNA等。高度反復序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)反復頻率可高達106 以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標志志已廣泛用于基因定位和基因診斷雙等位基因(bi-allele多態(tài)性：限制性片段長度多態(tài)性restriction fragment length polymorphism, RFLP第一代DNA遺傳標志，所含信息量有限。 檢測技術(shù)：Southern印跡技術(shù)多等位基因多態(tài)性(multi-alle

16、le)小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)反復可變數(shù)目variable number tandem repeats，VNTR第二代DNA遺傳標志，屬高度反復序列以 670bp 為單位，以串聯(lián)方式陳列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)反復序列等位基因經(jīng)常達10個以上，信息量比 RFLP大 檢測技術(shù)：PCR 微衛(wèi)星序列 (microsatellite)以 26bp 為單位(如CA repeat)，又稱短串聯(lián)反復序列(STR) 。在基因組中分布廣泛，反復次數(shù)可達幾十次，具高度多態(tài)性。 檢測技術(shù)：PCR單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly- morphism，SNP)第三代DNA的遺傳標志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為

17、單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，是一種信息量非常大的標志系統(tǒng)。 檢測技術(shù)：DNA芯片技術(shù)凝血因子(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失缺失 169 種插入 28 種點突變347 種第22號內(nèi)含子倒位:40%-50%重型HA 間接診斷的不確定性遺傳標志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不完好三、基因檢測在多基因病中的運用 多基因病具一定的遺傳要素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，遺傳要素在其中所起作用程度各異。 多基因病中的遺傳要素是假設(shè)干個易感基因微小作用的累加，某一易感基因構(gòu)造的變化缺乏以導致疾病的產(chǎn)生。 人類基因組多態(tài)性是

18、多基因病基因診斷的根底，易感基因多態(tài)性的檢測能協(xié)助我們了解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。高血壓候選基因多態(tài)性分析在EH中的運用前景 臨床分型 靶器官損傷研討 個體化治療基因多態(tài)性與鹽敏感性高血壓 -內(nèi)收素 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶上皮鈉通道血管緊張素原心鈉素 2腎上腺素能受體 SA G蛋白亞單位3基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中 載脂蛋白E -纖維蛋白原 血管緊張素原 血管緊張素II的1型受體 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 心鈉素冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 載脂蛋白B基因多態(tài)性檢測與個體化治療 有朝一日，臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基因的多態(tài)性設(shè)計有效的、個體化的治療方案，以到達最正確治療效果。ATG基因多態(tài)性研討目的：察看ATG基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的 血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對象：1509例基因分析：ATG基因G-A多態(tài)性結(jié)果：三年后高血壓發(fā)生率%