04第四章植物組織培養(yǎng)技術(二)ppt課件

1、第三節(jié) 植物離體繁衍 植物離體繁衍propagation in vitro又稱植物快繁或微繁，是指利用植物組織培育技術對外植體進展離體培育，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。一、概念和特點一概念2I概述 1、繁衍效率高。2、培育條件可控性強。3、占用空間小。4、管理方便，利于自動化控制。5、便于種質(zhì)保管和交換。二特點3二、植物快繁器官構成方式再分化構成植株的方式 根據(jù)器官構成方式的不同，將植物器官的再生分為五種類型，即短枝發(fā)生型不定芽型、叢生芽發(fā)生型器官型、器官發(fā)生性、胚狀體發(fā)生型和原球莖發(fā)生型。 一短枝發(fā)生型不定芽型 短枝發(fā)生型是指外植體攜帶的帶葉莖段，在適宜的培育環(huán)境中萌生，構

2、成完好植株，再將其剪成帶葉莖段，繼代再成苗的繁衍方法。5特點：繁衍率高，利用外植體的芽特別是原遭到抑制的腋芽和大量構成不定芽。能堅持該種植物遺傳穩(wěn)定性。可使繁衍周期長的林木縮短其童年期二叢生芽發(fā)生型(器官型) 叢生芽發(fā)生型是指使外植體攜帶的頂芽或腋芽在適宜培育環(huán)境中不斷發(fā)生腋芽而呈叢生狀芽，或者直接從外植體上長出多個從芽，將單個芽轉入生根培育基中，誘導生根成苗的繁衍方法。 叢生芽發(fā)生型是大多數(shù)植物快繁的主要途徑，它不經(jīng)過愈傷組織，能使無性系后代堅持原種類的特性，在消費中普遍運用。67特點：繁衍率非常高，但繁衍速度較慢。遺傳性穩(wěn)定。三器官發(fā)生型已講過 是指外植體在適宜培育基和培育條件下，經(jīng)過脫分

3、化構成愈傷組織，然后經(jīng)過再分化誘導愈傷組織產(chǎn)生不定芽，或外植體不構成愈傷組織而直接從其外表構成不定芽，將芽苗轉移到生根培育基中，經(jīng)培育獲得完好植株的繁衍方法。繁衍速度較快。遺傳性不穩(wěn)定，已產(chǎn)生變異。愈傷組織是遺傳轉化、細胞培育或原生質(zhì)體培育的良好資料器官發(fā)生型也是許多植物快繁的主要方式。由于不定芽構成的數(shù)量與腋芽數(shù)目無關，其增殖率高于叢生芽發(fā)生型。但經(jīng)過愈傷組織途徑或者多次繼代培育后，容易導致細胞分裂不正常，添加變異植株發(fā)生頻率。如香蕉繼代次數(shù)控制在8代之內(nèi)，再生植株的變異率那么可控制在3%左右。9表現(xiàn)嵌合性狀的植株經(jīng)過此方式再生時，往往導致嵌合性狀發(fā)生分別而失去原有價值。如欣賞植物顏色鑲嵌的

4、葉子、帶金邊或者銀邊等性狀的植物，經(jīng)過器官發(fā)生性途徑再生植株時，能夠?qū)е逻@些欣賞性狀消逝。這類植株快繁時，應經(jīng)過叢生芽途徑進展。10ABEC花燭葉片離體培育及植株再生11四胚狀體發(fā)生型 胚狀體發(fā)生型是指外植體在適宜培育環(huán)境中，經(jīng)誘導產(chǎn)生體細胞胚的繁衍方法 ，從而構成小植株的繁衍方法。 分為間接途徑經(jīng)愈傷途徑和直接途徑兩種。 胚狀體發(fā)生途徑具有成苗數(shù)量大、速度快、構造完好的特點，因此是外植體增殖系數(shù)最大的途徑。12胚狀體發(fā)生型特點：胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、構造完好、繁衍系數(shù)高。遺傳性穩(wěn)定13菊花花瓣體細胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過程的掃描電鏡察看14五原球莖發(fā)生型 原球莖發(fā)生型是蘭科植物的一種快繁方

5、式，它是指莖尖或腋芽外植體經(jīng)培育產(chǎn)生原球莖即扁球狀體、基部生假根的繁衍類型。15原球莖是蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形狀學構造。種子萌生初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，腫脹的胚呈小圓錐狀，故稱為原球莖。原球莖是短縮的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官，它可以增殖，構成原球莖叢。由莖尖或腋芽外植體誘導產(chǎn)生原球莖，切割原球莖進展增殖，或停頓切割使其繼續(xù)培育而轉綠，產(chǎn)生毛狀假根，葉原基發(fā)育成幼葉，將其轉移培育生根，構成完好植株。1617植物快繁的程序包括四個階段：無菌或初代培育的建立繁衍體增殖芽苗生根小植株的移栽馴化II植物快繁程序18一、無菌培育的建立 這個階段的義務

6、是母株和外植體的選取、無菌培育物的獲得及外植體的啟動生長，以利于離體資料在適宜培育環(huán)境中以某種器官發(fā)生類型進展增殖。1921二、增殖培育1.培育資料的增殖方式 五種方式。(取決于培育目的和資料本身的能夠性。) 普通大多數(shù)植物采用無菌短枝或腋芽萌生或誘導不定芽產(chǎn)生，再以芽繁衍芽的方式進展增殖；蘭科植物、百合等那么采用原球莖增殖途徑，以保證繁衍資料的遺傳穩(wěn)定性。222.增殖培育基 增殖率是植株快速繁衍特別是商業(yè)性繁衍的重要目的。外植體在每次繼代培育中，應能產(chǎn)生最大數(shù)量的有效繁衍體。 根本培育基普通與啟動生長培育基一樣，而細胞分裂素和礦物元素的濃度程度那么高于啟動生長培育基。普通MS+BA 13 m

7、g/ml+NAA0.11 mg/ml。233.增殖體的大小和切割方法 普通攜帶一個莖節(jié)，但第一次增殖的莖段普通都有24個莖節(jié)。 莖段可以垂直插入培育基中，但插入的深度不應淹沒莖節(jié)；或程度放入培育基外表，以刺激側芽的萌動。24青花菜增殖枇杷增殖2627三、芽苗生根 將單個芽苗轉移到生根培育基或適宜環(huán)境中誘導生根。1.離體生根試管內(nèi)生根 降低無機鹽濃度1/2MS或者1/4MS，減少或不需求細胞分裂素，添加生長素的濃度。 對有些植物，假設芽苗在含有生長素的培育基中生長12d，再轉移至無生長素的培育基中，或芽苗在含生長素的生根溶液中浸蘸后直接插入無生長素的培育基中，濕度85%以上，溫度25，弱光或黑暗

8、條件。28292.活體生根試管外生根 芽苗先在生長素中快速浸蘸或在含有相對高濃度生長素的培育基中培育510天，然后在溫室中栽入培育基質(zhì)，經(jīng)常噴霧，給予高濕度環(huán)境，幾天后便可自行生根。 30四、移栽馴化 試管小植株的移栽馴化是試管苗從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉變，有一個逐漸順應過程。移栽前需對試管植株進展高光強煉苗，使植株生長粗壯，并翻開瓶口，降低濕度，使其逐漸順應外界環(huán)境。 1.移栽 2.馴化管理31.移栽 首先應洗去小植株根部附著的培育基，防止微生物的繁衍污染，呵斥小苗死亡。然后將小植株栽入人工配制的混合培育基質(zhì)中，基質(zhì)用保濕又透氣的資料，如蛭石、珍珠巖、粗沙、泥炭等按比例混合，以利小植株生長。幾天后小

9、植株可構成新的功能根系。322.馴化管理移栽的試管小植株和活體生根的小植株，其濕度的控制非常重要。因試管苗在高濕90100的相對濕度環(huán)境中生長，莖葉外表防止水分散失的角質(zhì)層等幾乎全無，根系又不興隆，移栽后難以保證水分平衡，即使根系周圍有足夠的水分也不行。所以，應采用加覆塑料薄膜、經(jīng)常噴霧的方法，提高小植株周圍的空氣濕度，減少葉面蒸騰。同時，逐漸降低空氣相對濕度，使其順應自然環(huán)境條件。33移栽小植株還應留意光、溫控制。移栽初期光照強度應較弱，經(jīng)過一段時間順應后，添加光照強度漫射，如1 5004 000 lx，甚至10000 lx。移栽小植株生長所需的適宜溫度與植物種類有關，喜溫性植物以25左右為

10、宜，喜涼性植物那么以1820為好。溫度過高導致蒸騰作用加強，水分失衡，微生物繁殖等；溫度過低那么使幼苗生長緩慢或不易存活。如使基質(zhì)溫度高于空氣溫度23，那么有利于生根和促進根系發(fā)育，提高存活率。34此外，在移栽小植株的馴化管理階段，還應防止菌類繁殖，適當噴一定濃度的殺菌劑殺菌靈可有效維護移栽小植株的正常生長。3536III 影響植物快繁的要素37植物快繁的目的是以盡能夠高的效率消費試管苗，獲得最大的經(jīng)濟效益。因此，在快繁時應使各種影響要素處于最適宜快繁的形狀。一、外植體38外植體的來源：最適的為莖尖、帶芽莖段，也可以利用葉片、子葉、根段、花器官組織等。外植體生理年齡：幼嫩組織分化才干更強。外植

11、體大?。翰荒芴?，否那么影響成活率。除非是用于脫毒苗的消費。二、培育基39根本培育基：MS培育基運用最為廣泛。對于某些植物及生根階段，以1/4或1/2MS較好。蔗糖和葡萄糖濃度為2-4%。生根時稍低。植物生長調(diào)理劑：主要以細胞分裂素和生長素的配合運用，調(diào)理外植體的生長和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。培育基的物理特性：以固體培育較為普遍，也有采用液體培育，如蘭花原球莖的增殖。三、培育條件40光照：1000-3000lx，后期可加強。14-16h/d。溫度：與植物的原產(chǎn)地相應。普通為252。有時可進展高溫或低溫的預處置。濕度：要求環(huán)境相對濕度不能太低，普通在70-80%。氣體：

12、要求培育基及培育瓶通氣良好，同時及時轉接。液體培育要求振蕩培育，促進氧氣交換。四、繼代培育主要指對階段增殖構成的芽叢、胚狀體或原球莖等進展轉接繼代。繼代間隔時間普通為20天左右。41五、移栽根系構造不完善的試管苗移栽后不易存活。要求根系構造完好，具根毛，再生根的吸收才干強。葉表皮組織不興隆的試管苗也不易移栽存活。移栽要求翻開瓶口馴化2-3天；或在瓶內(nèi)添加一些生長延緩劑如PP333、CCC等培育壯苗。42IV植物快繁的商業(yè)化運用 植物快繁最重要的用途是進展植物的商業(yè)化消費。世界上快繁商業(yè)化開場于上個世紀美國的蘭花工業(yè)。我國的香蕉快繁苗占全國組培苗的2/3。其次有甘蔗、蘭花、馬鈴薯、甘薯等。43園

13、藝植物種苗工廠化消費44 一、商業(yè)化消費規(guī)模及工藝流程1.試管苗消費規(guī)模確實定 商業(yè)化消費規(guī)模確實定應以市場需求為規(guī)范。 試管苗消費規(guī)模確實定是以無菌任務臺和培育架的數(shù)量來衡量的。年產(chǎn)100萬株，接種室4050m2，超凈任務臺810臺，培育室100-120m2 。452.商業(yè)化實驗室的設計 根據(jù)已確定的消費規(guī)模和組織培育的消費程序，試管苗消費的實驗室應盡量規(guī)劃合理，使消費程序能延續(xù)、有效地進展。461環(huán)境要求遠離污染源 2水電、交通 3工藝流程 4節(jié)能5無菌3.商業(yè)化消費的配套設備 相應配套設備包括過渡培育室和露地煉苗場。474.商業(yè)化消費的工藝流程 試管苗商業(yè)化消費的工藝流程是以其快繁程序為

14、根底建立起來的，如最成熟的草莓脫毒苗消費流程和葡萄試管快繁流程。經(jīng)過莖尖脫毒建立起來的草莓商業(yè)化試管苗消費，除必需配備的培育和馴化等條件外，還應添加病毒鑒定室。48二、商業(yè)化消費及效益分析1.試管苗增殖率的估算 試管苗的增殖率多數(shù)以芽或苗為單位，但原球莖或胚狀體多以瓶為單位。1增殖率的實際值是指接種一個芽或一塊增殖培育物，經(jīng)過一段時間培育后得到的芽或苗數(shù)。49Y=mXn Y年繁衍數(shù)，m無菌母株苗數(shù)，X每個培育周期增殖的倍數(shù)，n全年可增殖的周期數(shù) 2增殖率的實踐值是指接種一個芽或一個苗，經(jīng)過實踐繁衍周期，得到的實踐芽或苗數(shù)。 實踐增殖數(shù)與實際增殖數(shù)出現(xiàn)很大差別的緣由是：污染淘汰；出賣、轉讓和實驗

15、所用；移栽死亡；培育容器等設備的限制。2.消費方案的制定和實施1消費方案的制定 商業(yè)化消費方案制定的根據(jù)是市場對試管苗的種類、種類及數(shù)量的需求及趨勢，實驗室具備的消費條件和規(guī)模。首先應提出全年銷售目的，再根據(jù)實踐消費中各個環(huán)節(jié)的耗費，制定出相應的全年消費方案，普通消費數(shù)量應比如案銷售的數(shù)量添加2030。 502消費方案的實施 消費方案實施的步驟為：預備繁衍資料。合格繁衍資料的快速增殖。 存瓶增殖總瓶數(shù)月方案消費苗數(shù)每個增殖瓶月可產(chǎn)苗數(shù) 月方案消費苗數(shù)每個操作人員每天可接苗數(shù)月任務日人員數(shù) 控制試管苗消費中的增殖總瓶數(shù)，便于在一個周期內(nèi)全部更新一次培育基，使增殖資料處于不同生長階段的最正確形狀，

16、提高其質(zhì)量。51 3.產(chǎn)質(zhì)量量監(jiān)控52 如接種情況、污染率、生長情況、生根苗數(shù)量、出瓶苗質(zhì)量等，并建立試管苗出瓶規(guī)范。4.商業(yè)化消費效益分析 經(jīng)過本錢核算可以了解：消費過程中的各種耗費；管理任務的質(zhì)量；各項技術措施的效果；產(chǎn)品價錢的制定規(guī)范。53 試管苗商業(yè)化的消費本錢應包括：人工費用。消費物資費用。設備折舊費用。水電費用。其他費用。54三、降低商業(yè)化消費本錢的措施 針對試管苗消費所需的費用，應采取相應措施降低消費本錢，加強產(chǎn)品競爭力，提高試管苗經(jīng)濟效益。 1.提高勞動消費率 2.減少設備投資，延伸運用壽命 3.降低耗費 4.降低污染，提高繁衍率和成活率 5.簡化培育基55四、離體快繁商業(yè)性消

17、費的范圍及運用1用于稀缺或急需良種植物的繁衍2用于莖尖脫毒及無病毒苗木試管快速繁衍3用于自然界無法用種子繁衍或難以堅持后代一致的三倍體、單倍體及基因工程植株的快速繁衍4瀕臨植物的挽救5用于種質(zhì)的試管保管及交換56蘭科植物消費57無菌苗快速繁衍58無菌苗馴化596061五、商業(yè)化消費應留意的問題一污染 1.污染概念：在組培過程中培育基和培育資料繁殖雜菌，導致培育失敗的景象。2.污染緣由：細菌、真菌為病源菌；污染途徑有外植體帶菌，培育基及器皿滅菌不徹底，操作人員未遵守操作規(guī)程，環(huán)境不清潔。1真菌污染的特點：污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種后310天才干發(fā)現(xiàn)。真菌菌落大，顏色多樣，外表呈毛絨狀，嗅

18、之普通有霉味，真菌會產(chǎn)生菌絲 緣由：周圍環(huán)境不清潔 超凈任務臺的過濾安裝失效 培育用器皿的口徑過大等 為了減少損失，提高任務效率，必需在每個操作環(huán)節(jié)留意防止污染的發(fā)生。 3.污染特點2細菌污染的特點：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。 細菌菌落小，外表呈乳脂狀光澤，嗅之普通有酸臭味， 細菌污染沒有菌絲緣由：資料帶菌 培育基滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程 因此接種人員的手應經(jīng)常用70%灑精擦凈，鑷子和接種針在運用前必需在火焰上燒紅。4.預防措施1防止資料帶菌：防止陰雨天在室外采集外植體；資料預培育。2嚴厲外植體滅菌3接種器具滅菌徹底4嚴守無菌操作規(guī)程5堅持培育室清潔6做好超凈任務臺

19、檢修、養(yǎng)護防止資料帶菌的措施1用莖尖作外植體時，可在室內(nèi)或無菌條件下對枝條先進展預培育。 枝條 水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水抽枝，以這種新抽的嫩枝條作為外植體接種。這樣便可大大減少資料的污染。 在無菌條件下對采自田間的枝條進展暗培育，待抽出徒長的黃化枝條時采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明顯減少污染。 2多次滅菌法： 如咖啡成熟葉片的滅菌即用這種方法。首先除去主脈因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在，同時去掉葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；其次，將切好的外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶液中商品漂白粉25%的溶液，滅菌30min；第三，在無菌蒸餾水中沖洗3次；第四，將資料封鎖在無菌的培育

20、皿中過夜，堅持一定溫度；第五，次日將葉片用2.6%次氯酸鈉滅菌30min，然后，用蒸餾水洗3次。對層積過的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都要滅菌，在層積貯藏的第一周還應添加1次滅菌處置。3多種藥液交替浸泡法對容易污染而難滅菌的資料： 1. 取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，外表不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片； 2. 將資料放入70%75%醫(yī)用灑精中滅菌數(shù)秒鐘； 3.1：500Roccal B一種商品滅菌劑名稀釋液中浸5min 4. 放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫80數(shù)滴，滅菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并參與“

21、吐溫80數(shù)滴，滅菌510min； 5. 用無菌水沖洗5次。也可以在從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的0.1mol鹽酸HCl中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 5.組培苗污染的處置1發(fā)現(xiàn)污染的資料應及時處置，否那么將導致培育室環(huán)境污染。 2對一些特別珍貴的資料，可以取出再次進展更為嚴厲的滅菌，然后接入新穎的培育基中重新培育。 3要處置的污染培育瓶最好在翻開瓶蓋前，先集中進展高壓滅菌，再去除污染物，然后洗凈備用后的處置 二褐變1.褐變的概念 是指外植體在培育過程，本身組織從外表向培育基釋放出褐色物質(zhì)，以致培育基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的景象。2.褐變緣由 木質(zhì)素 醌 積累呵斥毒害。

22、多酚氧化酶O3.影響褐變的要素 1植物種類基因型木草 2生理形狀資料年齡：幼齡期成年型 資料大?。盒≠Y料 大資料組織：細嫩組織老熟組織 3培育基成分無機鹽濃度過高、CTK程度過高 外植體在最適宜的脫分化條件下， 細胞大量增殖，抑制褐變。液體培育不容易褐變。PH高容易褐變。4培育條件 光照過強，溫度過高，培育時間過長，加速褐變。 5資料轉移時間 長短 4.褐變的防止措施1選擇適宜的外植體2選擇適宜的培育條件3外植體預處置復原劑浸泡4加快繼代轉接的速度5加抗氧化劑VC、PVP、牛血清、牛蛋白 60.10.5%活性炭三玻璃化1.概念 玻璃化是試管苗的一種生理失調(diào)癥，在植物資料進展離體培育時，有些培育

23、物的嫩莖或葉片呈現(xiàn)半透明或水漬狀的景象。 形狀：植株矮小，節(jié)間短，葉水漬狀、半透明、脆易碎。2.緣由：1激素濃度尤其CTK添加或CTKIAA高2瓊脂濃度低 3光照時間大于15h4溫度低，濕度大5通風條件不好6培育基離子種類及比例不適宜3.預防措施：1適當控制培育基中無機鹽成分，適當提高蔗糖和瓊脂濃度，減少含氮化合物的用量，降低培育基的水勢。 2適當降低CTK和GA的濃度。思索參與適當?shù)牧懵渌帷?添加自然光照，控制光照時間；添加容器通氣，控制溫度。4參與其他物質(zhì)如活性炭、多效唑、間苯三本分、根皮苷。四組培其它常見問題1.資料死亡2.黃化3.變異和畸形4.增殖率低下或過盛5.組培苗瘦弱或徒長6.不生根或生根率低7.過渡苗死亡率高1.資料死亡緣由與預防外植體滅菌過度滅菌濃度和時間適宜污染注意環(huán)境和個人衛(wèi)生，嚴格操作培養(yǎng)基不適宜或配制有問題選用合適培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境惡化改善培養(yǎng)環(huán)境，及時轉移和分瓶；加強組培苗的過渡管理2.黃化1緣由：培育基中Fe含量缺乏；礦物營養(yǎng)不平衡；培育環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)乙烯量高；激素配比不當；光照缺乏；糖用量缺乏，長期不轉移；培育溫度不適2預防：針對黃化緣由對癥下藥3.變異和畸形1緣由：激素濃度和選用的種類不當；環(huán)境惡化和不適。2預防：降低CTK濃度，